混菌固態發酵花生粕的工藝優化

姜曉陽,2,胡迎芬,*,鄭靖義,王劉昱,李夢杰,孫榕梓,張 鋒

(1.青島大學生命科學學院,山東青島 266071;2.青島大學醫學院,山東青島 266071)

我國是花生生產大國,每年近一半以上的花生用于榨油,故每年能產生上百萬噸的花生粕[1-2]?；ㄉ珊胸S富的蛋白質、糖類、膳食纖維和礦物質等營養物質[3-4],但是由于花生粕是在高溫高壓的條件下產生的,其中的蛋白質和多糖易產生美拉德反應,其營養價值與功能特性受到不同程度的影響[5-7],大大降低了其利用率。根據國家統計局公布的數據顯示,我國每年花生粕大多作為飼料,花生粕利用的附加值低,資源浪費嚴重[8-9]。因此研究花生粕資源的高值化利用具有重要意義。

目前國內外采用微生物發酵的方式來提高原料的利用率和質量,人們對微生物發酵技術的關注度日益提高[10-11],微生物發酵不僅可以改變發酵物的風味和質地,并且可以增加生物活性物質[12]。對于發酵方式而言,固態發酵的方式已從單菌發酵向混合菌發酵的方向發展[13]。混菌發酵過程中,不同微生物間具有互補性和協同性,使酶促反應更加全面,并且能同時得到多種生物活性物質[14]。納豆芽孢桿菌具有多種功能性活性物質,其中的納豆激酶具有降血栓,預防和治療心腦血管疾病和降血脂等功能[15-17];紅曲具有活血祛瘀、化濁降脂等功能,含有的γ-氨基丁酸具有明顯的降血壓的作用,并且是大腦的一種化學傳遞物質,可以調節大腦興奮與抑制等作用[18-20]。但是目前利用納豆芽孢桿菌和紅曲霉混菌發酵的研究鮮有報道。

本研究以花生粕為原料,利用納豆芽孢桿菌和紅曲霉進行固態混菌發酵,以發酵物中納豆激酶(NK)的活力和γ-氨基丁酸的(GABA)含量為指標,探究發酵溫度、發酵時間、料水比、菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉)及接種量對發酵效果的影響,以確定最佳的發酵工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆芽孢桿菌 分離于日本高野納豆,由青島大學食品工程實驗室保存;紅曲霉 來自于青島大學食品工程實驗室保存的菌種;花生粕 由青島嘉里植物油廠提供;干酪素、γ-氨基丁酸、氫氧化鈉、硫酸銅、次氯酸鈉、無水碳酸鈉等試劑均為國產分析純。

721G可見分光光度計 上海精密儀器有限公司;YXQ-LS-50SII滅菌鍋 上海博迅實驗有限公司;CR21GⅢ高速冷凍離心機 日本Hitachi有限公司;CHA-S恒溫振蕩器 常州國宇儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配制 納豆芽孢桿菌液體培養基:蛋白胨1.0%,牛肉膏0.5%,氯化鈉0.3%,葡萄糖1.0%,酵母膏0.5%;紅曲霉液體培養基:牛肉膏3.0%,蛋白胨0.8%,硝酸鈉0.8%,葡萄糖3.0%,硫酸鎂0.1%,丙三醇7.0%;固態發酵培養基:花生粕(濕重)10 g,蔗糖0.15 g,硫酸鎂0.021 g,磷酸氫二鉀0.1 g,氯化鈣0.027 g,水根據試驗設計要求添加,121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2.2 種子液的制備 納豆芽孢桿菌經斜面活化后刮入1～2環接入液體培養基中,37 ℃、160 r/min 的條件下振蕩培養18 h作為發酵種子液,備用;紅曲霉菌經過斜面活化后,加入5 mL蒸餾水,用無菌刮子將孢子輕輕掛下,按2%的比例接入裝有50 mL培養基中于30 ℃,150 r/min搖床培養4～5 d,制成發酵種子液,備用。

1.2.3 工藝流程 花生粕固體培養基經高壓滅菌后,冷卻至室溫。在無菌條件下,將納豆芽孢桿菌種子液和紅曲霉種子液按一定比例混合噴灑于培養基中攪拌均勻,紗布封口,發酵后,加入一定量的水,4 ℃浸提2 h,4000 r/min離心15 min,取上清液備用。

1.2.4 單因素實驗 固定發酵條件:自然pH下,發酵溫度為34 ℃,發酵時間為70 h,料水比(W/V)1∶0.5 g/mL,菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉)為1∶1,接種量為花生粕(濕重)的8%;依次改變發酵溫度、發酵時間、料水比、菌種比例和接種量,考察各單因素對納豆激酶活力與γ-氨基丁酸含量的影響。各因素研究的水平設置分別為:發酵溫度:28、31、34、37、40 ℃;發酵時間:34、46、58、70、82、94 h;料水比:1∶0.2、1∶0.3、1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6 g/mL;菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉):1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1;接種量:2%、4%、6%、8%、10%。

1.2.5 正交試驗設計 根據單因素實驗結果,選擇溫度、時間、料水比、菌種比例和接種量等影響較為顯著的因素進行正交試驗,實驗設計見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

1.2.6 測定方法

1.2.6.1 納豆激酶活力(NK)的測定 采用Folin酚法[21-22]測定。酶活力單位的定義:溫度為40 ℃,環境pH7.5的條件下,1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸的納豆激酶量為一個酶活力單位,以1 U/g表示。

納豆激酶活力計算公式:

其中:X為納豆激酶的活力;A樣為樣品液的光吸收值OD680 nm;A對為對照液的光吸收值OD680 nm;K為標準曲線上光吸收值為1時的酪氨酸含量,μg;V為酶促反應的總體積,mL;T為酶促反應的時間,min;N為粗酶液的稀釋倍數。

1.2.6.2γ-氨基丁酸(GABA)含量的測定 采用Berthelot比色法[23]進行測定。γ-氨基丁酸含量的計算公式:

其中:Y為花生粕中GABA含量,mg/g;m為樣品液中GABA含量,mg/mL;r為樣品液的總體積,mL;q為稀釋倍數;M為花生粕的質量,g。

1.2.6.3 抗氧化活性的測定 羥自由基清除率[24]、DHHP[25]、鐵還原力[26]等按照文獻進行測定。

1.3 數據處理

采用Origin 8.0和Excel制圖,SPSS 20.0對數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 酶活的標準曲線

納豆激酶活力標準曲線見圖1,回歸方程為y=0.0072x-0.0029,R2=0.9987。

圖1 納豆激酶活力標準曲線Fig.1 Nattokinase activity standard curve

2.2 γ-氨基丁酸的標準曲線

γ-氨基丁酸的標準曲線見圖2,回歸方程為y=1.7296x+0.012,R2=0.9979。

圖2 γ-氨基丁酸標準曲線Fig.2 γ-aminobutyric acid standard curve

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 發酵溫度對發酵效果的影響 由圖3可以看出,在28～40 ℃,NK先上升后下降的趨勢,當發酵溫度為34 ℃時達到最高;GABA也呈先上升后下降的趨勢,34 ℃達到最高,這可能是因為菌種的生長對溫度要求較高,特別是混合菌種,在適宜溫度范圍內,納豆芽孢桿菌和紅曲霉才能快速生長繁殖,產生大量的蛋白酶和γ-氨基丁酸。綜合發酵溫度對這2個指標的影響,確定31～37 ℃作為正交試驗發酵溫度范圍。

圖3 發酵溫度對發酵效果的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on fermentation efficacy

2.3.2 發酵時間對發酵效果的影響 由圖4可以看出,在34～94 h,NK先上升后下降的趨勢,當發酵時間為58 h時達到最高,在發酵初期,納豆芽孢桿菌大量生長繁殖,分泌的酶量多,隨著發酵時間的延長,分泌量逐漸降低;GABA的發展趨勢與NK相似,這可能是隨著培養時間延長,菌種進入衰亡期,菌分泌的代謝產物逐漸減少。綜合發酵時間對這2個指標的影響,確定46～70 h作為正交試驗發酵時間范圍。

圖4 發酵時間對發酵效果的影響Fig.4 Effect of fermentation time on fermentation efficacy

2.3.3 料水比對發酵效果的影響 由圖5可以看出,最適的料水比是1∶0.4 g/mL,在此條件下,NK活性和GABA含量均達到最大。固態發酵過程中水分是一個至關重要的因素,水分含量的高低影響著營養物質的溶解和培養基的透氣性,從而影響菌種的生長。故選擇1∶0.3～1∶0.5 g/mL作為正交試驗的水平范圍。

圖5 料水比對發酵效果的影響Fig.5 Effect of material-waterratio on fermentation efficacy

2.3.4 菌種比例對發酵效果的影響 由圖6可以看出,最適的菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉)是1∶1。菌種混合比例對花生粕發酵產物的影響較為明顯。隨著納豆芽孢桿菌:紅曲霉比例的增加,NK和GABA均呈現先增加后降低的趨勢,納豆芽孢桿菌∶紅曲霉為1∶1時達到最高點。原因可能是無論哪種菌種比例多,對相互的生長有明顯的抑制作用,影響了生物活性物的分泌。故選擇菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉)1∶2～2∶1作為正交試驗的水平范圍。

圖6 菌種比例對發酵效果的影響Fig.6 Effect of strain ratio on fermentation efficacy

2.3.5 接種量對發酵效果的影響 由圖7顯示可知,接種量在2%～10%的范圍內,NK和GABA基本上都是先上升后下降的趨勢,6%的接種量最高。隨著接種量的增加,兩種菌分泌的活性物較多,能較好的利用底物的營養物質,故所產生的發酵物慢慢增加,在達到6%之后,出現逐漸下降的趨勢,可能是由于菌量的增加,消耗的營養物質較多,導致菌的生長受到了影響。綜合該因素對納豆激酶活力和γ-氨基丁酸含量的影響,選擇4%～8%作為正交試驗水平范圍。

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal test design and results

圖7 接種量對發酵效果的影響Fig.7 Effect of inoculum size on fermentation efficacy

2.4 正交試驗的結果

在單因素實驗基礎上,設計L18(35)的正交試驗,優化最佳發酵工藝參數組合。正交試驗的結果如表2所示。

由表2可以看出,正交試驗各因素對花生粕發酵物中納豆激酶活力影響程度大小順序依次為:溫度>料水比>接種量>時間>菌種比例,得到的最佳工藝參數:A1B1C2D3E2,即溫度31 ℃,時間46 h,料水比1∶0.4 g/mL,菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉)2∶1,接種量6%。對γ-氨基丁酸含量的影響程度大小順序依次為:溫度>時間>菌種比例>接種量>料水比,得到的最佳工藝參數是:A2B1C2D1E1,即溫度34 ℃,時間46 h,料水比1∶0.4 g/mL,菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉)1∶2,接種量4%。

由表2可知,以發酵花生粕中納豆激酶活力和γ-氨基丁酸含量為指標,進行正交試驗得到的最佳工藝參數有所不同,各個指標的各個因素具有不同的影響程度。綜合考慮單因素實驗、正交試驗結果及經濟性等方面,主要以納豆激酶活性為主要參考指標。通過分析,時間為46 h和料水比為1∶0.4 g/mL對于兩個指標都是最佳的水平,其他的指標以納豆激酶活性為主要參考,溫度31 ℃,菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉)2∶1,接種量6%作為指標的最佳水平,即A1B1C2D3E2。由于篩選出的最佳組合不在實驗設計中,需要做實驗進行驗證。

將A1B1C2D3E2進行三次平行驗證,得到發酵液中NK的活力為(844.56±13.80)U/g,GABA含量為(105.25±0.25) mg/g,此結果優于其他試驗的結果,原因為對于NK的活力而言A1B1C2D3E2組合中發酵時間短,菌種比例中納豆芽孢桿菌所占的比例較多,多種因素綜合起來有利于NK的活力;另外通過正交試驗分析溫度在31和34 ℃下GABA含量均高,而A1B1C2D3E2和A2B1C2D3E1中時間、料水比和菌種比例均相同,所以測得GABA的含量相差不大。因此A1B1C2D3E2為最佳的工藝條件,即溫度31 ℃,時間46 h,料水比1∶0.4 g/mL,菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉)2∶1,接種量6%。在此條件下對羥自由基清除率為68.46%±0.16%,對DPPH·清除率為76.98%±0.95%,鐵還原力的OD值為0.481。

3 結論

以發酵花生粕中的納豆激酶活力和γ-氨基丁酸的含量為指標,通過單因素實驗和正交試驗,優化納豆芽孢桿菌和紅曲霉混合菌固體發酵花生粕的工藝參數為:溫度31 ℃,時間46 h,料水比1∶0.4 g/mL,菌種比例(納豆芽孢桿菌∶紅曲霉)2∶1,接種量6%,測得NK的活力為(844.56±13.80) U/g,GABA含量為(105.25±0.25) mg/g,對羥自由基清除率為68.46%±0.16%,對DPPH·清除率為76.98%±0.95%,鐵還原力的OD值為0.481。

利用納豆芽孢桿菌和紅曲霉混菌發酵花生粕,不僅能獲得納豆激酶,還可以得到γ-氨基丁酸、抗氧化肽等功能性的生物活性物,提高花生粕的附加值,為花生產業的發展提供了新的思路。