特定聚合度區間殼寡糖的膜分離制備技術

,2,2,2,2,*

(1.華東理工大學生物工程學院,發酵工業分離提取技術研發中心,生物反應器工程國家重點實驗室,上海 200237;2.上海生物制造技術協同創新中心,上海 200237)

殼寡糖(Chitooligosaccharides,COS)是由D-氨基葡萄糖(或少量N-乙酰-D-氨基葡萄糖)之間通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的聚合度(Degree of polymerization,DP)在2～10之間的低聚糖(及其鹽),結構式見圖1[1-2]。殼寡糖具有溶解度高、吸收能力強和生物相容性好等優點,被廣泛應用于醫藥、食品、農業等領域[3]。聚合度是殼寡糖產品的重要參數,不同聚合度殼寡糖表現出不同的生理活性,如抗菌、抗腫瘤、抗氧化等[2,4-5]。Li等[2]通過對DP 3～7殼寡糖活性的研究,發現殼寡糖清除羥基自由基能力隨著聚合度增加而降低。Chen等[4]研究發現口服殼二糖和殼三糖可以保護由于四氯化碳中毒導致的脂質過氧化反應小鼠。殼寡糖是殼聚糖的降解產物,一般通過化學法、物理法和生物法制備,然而直接制備得到的殼寡糖聚合度分布很寬。因此,殼寡糖混合物的分離純化技術對殼寡糖的研究和應用具有重要意義。

圖1 殼寡糖分子式[2]Fig.1 Chitooligosaccharides structure[2]

膜分離是指借助膜的選擇透過性,在外界能量或化學位差的推動下,對混合物中溶質和溶劑進行分離、分級、提純和富集的方法[6]。膜分離技術具有操作簡單、無污染、經濟性好等優點,廣泛應用于食品、發酵、醫藥等領域[7]。基于納濾(nanofiltration,NF)的等體積滲濾(constant volume diafiltration,CVD)模式可以用于寡糖分離純化過程[8-9]。膜分離技術在殼寡糖制備中常被應用于殼聚糖酶解液的處理過程,以制備高品質的殼寡糖產品。韓永萍等[10]對殼寡糖溶液進行納濾純化,成功去除了單糖、二糖和鹽離子。Dong等[11]利用酶膜耦合分離制備得到了以DP 6～8為主的殼寡糖,收率及純度分別為73.9%和82.2%。Qin等[12]通過酶膜耦合技術獲得了純度為56.17%的DP 5～10的窄分布殼寡糖。李允等[13]利用酶膜耦合技術制備得到了DP 4～8為主的殼寡糖產品。在膜分離過程中,由于濃差極化等阻力的存在,操作條件會對膜分離過程產生影響,因此通過調節物料濃度、溫度和跨膜壓差(transmembrane pressure,TMP)等條件,可以有效提高產品的收率和純度[14-16]。

本研究利用膜分離技術處理殼寡糖混合物原料,分離制備DP 2～5窄分布的殼寡糖產品。首先,探索了物料濃度、溫度和跨膜壓差等條件對1000 Da納濾膜分離殼寡糖效果的影響,并獲得最佳的分離制備條件;之后,通過對連續滲濾過程中傳質過程的研究,建立了殼寡糖產物純度和收率的預測模型,并利用500 Da納濾膜對滲濾透過液進行濃縮,制備得到DP 2～5的窄分布殼寡糖,本研究建立了一種基于納濾膜分離的聚合度2～5殼寡糖的制備方法,為殼寡糖的功能研究和應用開發提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼寡糖混合物(脫乙酰度98.6%,重均分子量1705 Da)、標準品殼二糖((GlcN)2)、殼三糖((GlcN)3)、殼四糖((GlcN)4)、殼五糖((GlcN)5) 惠州長龍生物技術有限公司;惠州長龍生物技術有限公司;乙腈 HPLC級,德國默克公司;其他試劑 均為分析純或化學純。

RNM-1812G型卷式膜設備 杭州瑞納膜工程有限公司;卷式膜(NF4) 北京中科瑞陽膜技術有限公司;卷式膜(GE) 美國通用電氣公司;LGJ-18C型冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司;HHS-21-4型電熱恒溫水浴鍋 上海醫療機械五廠;CP214C型電子分析天平 奧豪斯儀器(上海)儀器有限公司;Shimadzu LC-20AT型高效液相色譜儀、ELSD-LT-Ⅱ型檢測器 日本島津有限公司;Shodex NH2P-50 4E型色譜柱(4.6 mm ID×250 mm L,5 μm) 日本昭和朝日有限公司;本文使用的兩種卷式膜的詳細信息見表1。

表1 膜材料和信息Table 1 Membrane materials and properties

1.2 實驗方法

1.2.1 納濾分離條件對分離過程的影響

1.2.1.1 物料濃度 分別配制3 L物料濃度為30、50、70、90和110 g/L的殼寡糖混合物溶液,經過抽濾后,在跨膜壓差15 bar、溫度45 ℃、全循環模式下(透過液和截留液均流入原料罐),運行30 min后,分別取截留液和透過液,并測定一定時間內透過液的體積,計算膜通量。通過重量法測定截留液和透過液中殼寡糖混合物的濃度,計算納濾膜對殼寡糖混合物總的表觀截留率。通過HPLC法測定透過液和截留液中不同聚合度殼寡糖的濃度,計算納濾膜對不同聚合度殼寡糖(DP2～7)的表觀截留率。

膜通量Jv為單位時間內通過單位膜面積的透過液的體積(L·m-2·h-1),計算如公式(1)所示:

式(1)

其中,Jv表示膜通量,L·m-2·h-1;Vp表示測定時間內透過液的體積,L;A表示有效膜面積,m2;t表示測定時間,h。

采用冷凍干燥法測定樣品中殼寡糖混合物的質量,通過公式(2)計算濃度:

式(2)

其中,c表示殼寡糖的濃度,g/L;m表示試樣中殼寡糖質量,g;V表示樣品體積,L。

表觀截留率計算如公式(3)所示:

式(3)

其中,Robs表示表觀截留率,%;CP和CF分別為透過側和截留側溶質濃度,g/L。

1.2.1.2 溫度 分別配制3 L物料濃度為70 g/L的殼寡糖混合物溶液,經過抽濾后,在跨膜壓差15 bar、溫度分別為25、30、35、40、45和50 ℃,在全循環模式下,運行30 min后,分別取截留液和透過液,并測定一定時間內透過液的體積,計算膜通量。通過重量法測定截留液和透過液中殼寡糖混合物的濃度,計算納濾膜對殼寡糖混合物總的表觀截留率。通過HPLC法測定透過液和截留液中不同聚合度殼寡糖的濃度,計算納濾膜對不同聚合度殼寡糖(DP2～7)的表觀截留率。

1.2.1.3 跨膜壓差 分別配制3 L物料濃度為70 g/L的殼寡糖混合物溶液,經過抽濾后,在溫度為45 ℃,跨膜壓差分別為6、9、12、15和18 bar,在全循環模式下,運行30 min后,分別取截留液和透過液,并測定一定時間內透過液的體積,計算膜通量。通過重量法測定截留液和透過液中殼寡糖混合物的濃度,計算納濾膜對殼寡糖總的表觀截留率。通過HPLC法測定透過液和截留液中不同聚合度殼寡糖的濃度,計算納濾膜對不同聚合度殼寡糖(DP2～7)的表觀截留率。

1.2.2 數學模型分析及連續滲濾 配制3 L物料濃度為70 g/L的殼寡糖混合物溶液,經過抽濾后,在溫度45 ℃、跨膜壓差15 bar、全循環模式下,運行30 min后,進行滲濾實驗。實驗過程中,每次收集透過液達到1.5 L時,向物料罐中補充1.5 L去離子水。每當透過液達到3 L時,分別取截留液和透過液,并測定一定時間內透過液的體積,計算膜通量。分別測定透過液和截留液樣品中殼寡糖混合物的濃度,用HPLC分析透過液樣品的組分,計算透過液中累積得到的殼寡糖總量。

在滲濾過程中,透過液中每個成分的實際收率計算如公式(4)所示。

式(4)

其中:y表示各組分的收率;CP和CF,i分別為該組分在透過液和初始原料溶液中的濃度,g/L;VF和Vd分別為初始原料溶液體積和滲濾過程中透過液總體積,L。

在滲濾實驗的研究過程中,使用了一種多溶質系統的分析方法,將所有的溶質分為兩類:小分子溶質A(DP 2～5的殼寡糖)和大分子溶質B(DP≥6的殼寡糖),利用數學模型對實驗結果進行分析,并通過數學模型預測DP 2～5殼寡糖的收率和純度與滲濾倍數的關系。本研究是為了在透過液中獲得小分子溶質A,盡量將大分子溶質B截留,因此主要分析透過液中小分子物質A的收率和純度。透過液中小分子物質A的收率YP和純度PuP計算分別見公式(5)和(6)。

式(5)

式(6)

在忽略濃差極化效應影響的條件下,假設溶質的滲透因子PC(PC=1-R)不受物料罐中溶質濃度變化的影響,且整個實驗過程始終為恒體積滲濾過程,可以用數學模型對滲濾過程中的傳質過程進行預測[19-21]。物料罐中料液濃度和滲濾倍數關系式見公式(7)。

式(7)

其中,Vd/VF被定義為滲濾倍數。

依據公式(5～7),透過液中小分子物質A的預測收率和純度計算公式分別見(8)和(9)。

式(8)

式(9)

最后,擴大滲濾倍數至15倍,對數學模型進行驗證,并將透過液作為下一步濃縮制備DP 2～5殼寡糖的原料。

1.2.3 DP 2～5殼寡糖的制備 經過上一步連續滲濾處理之后,高聚合度殼寡糖和DP 2～5的殼寡糖分別被富集在截留液和透過液中。在40 ℃,9 bar的條件下,使用500 Da納濾膜(NF4)對透過液進行濃縮,取濃縮液分析組分并計算DP 2～5殼寡糖的收率和純度。

1.2.4 膜的清洗 在膜組件使用前用去離子水測定膜初始水通量,當通量衰減低于10%時,表示膜可以繼續使用。使用后,加入去離子水循環沖洗3遍后,加入配置好的2 L 0.4 g/L NaOH和0.5 g/L EDTA-2Na混合液,全循環40 min后,加入去離子水清洗至電導率接近去離子水的電導率且膜通量恢復初始通量時,表明膜及膜設備清洗干凈,將拆下的膜組件泡入0.5%(w/v)NaHSO3保護液,封口并避光保存。

1.2.5 HPLC法定量測定殼寡糖 將待測樣品配制成10 mg/mL的溶液,通過0.45 μm過濾膜過濾后,進行HPLC分析,測定樣品中DP 2～7殼寡糖的含量。分析條件如下:色譜柱Shodex NH2P-50 4E;柱溫30 ℃;流速V=1.0 mL/min;進樣量10 μL;檢測器為蒸發光散射檢測器(ELSD-LT-Ⅱ);以乙腈和水作為流動相梯度洗脫(0～15 min,75%乙腈;15～40 min,75%～50%乙腈;40～45 min,50%～75%乙腈;45～55 min,75%乙腈)[17]。以殼寡糖標準品濃度(mg/mL)為橫坐標,峰面積(×104)為縱坐標得到的標準曲線方程如下:殼二糖(y=126.43x-31.86,R2=0.999);殼三糖(y=105.07x-44.91,R2=0.998);殼四糖(y=93.08x-67.36,R2=0.998);殼五糖(y=34.73x-8.98,R2=0.997)。通過標準曲線計算可得樣品中各組分的分布。由于缺少殼六糖((GlcN)6)和殼七糖((GlcN)7)標準品,采用殼五糖的標準曲線計算殼六糖和殼七糖的濃度[18]。

1.3 數據處理

實驗重復三次,單因素實驗數據以平均值±標準差表示,數學模型數據以平均值表示,采用SigmaPlot 10.0軟件作圖,采用Excel 2013對數據進行方差分析及模型分析。

2 結果與分析

2.1 物料濃度對納濾分離效果的影響

如圖2(A)所示,殼寡糖膜分離過程中,隨著物料濃度的增加,膜通量逐漸降低,殼寡糖總的表觀截留率略有降低。隨著物料濃度的增加,物料黏度增加,由于滲透壓增加且跨膜壓差不變導致驅動力降低,從而導致膜通量的降低[8]。物料濃度對不同聚合度殼寡糖的表觀截留率的影響見圖2(B),隨著物料濃度的增加,殼二糖和殼三糖表觀截留率逐漸降低,殼四糖到殼七糖表觀截留率變化不明顯。隨著物料濃度增加,濃差極化加劇,不可逆膜孔堵塞污染加劇,導致表觀截留率降低。殼六糖和殼七糖的分子量較高,表觀截留率較高(大于95%)且基本不受物料濃度影響。隨著物料濃度的增加,不同聚合度殼寡糖組分之間的表觀截留率差異逐漸增大,更有利于不同組分的分離。但是,物料濃度的增加會導致膜通量降低。根據目標物質,宜選用擁有較低表觀截留率和較高膜通量的物料濃度,因此,綜合考慮選擇物料濃度70 g/L作為最佳條件。

圖2 物料濃度對膜通量和表觀截留率的影響Fig.2 Effects of feed concentrationon permeate flux and observed rejection 注:A:物料濃度對膜通量和殼寡糖總的表觀截留率的影響;B:物料濃度對不同聚合度殼寡糖表觀截留率的影響。

2.2 溫度對納濾分離效果的影響

溫度對膜通量和殼寡糖總的表觀截留率的影響見圖3(A),隨著溫度的增加,膜通量不斷增加,殼寡糖總的表觀截留率逐漸降低。膜通量增加的原因是由于隨著溫度上升,純水透過系數增加且物料黏度下降[22]。由圖3(B)可知,隨著溫度的增加,不同聚合度殼寡糖表觀截留率均逐漸降低,表觀截留率下降是由于隨著溫度升高殼寡糖的透過系數和有效膜孔徑變大[20,23]。隨著溫度的增加,膜通量增加,不同聚合度殼寡糖組分之間的表觀截留率差異逐漸增大,有利于殼寡糖的分離。但是,考慮到膜的最大操作溫度為50 ℃,選擇45 ℃作為最佳操作溫度。

圖3 溫度對膜通量和表觀截留率的影響Fig.3 Effects of temperature on permeateflux and observed rejection 注:A:表示溫度對膜通量和殼寡糖總的表觀截留率的影響;B:表示溫度對不同聚合度殼寡糖表觀截留率的影響。

2.3 跨膜壓差對納濾分離效果的影響

跨膜壓差對膜通量和殼寡糖總的表觀截留率的影響見圖4(A),隨著跨膜壓差的增加,膜通量呈線性不斷增加,殼寡糖總的表觀截留率逐漸降低。由于膜分離過程主要由壓力驅動,同時受到濃差極化效應的影響,因此壓力的增加會直接導致膜通量的增加。由圖4(B)可知,隨著跨膜壓差的增加,不同聚合度殼寡糖組分的表觀截留率均逐漸升高,不同聚合度殼寡糖組分之間的表觀截留率差異逐漸減少,不利于殼寡糖的分離過程。最終選擇15 bar作為最佳跨膜壓差條件。

2.4 數學模型分析及連續滲濾過程

隨著連續滲濾過程的進行,殼寡糖在透過液中不斷累積,滲濾體積對膜通量和透過液中殼寡糖總質量的影響見圖5(A)。膜通量在滲濾實驗進行的過程中呈現先下降后逐漸上升的趨勢,這是由于第一次補充水前物料罐中殼寡糖混合物溶液被濃縮,濃度增加,而后續實驗過程中,隨著透過液中的殼寡糖不斷移出,殼寡糖濃度下降。由公式(7)可知,ln(CF/CF,i)和Vd/VF之間存在一定的線性關系。由實驗數據作圖可得圖5(B),由圖中可知,ln(CF/CF,i)和Vd/VF之間存在良好的的線性關系(R2>0.97),各組分平均滲透因子Pc的計算結果見表2。

表2 各組分的平均滲透因子Table 2 Average permeation factors of various COS

圖4 跨膜壓差對膜通量和表觀截留率的影響Fig.4 Effects of TMP on permeateflux and observed rejection注:A:跨膜壓差對膜通量和殼寡糖總的表觀截留率的影響;B:跨膜壓差對不同聚合度殼寡糖表觀截留率的影響。

圖5 連續滲濾對膜通量和透過液中殼寡糖總質量及截留液中各組分的影響Fig.5 Effects of continue diafiltration on permeate flux,cumulative permeate quantity of COS and relativeconcentration of each component in retentate注:A:滲濾體積對膜通量和透過液中殼寡糖總質量的影響;B:滲濾倍數對料液中殼寡糖各組分濃度的影響。

圖6 累積滲濾體積與純度和收率的關系Fig.6 Relationship between cumulativepermeate volume,purity and yield注:A:滲濾體積對透過液中不同聚合度殼寡糖(DP 2～7)實際收率和預測收率的影響;B:滲濾體積對DP 2～5殼寡糖理論收率和實際收率的影響;C:收率對透過液中窄分布殼寡糖(DP 2～5)理論純度和實際純度的影響。

通過公式(8)計算得到的各組分預測收率和實際收率與滲濾體積的關系見圖6(A),預測收率與實際收率基本一致,殼三糖到殼七糖偏差值在10%以內。因此該模型可以用于預測滲濾過程中殼寡糖各組分的收率。

由圖5(A)可知,在滲濾倍數為8倍時,滲濾并未達到平衡,可以通過擴大滲濾倍數提高收率。根據該模型計算DP 2～5殼寡糖混合物純度和收率的理論值,擴大滲濾倍數測定實際收率及純度進行實驗驗證,結果如圖6(B)和6(C)。隨著累積滲濾體積的增加,DP 2～5殼寡糖的實際收率與理論收率保持一致;隨著收率的增加,透過液中DP 2～5殼寡糖的純度略有降低,且實驗數據與理論數據誤差范圍在4%之內。當滲濾倍數達到15時(滲濾體積達到45 L),DP 2～5殼寡糖的收率為52.3%,純度為82.0%,與預測值相吻合。

2.5 濃縮制備DP 2～5窄分布殼寡糖

經1000 Da膜分離得到的透過液,再經過500 Da納濾膜濃縮后,殼寡糖混合物原料和最終產品的HPLC分析結果如圖7所示。窄分布殼寡糖組成為殼二糖5.4%(w/w),殼三糖18.6%(w/w),殼四糖25.5%(w/w),殼五糖32.6%(w/w),殼六糖12.7%(w/w),殼七糖5.0%(w/w)和少量高聚合度殼寡糖。而原料中殼寡糖組成為:殼二糖3.3%(w/w),殼三糖10.3%(w/w),殼四糖19.6%(w/w),殼五糖34.3%(w/w),殼六糖21.4%(w/w),殼七糖5.0%(w/w)和高聚合度殼寡糖(DP>7)。通過膜分離技術在產品中富集了DP 2～5的殼寡糖,提高了DP 2～5殼寡糖的純度,最終得到的產品中DP 2～5的殼寡糖的純度為82.1%,總收率為42.1%。

圖7 殼寡糖原料和膜分離所得窄分布殼寡糖產物的HPLC分析圖Fig.7 HPLC analysis of raw materialsand membrane separation product注:A:殼寡糖原料;B:膜分離所得窄分布殼寡糖產物。

3 結論

本文研究了不同條件對殼寡糖膜分離過程的影響,獲得了1000 Da納濾膜分離殼寡糖的最佳條件,即物料濃度70 g/L、溫度45 ℃和跨膜壓差15 bar。利用數學模型成功預測了滲濾過程中目標聚合度殼寡糖收率和純度與滲濾倍數的關系,最后采用兩步膜分離即滲濾和濃縮的方法制備得到了DP 2～5的窄分布殼寡糖,純度和收率分別為82.1%和42.1%。本研究建立了特定聚合度區間殼寡糖膜分離制備工藝,為殼寡糖的功能研究和應用提供了技術支持。