響應面法優(yōu)化山豆根多糖提取工藝及其分級醇沉組分的抗氧化活性

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(1.廣西民族大學化學化工學院,廣西林產(chǎn)化學與工程重點實驗室,廣西南寧 530008;2.廣西民族大學海洋與生物技術學院,廣西海洋微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術研究中心,廣西南寧 530008)

在自然界許多生物體內(nèi)產(chǎn)生能源燃料的生物過程中,氧化是必不可少的環(huán)節(jié)。但是,過量活性氧的產(chǎn)生對細胞是有害的,它不僅會加快機體衰老,還可能引起癌癥、心臟病、動脈粥樣硬化、炎癥、帕金森以及老年癡呆癥等多種疾病[1]。為減少活性氧對人體的氧化損傷,許多抗氧化劑被合成并得到了廣泛的應用。然而,有研究表明,合成抗氧化劑對健康具有潛在危害,如引發(fā)肝臟損傷和致癌等[2]。與合成抗氧化劑相比,天然抗氧化劑具有低毒性、易被人體吸收的特點。因此,開發(fā)和利用有效的天然抗氧化劑,對預防疾病和改善人體健康具有特殊的意義。

山豆根為豆科槐屬植物越南槐(SophoratonkinensisGagnep.)的干燥根及根莖,屬于廣西大宗藥材之一。研究表明,山豆根含有豐富的生物堿、黃酮、多糖、皂苷等化學成分[3-6],而且山豆根總提取物具有抗腫瘤、抗炎抑菌、抗心律失常和抗氧化等多種活性[7-10]。植物多糖具有多種生物活性,近年來受到越來越多的關注。從山豆根中提取的多糖具有抗腫瘤[11],免疫調(diào)節(jié)[12-13],抗氧化[14]等生理保健作用。有研究報道,通過分級醇沉將多糖初步純化,并基于生物活性導向的研究有利于多糖的進一步開發(fā)[15-17]。

目前,關于山豆根多糖分級醇沉和抗氧化的研究較少,本研究采用響應面法優(yōu)化山豆根粗多糖(SGP)的提取工藝,經(jīng)醇沉分級,將粗多糖初步分組純化,并比較各組分的抗氧化活性,旨在篩選出較好的抗氧化活性多糖分級組分,為山豆根多糖的研究及開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山豆根 產(chǎn)地廣西靖西,廣西南寧市一心藥店;D-葡萄糖 阿拉丁試劑有限公司;DPPH、ABTS Sigma aldrich公司;2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)、無水乙醇、95%乙醇、濃硫酸、苯酚、過硫酸鉀、三氯乙酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵等 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

UV-5100紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;RE-2000A旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SCIENTZ-12ND冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;實驗室超純水器 成都優(yōu)越科技有限公司;HH-S型恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司;循環(huán)水式真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山豆根粗多糖的提取及分級醇沉工藝流程 山豆根→粉碎,過60目→95%乙醇浸泡12 h,去除脂肪→抽濾→殘渣熱水浸提→抽濾→濾液濃縮→75%乙醇沉淀→抽濾→沉淀→冷凍干燥→山豆根粗多糖→分級醇沉→山豆根多糖不同醇沉組分。

1.2.2 單因素實驗 山豆根多糖為水溶性多糖,易溶與水,本實驗采用水提醇沉法,考察各因素對山豆根多糖得率的影響。

1.2.2.1 提取溫度對多糖得率的影響 固定提取時間為2.5 h,液料比為20∶1 (mL/g),考察不同提取溫度60、70、80、90、100 ℃對多糖得率的影響。

1.2.2.2 提取時間對多糖得率的影響 固定提取溫度為80 ℃、液料比為20∶1 (mL/g),考察不同提取時間60、90、120、150、180 min對多糖得率的影響。

1.2.2.3 液料比對多糖得率的影響 固定提取溫度為80 ℃、提取時間為2 h,考察不同液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 (mL/g)對多糖得率的影響。

1.2.3 響應曲面試驗 在單因素實驗的基礎上,運用Design Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken設計,以SGP得率為響應值,采用三因素三水平的響應面分析法優(yōu)化山豆根多糖的提取工藝,各因素水平設計見表1。

表1 響應面實驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels used in the RSM design

1.2.4 分級醇沉 用超純水溶解SGP,離心(4000 r/min,5 min),去除不溶雜質(zhì)。在上清液中加入無水乙醇使得乙醇體積分數(shù)達到50%,置于4 ℃ 冰箱中醇沉12 h以上,離心(4000 r/min,10 min,4 ℃),將沉淀置于冷凍干燥機凍干,得到灰白色粉末,定義為SGP 50。將上個步驟中過濾后得到的濾液加入無水乙醇,使乙醇體積分數(shù)達到70%,同法操作制得70%醇沉組分,即SGP 70;接著制得SGP 80和SGP 90。

1.2.5 多糖得率的計算 按“1.2.1,1.2.4”項方法操作得到SGP及各級醇沉多糖,冷凍干燥后,稱重并按下列公式計算得率。

多糖得率(%)=[多糖質(zhì)量(g)/原料質(zhì)量(g)]×100

1.2.6 多糖純度的測定 采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[18],分別取配制好的粗多糖及各級醇沉多糖樣品溶液1.0 mL,加入5%苯酚1.0 mL,混勻后加入濃硫酸5 mL,震蕩搖勻。混合物在沸水浴中加熱15 min后,取出冷卻至常溫,于490 nm測吸光值。以D-葡萄糖為標準品,做標準曲線,擬合得回歸方程:Y=0.0091X+0.0668,R2=0.9991(其中,X為樣品濃度,Y為吸光值,線性濃度范圍:10～100 μg/mL)。利用標準曲線方程計算出樣品溶液中多糖的含量,并計算多糖純度。

多糖純度(mg/g)=多糖含量(mg)/各級多糖凍干質(zhì)量(g)

1.2.7 抗氧化活性測定

1.2.7.1 DPPH自由基清除能力的測定 參照文獻[19],精密稱取SGP和各醇沉多糖,配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品溶液,配好0.1 mmol/L 的DPPH乙醇溶液,以BHT(濃度為0.09、0.11、0.13、0.15、0.17 mg/mL)為對照品。分別吸取5 mL DPPH乙醇溶液和樣品溶液,混合搖勻,避光放置30 min,分光光度計吸收波長調(diào)至517 nm,測定吸光值,記為A1;另取樣品溶液和無水乙醇各5 mL,同法測定吸光值,記為A2;取同體積的 DPPH乙醇溶液和無水乙醇混合,測得的吸光值記為A0。按下列公式計算清除率。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.2.7.2 ABTS+自由基清除能力的測定 根據(jù)文獻[20],配制ABTS工作液(將7 mmol/L的ABTS乙醇溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合,室溫下避光放置16 h后,用70%乙醇(v/v)調(diào)至734 nm的吸光值為0.700±0.02)。精密吸取ABTS工作液2.5 mL,SGP和各醇沉多糖的樣品溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)1.5 mL,室溫下反應6 min,于734 nm波長處測吸光值,記為A樣,ABTS工作液與70%乙醇(v/v)溶液混合測得的吸光值為A空,以BHT(濃度為0.07、0.09、0.11、0.13、0.15 mg/mL)為對照品,清除率計算公式為:

ABTS+自由基清除率(%)=(A空-A樣)×100/A空

1.2.7.3 還原能力的測定 配制好濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的SGP和各醇沉多糖的樣品溶液和BHT溶液(濃度為0.004、0.008、0.012、0.016、0.200 mg/mL)。參照文獻[21],分別吸取2.0 mL各多糖溶液和BHT溶液,加入0.2 mol/L pH6.6磷酸緩沖液2.5 mL,再加1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL,50 ℃水浴20 min后冷卻,加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL,于4000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,加蒸餾水2.5 mL,0.1%的三氯化鐵溶液0.5 mL,混合10 min后于700 nm波長處測定吸光度。還原能力的強度用3次測定的吸光度平均值來表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有樣品均重復3次實驗操作,運用軟件Design Expert 8.0.6和SPSS 17.0進行實驗設計和數(shù)據(jù)分析,測定結果以平均值±標準差表示,并采用Origin 7.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取溫度對SGP得率的影響 如圖1所示,SGP得率隨著溫度升高而增加。當溫度大于80 ℃時,SGP得率的增加趨于平緩,提取溫度90和100 ℃時的SGP得率與80 ℃時無顯著性差異(P>0.05),其原因可能是,在一定范圍內(nèi),升高提取溫度可使山豆根與水分子的相互作用速率增加,使水溶性多糖更易于從細胞壁中溶出,從而提高了多糖的得率。繼續(xù)升高提取溫度,SGP得率增加不顯著。因此,本實驗定80 ℃為提取溫度的中心點。

圖1 提取溫度對SGP得率的影響Fig.1 Effect of temperature on the extraction rates of SGP

圖2 提取時間對SGP得率的影響Fig.2 Effect of time on the extraction rates of SGP

2.1.2 提取時間對SGP得率的影響 本研究考察了不同的提取時間對SGP得率的影響,如圖2所示,當提取時間為60～120 min時,得率的變化相對較大。SGP得率隨提取時間的延長而增加,在120 min時達到最大值,然后隨提取時間的延長而略有下降。推測較長的提取時間有利于多糖的產(chǎn)生,但是,繼續(xù)延長時間,SGP得率變化不明顯[22],因此,本實驗定120 min為提取時間的中心點。

2.1.3 液料比對SGP得率的影響 如圖3所示,隨著液料比的增加,SGP得率逐漸上升,原因可能是隨著水的比例的增加,多糖成分可以完全溶解在水中。當液料比為30∶1 mL/g時,得率達到最大值;大于30∶1 mL/g時,得率稍有下降,推測原因是液料比為30∶1 mL/g時,多糖提取量已基本飽和,此后溶劑用量增加導致原料的物質(zhì)分子間相互作用減弱[23],多糖得率略有下降。因此,在響應面試驗設計中,定30∶1 mL/g為液料比的中心點。

圖3 液料比對SGP得率的影響Fig.3 Effect of liquid-material ratioon the extraction rates of SGP

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 試驗結果與回歸方程 以單因素實驗結果為基礎,利用Design-Expert 8.0.6軟件設計試驗優(yōu)化SGP的提取條件,由數(shù)據(jù)分析得到SGP得率自變量與相關變量之間關系的擬合方程為:得率(%)=3.95+0.43A+0.45B+0.39C+0.13AB-0.09AC-0.41BC-0.75A2-0.48B2-0.55C2。通過該方程可以計算試驗的預測值,如表2所示。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and result of RSM

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

注:“*”表示差異顯著,P<0.05;“**”表示差異極顯著,P<0.01。

2.2.2 回歸模型的方差分析 表3總結了擬合優(yōu)度、方差和模式充分性的分析結果。從表3可以看出,該模型具有極低的P值(P<0.0001),表明模型具有顯著性;而失擬項在α=0.05水平上不顯著(P>0.05),表明該方程對實驗擬合情況好,實驗誤差小。相關系數(shù)R2為0.9903,表明SGP得率的實驗值與預測值之間一致性很高,模型預測性好。模型的信噪比為24.925(>4),說明方程的擬合度很高,該模型可用于預測。此外,系數(shù)變異值CV(3.84%)較低,表明實驗的精確度較高,重復性好。對SGP提取的影響極顯著的因素有一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2及交互項BC。通過比較F值的大小,可得出影響SGP得率大小的因素順序為:提取時間>提取溫度>液料比。

2.2.3 響應曲面分析 從響應面圖上可以直觀地看出各因素對SGP得率的影響及各因素間交互作用對SGP得率影響的顯著程度。響應面曲面的坡度直接反映了在處理條件下發(fā)生變化時SGP得率的響應靈敏程度;等高線為橢圓形則說明兩因素交互作用顯著[24]。從圖4a,圖4b可看出,其等高線接近圓形,說明兩因素交互作用對SGP的提取影響不顯著;而圖4c的曲面圖曲線比較陡峭,等高線為橢圓形,表明提取時間與液料比的交互作用對SGP的提取影響顯著。響應面圖分析結果與模型方差分析結果具有一致性。

圖4 兩因素交互作用對SGP得率影響的響應面圖Fig.4 Response surface diagram oftwo factors interaction on the yield of SGP

2.3 驗證實驗

由響應面試驗的優(yōu)化得到SGP最佳提取條件為:提取溫度83.15 ℃,提取時間133.4 min,液料比31.61∶1 mL/g。為了便于實際操作,將SGP的最佳提取工藝參數(shù)修正為:提取溫度為83 ℃,提取時間為133 min,液料比為30∶1 mL/g,進行三組重復性驗證實驗,得到SGP的平均得率為3.98%±0.15%,與模型預測值4.15%較接近,表明該模型預測性良好。此時多糖純度為(207.8±14.2) mg/g。

2.4 山豆根多糖各組分得率及含量

從表4可以看出,各級醇沉組分中,SGP 50得率最高,顯著高于其他醇沉組分(P<0.05)。山豆根多糖各組分的多糖純度最高的是SGP 50,最低的是SGP 90,純度順序依次為SGP 50>SGP>SGP 70>SGP 80>SGP 90。

表4 山豆根多糖各組分得率及多糖含量Table 4 Yield and contents of SGPpolysaccharide of different components

注:同列小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 抗氧化活性分析

2.5.1 清除DPPH自由基能力 從圖5可看出山豆根多糖各組分對DPPH自由基均有一定的清除作用,且呈量效關系。當多糖質(zhì)量濃度在0.2 mg/mL時,SGP的清除能力優(yōu)于同濃度的其它醇沉組分。當多糖質(zhì)量濃度在0.4～1.0 mg/mL范圍內(nèi)時,SGP 90的清除DPPH自由基的能力最強,接著依次是SGP、SGP 50、SGP 70,SGP 80的清除能力最弱。而對照品BHT在較低濃度時已表現(xiàn)出較好的清除DPPH自由基的能力。綜上,SGP 90具有較其它組分較好的清除DPPH的能力,但其清除能力低于BHT。

圖5 山豆根多糖各組分和BHT對DPPH自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effect on DPPHfree radical of SGP and BHT

2.5.2 清除ABTS+自由基能力 從圖6可看出SGP各組分在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對ABTS+自由基均有一定的清除作用,呈量效關系。在實驗中,SGP 90對ABTS+自由基的清除能力最強,SGP 80的最弱,各組分清除ABTS+自由基能力的強弱順序與清除DPPH自由基實驗結果相似。,說明SGP各組分對ABTS+自由基能達到相同的清除效果。而相同濃度下,對照品BHT具有顯著高于SGP各組分的清除ABTS+自由基的能力(P<0.05)。

圖6 山豆根多糖各組分和BHT對ABTS自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect on ABTSfree radical of SGP and BHT

2.5.3 還原力 從圖7可看出SGP各組分均具有一定的還原能力,且呈量效關系。在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi),SGP 90的還原能力最強,SGP 80的最弱,SGP 50與SGP的還原能力接近,與清除DPPH、ABTS+自由基實驗結果相似,而相同濃度下,對照品BHT的還原能力顯著高于山豆根多糖各組分(P<0.05)。

圖7 山豆根多糖各組分和BHT的還原能力Fig.7 Reducing power of SGP and BHT

從以上抗氧化活性實驗結果可以看出,山豆根多糖各組分清除DPPH、ABTS+自由基的能力和還原能力的大小順序是一致的,作用強弱依次為:SGP 90>SGP>SGP 50>SGP 70>SGP 80。SGP 90的抗氧化活性最強,然而,從表4可以看出SGP 90的多糖純度是幾個分級醇沉組分中最低的,推測SGP及各級組分的抗氧化活性不僅與多糖純度有關,還可能與山豆根中的其他活性成分有關。

3 結論

本實驗采用響應面法來優(yōu)化SGP的提取工藝,結果表明最佳提取工藝為:提取溫度83 ℃,提取時間133 min,液料比30∶1 mL/g。在此基礎上進行驗證實驗,實測多糖得率為3.98%±0.15%,接近預測的得率(4.15%),說明該模型能較好地預測各因素與SGP得率之間的關系。體外抗氧化研究結果表明,山豆根多糖各組分均有一定的抗氧化能力,其中SGP 90的抗氧化活性最強,可作為下一步目標進行深入研究。造成SGP各醇沉組分抗氧化能力差異的原因可能是由不同體積分數(shù)乙醇沉淀得到的多糖分子量不同、極性不同、結構組成不同,還可能與提取物中含有其他活性成分有關,其確切原因尚待進一步研究。