響應面優化發酵磨盤柿褐變條件的研究

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(1.蘭州理工大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730050;2.河北農業大學農村發展學院,河北保定071000)

黑色食品(Mat Black,MB)主要指天然黑色或顏色較深,營養較豐富平衡并具有一定調節人體生理功能的一類食品[1],MB的營養價值及功能性均高于同類非MB[2],主要分為兩類,一類為天然MB,另一類是經加工褐變而成的MB[3],如:黑醬油、豆豉、黑啤酒、黑蒜等。大蒜、豆豉能通過加工能成為MB,其成色機理主要是:加工過程的酶促褐變、美拉德反應,酚類物質的自生縮合、微生物產生黑色素及焦糖化反應形成黑色或褐色的物質,促使原來的食品褐變成MB[4-9]。

柿子具有多種活性成分,營養豐富[10-12]。我國是柿子的主要生產國家,占世界總產量的70%～80%[13]。國內外對柿子的研究及加工除了鮮食,人們主要把它加工成柿子飲料、柿餅、罐頭、面包、醬及其它柿子產品等。由于柿子加工的局限性,致使柿子總加工量不到10%,貿易額僅占全球總額3%左右[14-15]。目前,在MB發酵加工中利用的可食安全真菌有黑曲霉Asp.niger、米曲霉Asp.oryzae、毛霉M. sp、根霉R. sp.等,Asp.niger在發酵過程中能產生纖維素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖、氧化酶、果膠酶、沒食子酸等,Asp.oryzae發酵過程能產生典型揮發性風味物質、蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等,M. sp能產生蛋白酶、脂肪酶等,R. sp.能產生淀粉酶、蛋白酶、果膠酶等[16-17]。

為增加柿子的加工途徑,提高柿子的經濟價值。本論文根據黑蒜及黑醬油的成色機理,以柿子為顏料,利用微生物能產生多種酶的特點,通過單因素實驗和響應面實驗來研究磨盤柿發酵黑柿的最佳褐變工藝條件,本文比較4種真菌對發酵柿子褐變程度的影響,通過單因素和響應面實驗優化Asp.niger發酵柿子褐變條件,得到影響褐變的顯著因素和適宜條件,可為柿子黑色產品開發提供技術借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磨盤柿 河北保定茂源果品股份有限公司提供蛋白質含量0.05%、碳水化合物含量17%、水分83.4%、膳食纖維1.4%、灰分2.7%;黑曲霉(Aspergillusniger)、毛霉(Mucorsp.)、根霉(Rhizopussp.)、米曲霉(Aspergillusoryzae) 蘭州理工大學生命科學與工程學院實驗中心提供;NaOH(AR) 天津益仁達化工有限公司;純凈水 蘭州信盈飲品有限公司;PDA培養基 實驗室自制。

DHP-9082電熱恒溫培養箱 上海恒一科學儀器有限公司;BT200微電腦電陶爐 中山奔騰電器有限公司;L550臺式低速離心機 湖南湘儀實驗室儀器有限公司;752N紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公公司;YX280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申醫療器械有限公司;XH-C快速混合器 江蘇省金壇市醫療器械廠;EB-28BI雙目光學生物顯微鏡 麥克奧迪實業集團有限公司;LBJ-620 榨汁攪拌機東菀市樂邦電子有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵黑柿子工藝流程 原料篩選→清洗→切塊→打漿→分裝→滅菌→接種→發酵(指標測定)→黑柿

1.2.2 操作要點 原料篩選:選擇表面光滑、無斑、無損傷的柿子作為原料。

原料處理:將挑選的柿子洗凈切成約1 cm×1 cm×1 cm大小的塊狀,打漿(兩層紗布過濾),每個玻璃容器中分裝500.00 g,用紗布封住口后,0.1～0.15 MPa高壓滅菌30 min,取出置于無菌超凈臺上冷卻到室溫待用。

菌種活化[18]:將4種真菌以相同的手法接種到新制備的PDA培養基上,于恒溫培養箱中32 ℃培養待產孢子時,取出在4 ℃冰箱內保存備用。

菌懸液的制備[19]:將活化好的菌種管用5～10 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液反復吹洗斜面,將孢子及菌絲轉至無菌離心管,4000 r/min離心15 min棄其上清液,取一定質量的沉淀用0.9%氯化鈉溶液稀釋成1×10-4g/mL的菌懸液。

接種:無菌條件下,取一定量1×10-4g/mL的菌懸液用0.9%氯化鈉溶液定容至10 mL加入經處理后的柿子漿中,攪勻后封口,轉入一定溫度的恒溫培養箱中發酵一定時間,3 d翻攪一次,并監測水分使其含量保持在70%～80%范圍內。以加入10 mL0.9%無菌氯化鈉溶液的柿子漿發酵瓶作對照,以0.9%無菌氯化鈉溶液作為空白。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 不同真菌對褐變度的影響 無菌條件下,分別取Asp.niger、M. sp.、Asp.oryzae、R. sp. 10 mL的菌懸液接入分裝處理好的柿子漿中,攪拌均勻,封口在32 ℃恒溫發酵。經肉眼觀察發酵柿子漿褐變程度較大時,分別測定4種真菌對應的發酵物褐變度值,選擇褐變度值最大實驗組對應的微生物進行后續實驗,記錄柿子發生明顯褐變的時間,為研究發酵時間、溫度單因素對柿子褐變的影響做參考。

1.2.3.2 發酵溫度對褐變度的影響 無菌條件下,分別向5組處理過的柿子漿瓶中,接入Asp.niger的菌懸液10 mL,攪拌均勻,封口,分別放入22、27、32、37、42 ℃恒環境中恒溫發酵36 d,測定褐變度值,篩選出最適發酵溫度。

1.2.3.3 發酵時間對褐變度的影響 在無菌條件下,向分裝處理好的柿子漿瓶接入Asp.niger的菌懸液放入32 ℃的恒溫培養箱中分別培養12、24、36、48、60、72、84、96 d,將篩選得到的微生物菌懸液接入處理過的柿子漿瓶中,最有利發酵褐變的溫度條件下恒溫發酵,定時翻拌,監測水分含量,每12 d測一個樣品的褐變度值,通過比較篩選出最佳發酵時長。

1.2.3.4 加入菌懸液的量對褐變度的影響 分別取Asp.niger的菌懸液2、4、6、8、10 mL,用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10 mL的接入分裝處理好的柿子漿瓶,充分拌均,定時翻拌,監測水分含量。在溫度為32 ℃、發酵72 d,后測定其褐變度值。找出發酵最適Asp.niger接種菌懸液的量。

1.2.4 響應面試驗 參照趙自通等[20]人的方法,略作修改:在單因素實驗的基礎上,利用Design-Expert 11.0.4軟件中的Box-Behnken進行三因素三水平試驗設計,以Asp.niger的菌懸液的量(6、8、10 mL)、發酵溫度(27、32、37 ℃)、發酵時間(60、72、84 d)三個因素為自變量,方案如表1所示。經過試驗結果分析,確定因素間的交互作用對柿子褐變的影響,優化柿子褐變條件。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 褐變度的測定 根據果蔬褐變度的測定方法[8,20-21],略作修改:取10.0000 g具有代表性發酵物充分研磨后用15 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液洗入燒杯中,沸水浴5 min,冷卻至室溫,轉入離心機以1000 r/min離心10 min,取其上清液在λ420 nm下的測其吸光值,以A420×10值表示褐變度,褐變度=褐變度實驗組-褐變度對照。

1.3 數據處理與分析

每個處理組重復三次,都設有空白對照,數據以平均值表示,采用Origin Pro 2018c軟件,Design-Expert 11.0.4軟件,Excel 2016軟件進行實驗數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 4種真菌對柿子褐變度的影響

由圖1可知,4種真菌對柿子褐變的影響為:Asp.niger>R. sp.>Asp.oryzae>M. sp.。Asp.niger和R. sp.對柿子褐變影響較大的原因有三種:一是Asp.niger、R. sp.自身可以產生黑色孢子,可以使柿子漿顏色變深[22];二是Asp.niger、R. sp.產生的酶與柿子漿中的小分子物質發生褐變反應;三是Asp.niger和R. sp.自身可以分泌黑色素[23]。從實驗目的的角度考慮,選擇Asp.niger作為黑柿子發酵真菌。Asp.niger、R. sp.能夠分泌糖化酶、果膠酶,可以降解柿子果漿中的果膠、淀粉等大分子物質成為小分子糖類,有利于美拉德反應,所以選擇Asp.niger用于后續實驗。

圖1 4種真菌對柿子褐變度的影響Fig.1 Effects of four fungi on thebrowning degree of persimmon

2.2 發酵溫度對柿子褐變度的影響

由圖2可以看出,接種Asp.niger對柿子漿在溫度為32 ℃時恒溫發酵,柿子漿褐變效果最好,可能是因為32 ℃是Asp.niger生長最適宜的溫度,發酵溫度在22～32 ℃區間,柿子的褐變度隨溫度的升高而增大,可能是因為22～32 ℃區間,溫度是影響Asp.niger生長促進褐變的主要因素;在37～42 ℃時沒有22～32 ℃褐變效果佳,但褐變度變化波動不太大,可能是因為溫度較高對Asp.niger生長代謝有一定抑制作用,所以32 ℃是發酵的最佳溫度,與隋雨菲[24]等人研究發現黑曲霉的生長溫度接近。

圖2 發酵溫度對柿子褐變度的影響Fig.2 Effects of fermentation temperatureon browning degree of persimmon

2.3 發酵時間對柿子褐變度的影響

由圖3可知:發酵天數小于72 d時,接種Asp.niger的柿子漿的褐變度逐漸隨發酵天數的延長而增加。在72 d后褐變基本保持不變,發酵時長為24～36 d與12～24 d相比褐變度變化較大,可能是因為發酵時長為24～36 d時,柿子漿中的環境最適合Asp.niger生長繁殖,使Asp.niger量達到鼎盛時期;在72 d以后褐變度幾乎保持不變,可能是因為微生物生長達到穩定期或衰亡期,發酵時間不是Asp.niger促進柿子漿褐變的主要原因。故發酵時長為72 d是柿子褐變最好的時長。

圖3 發酵時間對柿子褐變度的影響Fig.3 Effects of fermentation timeon browning degree of persimmon

2.4 加入菌懸液量對柿子褐變的影響

由圖4可知,發酵柿子漿接種Asp.niger菌懸液的量小于6 mL時,柿子的褐變度隨菌懸液量的增大而增大,Asp.niger菌懸液的量在2～6 mL范圍內,柿子的褐變度隨菌懸液量的改變變化較明顯,當菌懸液的量大于8 mL時,菌懸液的量增加對柿子褐變度的影響不明顯,可能是因為微生物量達到飽和,這時微生物的量不是影響褐變度的主要因素,說明Asp.niger菌懸液的量達到一定限度時,對發酵柿子漿褐變影響不明顯。

圖4 初始菌懸液量對柿子褐變度的影響Fig.4 Effects of suspension liquid volumes offungi on browning degree of persimmon

2.5 發酵柿子褐變條件響應面優化

2.5.1 Box-Behnken響應面優化實驗結果 在單因素實驗結果的基礎上,利用Design-Expert 11.0.4軟件進行Box-Behnken優化,以以Asp.niger的菌懸液的量(6、8、10 mL)、發酵溫度(27、32、37 ℃)、發酵時間(60、72、84 d)三個因素為自變量,褐變度為響應值,設計3因素3水平實驗,實驗設計與結果如表2所示。

表3 Box-Behnken響應面實驗結果方差分析表Table 3 Analysis of variance of results of Box-Behnken response surface methodology

注:**代表極顯著,P<0.01;*代表顯著,P<0.05。

表2 Box-Behnken響應面實驗設計與結果Table 2 Experimental design and results ofBox-Behnken response surface methodology

2.5.2 模型的建立與顯著性分析 以柿子的褐變度為響應面值,根據表2實驗結果,用Design-Expert 11.0.4軟件進行多因素回歸擬合分析,具體結果如表3。經回歸擬合分析后,實驗因子Asp.niger菌懸液的量(A)、發酵時間(B)、發酵溫度(C)對褐變度(Y)的影響可用以下回歸方程表示:

Y=5.56-0.53A+0.23B+0.128C+0.39AB-0.057AC-0.26BC-1.11A2-0.78B2-0.50C2

由表3可知,其F=38.09,P<0.0001,說明本模型擬合程度達到極顯著水平;失擬項不顯著,其失擬檢驗的F值為0.49,存在71.07%的失擬,失擬項在α=0.05水平上不顯著(P=0.7107>0.05),模型的R2=0.98,說明該模型的可信度較高。在所選各因素的水平范圍內,按照對結果的影響排序,Asp.niger菌懸液的量(A)>發酵溫度(C)>發酵時間(B)。

從方差分析結果可得,方程的模型A、C、AB、A2、B2、C2對柿子褐變度的影響極顯著,B、BC對柿子褐變度的影響顯著,AC對柿子褐變度的影響不顯著。

2.5.3 響應面交互作用分析 二元擬合模型的響應面分析結果如圖5所示,表示用于響應面Asp.niger菌懸液的量(A)、發酵時間(B)、發酵溫度(C)3個因子中,當某個因子為固定水平時,另外兩個因子對褐變度的協同作用關系,等高線的形狀可以直觀反應兩因子的交互作用強弱和顯著程度。由圖5可知,菌懸液的量與發酵時間的等高線中心區域呈橢圓形、相對較密集并且曲面較陡峭,說明二者之間交互作用明顯;菌懸液的量與發酵時間和發酵溫度的等高線圖中心區域也構成橢圓,但菌懸液的量與發酵溫度構成的曲面相對較平緩、沒構成橢圓,說明菌懸液的量與發酵溫度的交互作用相對于菌懸液的量與發酵時間要弱;發酵時間與發酵溫度構成的曲面相對于菌懸液的量與發酵溫度要陡峭,說明發酵時間與發酵溫度的交互作用相對于菌懸液的量與發酵溫度要明顯;此外,菌懸液的量、發酵時間、發酵溫度三因子與響應面值褐變度均成拋物線關系,且響應面均為凸面開口向下說明在試驗點的連續區域內存在最大值。通過二元擬合求解,預測其最佳褐變工藝條件為Asp.niger菌懸液的量7.51 mL、發酵溫度33.49 ℃、發酵時間72.53 d,在此條件下褐變度的理論預測值為5.668。

圖5 各因素交互作用對柿子褐變度的影響Fig.5 Effects of interaction of various factorson browning degree of persimmon

2.5.4 驗證試驗 驗證時,為了便于實際操作,對最佳工藝條件預測值修正為黑曲霉Asp.niger菌懸液的量8 mL(1×10-4g/mL)、發酵溫度33.5 ℃、發酵時間72.5 d,其他工藝條條件不變,在此條件下進行實際實驗操作進3次平行驗證試驗,褐變度可達到5.62,與理論預測值6.68接近程度高,說明所用二元擬合模型對柿子漿發酵褐變的實驗過程具有一定的指導作用。

3 結論

本論文通研究黑曲霉Asp.niger、毛霉M. sp、米曲霉Asp.oryzae、根霉Rhizopussp.這4種真菌接入處理過得柿子漿中發酵加工黑柿子,篩選得到最適宜黑柿產品發酵的微生是黑曲霉Asp.niger,通過考察黑曲霉Asp.niger菌懸液的量、發酵時間、發酵溫度等3因子,以褐變度為響應面值建立方程組和模型,預測出最佳發酵條件:黑曲霉Asp.niger菌懸液的量8 mL、溫度33.5 ℃、時間72.5 d。在此條件下褐變度可達到5.62,接近了預測值。說明此數學模型對褐變度的預測準確。進一步柿子發酵加工黑色柿子產品和應用提供了一定的參考依據,可為黑色柿子產品開發提供技術借鑒。