無乳鏈球菌產CMP-唾液酸合成酶發酵培養基優化

(河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003)

CMP-唾液酸合成酶是合成唾液酸化糖鏈的關鍵酶,催化合成唾液酸的激活形態CMP-唾液酸(Cytid5′-monophosphate N-acetyneuraminic acid,CMP-Neu5Ac)[1-2]。唾液酸(N-acetyneuraminic acid,Neu5Ac)在CMP-唾液酸合成酶的催化下與三磷酸胞苷(cytidine triphosphate,CTP)縮合進一步生成CMP-唾液酸,唾液酸的激活形式是一種單磷酸鹽的衍生物,最后在唾液酸轉移酶(Sialytransferase,ST)的催化下與糖連接形成唾液酸化寡糖[3]。唾液酸化寡糖是一類含有唾液酸的低聚糖[4],具有促進雙歧桿菌增值、降低血內毒素及血氨、增強機體免疫力的作用[5],研究者發現唾液酸寡糖作為神經節苷脂的重要組分,可能將成為嬰幼兒生長的條件性必需營養素[6-7]。酶催化法合成唾液酸寡糖轉化率高、產品純度高、快速便捷,是合成唾液酸化寡糖最為有效的方法[8-9]。

無乳鏈球菌是一種廣泛分布于自然界的革蘭氏陽性菌,屬于B群鏈球菌[10],易引起乳腺炎,其病原體經常存在于奶牛的皮膚、乳頭及乳房,并通過擠乳工人和蒼蠅傳播,是水產生物條件性致病菌,無乳鏈球菌感染也存在于海水和淡水魚類,其主要癥狀為敗血癥和腦膜炎[11]。催化合成CMP-Neu5Ac的CMP-唾液酸合成酶已在哺乳動物組織和細菌中被發現[12],目前已有產CMP-唾液酸合成酶的大腸桿菌的克隆與高效表達[13-14],Haft[15]發現血清型為Ib的無乳鏈球菌也可產CMP-唾液酸合成酶且酶活達到1.59×107U/mol,通過前期試驗發現無乳鏈球菌(CICC10465)在基礎培養基下酶活僅為(0.507±0.002)×107U/mol,本文通過研究培養溫度、碳源、氮源和pH對無乳鏈球菌產酶的影響,并采用響應面方法[16]對無乳鏈球菌產CMP-唾液酸合成酶的培養基進行優化,以獲得低成本高酶活的培養基,為無乳鏈球菌產CMP-唾液酸合成酶及其應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無乳鏈球菌CICC10465 北京北納創聯生物技術研究院商城分理處;NmCSS 山東大學糖工程研究中心;Neu5Ac 寧波經濟技術開發區弘翔生化科技有限公司;CTP 杭州美亞藥業股份有限公司;脫水小牛腦浸粉、脫水小牛心浸粉、瓊脂、蔗糖、甘露糖、葡萄糖、麥芽糖 天津市光復科技發展有限公司;NaCl、Na2HPO4、硫酸銨、MgCl2、聚乙二醇 天津市科密歐化學試劑有限公司。

ZHWY-211C型恒溫培養振蕩器 上海智誠分析儀器制造有限公司;MB100-4A型微孔板恒溫振蕩器 杭州奧盛儀器有限公司;ZNCL-B型磁力攪拌器 河南愛博特有限公司;ME104E型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;2011279型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;752N型紫外可見分光光度計 上海精科實業有限公司;INFINITE F50型酶標儀 Tecan Groupltd;Multifuge XIR Centrifuge型臺式高速冷離心機 美國Thermo公司;92-IIDN型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技有限公司;PHS-3C型pH計 上海盛磁儀器有限公司;P70D20N1P-G50WO型微波爐 廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 基礎培養基(BHI)[17]:脫水小牛心浸粉5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、脫水小牛腦浸粉12.5 g/L、NaCl 5.0 g/L、葡萄糖2.0 g/L、Na2HPO42.5 g/L、瓊脂粉20 g/L、pH7.0±0.2、121 ℃條件下滅菌20 min、培養溫度31 ℃。

1.2.2 菌種活化 將無乳鏈球菌菌種從-80 ℃冰箱轉移至無菌操作臺,用吸頭取少量菌種,在固體培養基平板上采用Z字劃線的方法逐步稀釋菌液,在31 ℃培養24 h,生長繁殖成單菌落,即得到初步活化的菌種。挑取一環無乳鏈球菌單菌落至100 mL液體發酵基礎培養基中(裝液量20 mL),在220 r/min搖床上31 ℃培養過夜,得到二次活化的菌種,再以1%接種量轉接于100 mL 液體發酵基礎培養基中(裝液量20 mL),在220 r/min搖床上31 ℃培養過夜,得到最終活化的菌種。

1.2.3 菌種生長曲線 將菌液在31 ℃恒溫振蕩的條件下培養24 h。每間隔2 h取出一瓶,使用酶標儀測其在600 nm下的吸光值,并取其平均值,以時間為橫坐標,OD600值為縱坐標,繪制生長曲線。

1.2.4 CMP-唾液酸合成酶液的制備 將20 mL菌液離心(8000 r/min,30 min)倒掉上清,用20 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)懸浮菌體,置于冰上超聲破碎細胞。離心(8000 r/min,30 min)去除細胞碎片,向上清液中緩慢加入固體硫酸銨,收集35%～60%飽和度的沉淀。將沉淀溶于20 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中,用2 L的含0.1 mol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl的緩沖液(pH7.6)透析,每4 h更換一次透析液,透析液不渾濁即可終止透析。將透析所得的粗酶液用聚乙二醇濃縮,進一步用離子交換柱DEAE-52(2.5cm×30cm)純化。用含0.1 mol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.6)平衡柱子,上樣后,先用一個柱體積的平衡緩沖液洗脫掉未結合的蛋白。然后用2L同樣緩沖液配置的0.10～0.25 mol/L NaCl分別進行梯度洗脫,以上各步驟均在4 ℃下進行。

1.2.5 單因素試驗

1.2.5.1 溫度對菌株發酵的影響 分別在溫度28、31、34、37、40 ℃下采用液體發酵基礎培養基培養培養24 h 后,檢測并計算酶活及細胞干重得到。得到的最佳培養溫度直接應用到以下單因素試驗中。

1.2.5.2 碳源對菌株發酵的影響 分別以0.20% 的蔗糖、麥芽糖、甘露糖、葡萄糖為液體發酵基礎培養基中的碳源,考察不同碳源對無乳鏈球菌產酶酶活和細胞干重的影響。

1.2.5.3 蔗糖濃度對菌株發酵的影響 分別以 0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%蔗糖濃度為液體發酵基礎培養基中的碳源濃度,考察不同蔗糖濃度對無乳鏈球菌產酶酶活和細胞干重的影響。

1.2.5.4 氮源濃度對菌株發酵的影響 分別以2.25%、2.50%、2.75%、3.00%、3.25%為液體發酵基礎培養基中的氮源(脫水小牛心浸粉、蛋白胨、脫水小牛腦浸粉混合氮源)濃度,考察不同氮源濃度對無乳鏈球菌產酶酶活和細胞干重的影響。

1.2.5.5 pH對菌株發酵的影響 分別以5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0為液體發酵基礎培養基中的pH,考察不同pH對無乳鏈球菌產酶和細胞干重的影響。

1.2.6 響應面試驗優化 根據單因素試驗結果,選取蔗糖濃度(A)、氮源濃度(B)、pH(C)為三個因素,為獲得低成本高酶活的產CMP-唾液酸合成酶培養基,用酶活作為響應值,進行中心組合試驗設計。每組試驗重復3次,取其平均值,響應面試驗水平如表1所示,得出最優的蔗糖濃度、氮源濃度和pH,以此確定無乳鏈球菌培基最優配方。

表1 響應面的因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.6 細胞干重的測量 菌液在8000 r/min的轉速下離心10 min,倒掉上清液,在45 ℃干燥24 h后稱重,得到菌種細胞干重(DCW),無乳鏈球菌的吸光值與細胞干重的線性回歸曲線為y=0.3781x-0.0108(R2=0.9987),說明二者相關性較好

1.2.7 酶活的檢測 采用硫代巴比妥酸測酶活[18]250 μL反應體系中含有5.5 mmol/L CTP,2.8 mmol/L唾液酸,0.2 mol/L Tris-HCl(pH9.0),20 mmol/L MgCl2和0.2 mmol/L DTT(Dichlorodiphenyltrichloroethane)。在37 ℃保溫1 h,加入50 μL 1.6 mol/L NaBH4置于室溫15 min,用于還原剩余的唾液酸。然后加入50 μL 6.7 mol/L H3PO4置于0 ℃ 5 min,用于消除剩余的NaBH4,于37 ℃水浴中保溫10 min,用來斷裂CMP-唾液酸中的磷脂鍵。加入50 μL 0.02 mol/L NaIO4來氧化解離下來的唾液酸,置于室溫10 min。加入400 μL溶于0.5 mol/L HCl的4% NaAsO2,再加入1 mL溶于0.5 mol/L NaSO4的0.6% 2-硫代巴比妥酸,于沸水中加熱15 min。加入1 mL環己酮,將液相的粉紅色萃取至有機相,將有機相在549 nm比色。酶的活力單位定義為在37 ℃ 1 min內催化生成1 μmol CMP-唾液酸的酶量。

1.3 數據處理

每組試驗重復3次,取平均值。采用origin 9.60對測定數據作圖,采用SPSS 17.0進行單因素方差分析與顯著性差異分析,Design-Expert 8.0.5進行Box-Behnken響應面試驗設計。

2 結果與分析

2.1 無乳鏈球菌的生長曲線

在基礎培養條件下,以時間為橫坐標,OD600為縱坐標,繪制無乳鏈球菌的生長曲線。如圖1所示,可知無乳鏈球菌在0～2 h為生長延遲期,在2～12 h為生長對數期,12～24 h為穩定期。因此,選擇無乳鏈球菌生長至24h測定酶活及細胞干重。

圖1 無乳鏈球菌的生長曲線圖Fig.1 Growth curve of Streptococcus agalactiae

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 溫度對無乳鏈球菌產酶的影響 溫度是影響微生物生長最重要的因素之一[19]。由圖2可以看出,隨著培養溫度的增加,酶活先升高后降低,34 ℃時酶活最大,為(1.312±0.025)×107U/mol,這是因為適宜的培養溫度有利于提高微生物細胞內酶反應速率,從而提高了細胞的合成速率。當培養溫度升高至34、37、41 ℃時細胞干重依次升高,但酶活卻下降,這是因為溫度升高有利于細胞膜的流動性和物質的運輸,加快了細胞的繁殖速率[20],但僅有利于菌株的繁殖而不利于代謝產酶,因此不能提高菌液濃度而忽略了菌體產酶的活性。34 ℃為無乳鏈球菌的培養溫度響應面設計的零水平,這與陳賀等[21]的研究結果相符。

圖2 不同溫度對菌株產NmCSS酶活及細胞干重的影響Fig.2 Effect of different temperatureson NmCSS activity and dry weight of cell注:圖中不同字母表示差異顯著,P<0.05;圖3～圖6同。

2.2.2 碳源種類對無乳鏈球菌產酶影響 碳源是組成細胞骨架和細胞生命活動所需的能量,可提供合成產物的碳架,為微生物或細胞的正常生長、分裂提供物質基礎,除了葡萄糖外,蔗糖、甘露糖、麥芽糖等天然有機化合物也可以作為碳源,用于微生物生長和生產[22]。由圖3可知,菌株能利用不同的碳源產CMP-唾液酸合成酶,不同種類的碳源對CMP-唾液酸合成酶的活性具有顯著性影響(P<0.05)。以蔗糖為碳源時菌株的細胞干重和CMP-唾液酸合成酶酶活達到了最高水平,細胞干重達到(1.821±0.035) g/L、酶活達到(3.611±0.016)×107U/mol,且發酵液粘稠度高。而師紅亞等[23]得出的無乳鏈球菌(WC04152)的最適碳源是葡萄糖,與本文結論不同的原因可能是是菌株來源、所處的生長環境及內部代謝途徑的不同[24-25]。綜上所述,本實驗選擇蔗糖作為培養基的最佳碳源。

圖3 碳源種類對菌株產NmCSS酶活及細胞干重的影響Fig.3 Effect of carbon source specieson NmCSS activity and dry weight of cell

圖4 蔗糖濃度對菌株產NmCSS酶活及細胞干重的影響Fig.4 Effect of sucrose concentrationon NmCSS activity and dry weight of cell

2.2.3 蔗糖濃度對無乳鏈球菌產酶影響 由2.2.2可知無乳鏈球菌培養基最佳碳源為蔗糖,不同濃度的蔗糖對菌株CICC 10465產酶酶活的影響如圖4所示,隨著蔗糖濃度的增加酶活與細胞干重均呈現先升高后降低的趨勢,當蔗糖濃度為0.10%、0.15%,酶活達到(1.521±0.030)×107U/mol和(1.411±0.011)×107U/mol,二者無顯著差異(P>0.05),綜合比較應選擇蔗糖濃度響應面零水平為0.10%。

2.2.4 氮源濃度對無乳鏈球菌產酶影響 液體發酵基礎培養基中的氮源主要是有機的氮源,能為微生物生長及合成核昔酸、維生素提供氮元素[26-27],菌體生長及代謝產物的生成需要合適的氮源濃度。不同氮源濃度對菌株CICC 10465產酶酶活的影響如圖5所示,隨著氮源濃度的升高酶活與細胞干重先上升后以平穩的趨勢下降,氮源濃度為2.50%時最大,當氮源濃度為2.50%時酶活達到(4.351±0.030)×107U/mol、細胞干重達到(2.263±0.004) g/L,顯著高于其他處理組(P<0.05)。所以培養基中的氮源濃度應調節至2.50%。

圖5 氮源濃度對菌株產NmCSS酶活及細胞干重的影響Fig.5 Effect of nitrogen source concentrationon NmCSS activity and dry weight of cell

2.2.5 pH對無乳鏈球菌產酶影響 為滿足微生物的生長繁殖和產生代謝產物,培養基pH必須控制在一定的范圍內。由圖6可知,當把培養基pH調節至7.5時酶活達到最大(3.023±0.055)×107U/mol、細胞干重也達到最大(1.721±0.004) g/L,顯著高于其他處理組(P<0.05)。pH調節至酸性時酶活和細胞干重下降,這是由于無乳鏈球菌在生長過程中分解碳源產酸,酸性環境不適合其生長[21],pH調節至堿性8.0時,細菌菌體容易衰老和死亡也不利于細菌生長[21],梁琳琳等[28]報道了B群鏈球菌的pH影響原生質膜所帶電荷的極性和滲透性,如一些極性營養物質脂肪酸、氨基酸的解離吸收會受到影響,從而影響細胞代謝繁殖和產酶,這說明酸度適宜的外環境有利于微生物的繁殖代謝和產酶。這也與田海燕等[29]的研究結果一致,因此,應該將培養基pH設為7.5作為響應面零水平。

圖6 pH對菌株產NmCSS酶活及細胞干重的影響Fig.6 Effect of pH on NmCSS activity and dry weight of cell

2.3 無乳鏈球菌產CMP-唾液酸合成酶發酵工藝響應面實驗結果

2.3.1 響應面實驗設計及結果 響應面試驗結果及分析利用Design-Expert 8.0.5中Box-Behnken對無乳鏈球菌產CMP-唾液酸合成酶發酵工藝進行優化實驗設計及分析,其響應面實驗方案及結果見表2,方差分析結果見表3。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Results of response surface test

2.3.2 回歸方程及參數分析 回歸擬合后,可從各測試因素對響應值的影響得出擬合方程:

酶活Y=5.880×107-4.608×105A-5.070×105B-4.657×105C-3.848×105AB-1.286×105AC-250.00BC-2.735×107A2-2.818×107B2-2.817×107C2。

對該回歸模型進行方差分析,結果如表3所示,回歸模型的P<0.0001,失擬項的P=0.0987,模型極顯著,失擬項不顯著,說明模型可靠。R2=0.9992,該模型擬合程度較好,很好的反映酶活與培養基的蔗糖濃度、氮源濃度、pH之間的關系。通過回歸方程系數顯著性可知:模型的二次項A2、B2、C2為極顯著,P<0.01。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance table of regression model

注:*:P<0.05,差異顯著;**:P<0.01,差異極顯著。

2.3.3 響應面優化及分析 利用響應面分析法可以得到三維空間圖形。它們之間的相互作用可以從試驗所得的響應圖中分析得出,從圖7～圖9分析可知無乳鏈球菌產CMP-唾液酸合成酶酶活與發酵培養基蔗糖濃度、氮源濃度、pH這三個因素的相互關系。

通過2.3.3中的表3可知,蔗糖濃度與氮源濃度的交互作用顯著。通過圖7a可以發現,蔗糖濃度調節到較低或者較高水平時,隨著氮源濃度的增加酶活呈現先增加后降低的變化趨勢;說明蔗糖濃度對酶活作用受氮源濃度的影響。當氮源濃度在較低水平或者較高水平時,隨著蔗糖濃度的增加酶活呈先增加后減少的趨勢。說明氮源濃度對酶活作用受蔗糖濃度的影響。由圖7b可知,最大的酶活值為4.932×107U/mol。

圖7 蔗糖濃度與氮源濃度交互影響酶活的曲面圖Fig.7 Response surface diagram of the interactionbetween sucrose concentration and nitrogensource concentration on enzyme activity

圖8 蔗糖濃度與pH交互影響酶活的曲面圖Fig.8 Response surface diagram of the interactionbetween sucrose concentration and pH on enzyme activity

如圖8所示,蔗糖濃度與pH交互影響酶活的曲面圖及等高線圖。當把pH調節為7～8水平之間時,可以看出跟隨著蔗糖濃度的增多,酶活變化趨勢均為先升高再降低;反之,如果調節蔗糖濃度處于0.05%～0.15%水平變化時,可以觀察到隨著pH的增大酶活變化趨勢均也為先升高再降低。由此可說明說明在我們的試驗中蔗糖濃度與pH具有相互作用。由圖8b可知,最大的酶活值為4.937×107U/mol。

如圖9所示,氮源濃與pH交互影響酶活的曲面圖及等高線圖。當把pH調節為7～8水平之間時,可以看出跟隨著氮源濃度的增多,酶活變化趨勢均為先升高再降低;反之,如果調節氮源濃度處于2.25%～2.75%水平變化時,可以觀察到跟隨著pH的增大,酶活變化趨勢均為先升高再降低。由此可說明說明在我們的試驗中氮源濃度與pH具有相互作用。由圖9b可知,最大的酶活為4.924×107U/mol。

圖9 氮源濃度與pH交互影響酶活的曲面圖Fig.9 Response surface diagram of the interaction betweennitrogen sucrose concentration and pH on enzyme activity

2.3.5 驗證實驗 用Design Expert 8.0.5軟件分析,得出最適發酵培養基為蔗糖濃度為0.10%,氮源濃度為2.44%,pH為7.42,此時預測酶活為5.881×107U/mol。為了驗證回歸方程的準確性,利用優化后培養基的條件(蔗糖濃度為0.10%,氮源濃度為2.50%,Na2HPO42.5 g/L、NaCl 5.0 g/L、培養溫度為34 ℃、pH為7.50)進行3次重復性試驗,酶活為(5.895±0.005)×107U/mol。試驗值與模型預測值偏差僅0.014×107U/mol,表明該回歸模型預測值與實驗值擬合性好,可用該模型對酶活進行預測,同時優化后的酶活(5.895±0.005)×107U/mol)比優化前(0.507±0.002)×107U/mol)提高了10.627倍,說明本試驗優化的培養基明顯提高了酶活。

3 結論

通過無乳鏈球菌(CICC10465)培養工藝條件的單因素試驗及Box-Behnken響應面設計試驗,分析得到的產酶培養條件為:蔗糖濃度為0.10%,氮源濃度為2.50%,Na2HPO42.5 g/L、NaCl 5.0 g/L、培養溫度為34 ℃、pH為7.50,酶活達到(5.895±0.005)×107U/mol,較優化前培養基產酶酶活(0.507±0.002)×107U/mol 提高了10.627倍,Haft R F[15]發現血清型為Ib的GBS產CMP-唾液酸合成酶的酶活達到1.59×107U/mol,而本實驗優化的到的酶活為(5.895±0.005)×107U/mol,這可能是因為菌株差異不同導致,也說明此次對酶活的優化是很有意義的。