響應面法優化蝦殼促鈣吸收肽的酶解工藝

蘇來金,葉 劍,劉煥興2,徐仰麗

(1.溫州市農業科學研究院,浙江溫州 325006;2.溫州市中西醫結合醫院,浙江溫州 325001)

蝦類味道鮮美,營養價值極高,深受我國人民喜愛。據2017中國漁業年鑒統計,2016年全國海水養殖蝦產量達127萬噸,淡水養殖蝦產量達203萬噸,其中對蝦和克氏原鰲蝦的年加工量之和超過70萬噸[1]。加工過程中會產生約30%～40%的蝦頭、蝦殼等加工副產物,其中含有豐富的蛋白質、礦物質、幾丁質等營養物質[2-3]。目前蝦頭、蝦殼等副產品主要以廢棄物或者低值飼料的形式處理,造成資源的巨大浪費甚至污染環境。因此合理地開發利用這部分資源,對相關產業附加值提升,促進增收增效具有重要意義。

鈣是人體必不可少的元素,膳食中鈣營養狀況與人體生長發育、心血管疾病以及慢性病密切相關,攝入足量的鈣對改善骨質疏松癥狀具有重要的作用[4-7]。各類調查研究顯示,我國居民的鈣攝入量偏低[8-10]。食用補鈣制劑是改善居民鈣營養狀況,預防骨質疏松的重要途徑。

目前鈣劑產品主要分為無機鈣、有機酸鈣、氨基酸鈣、肽鈣等類別[11-12]。其中無機鈣劑的鈣含量高,但溶解性差,生物利用率低;有機酸鈣劑溶解性較好,但鈣含量低,總體吸收較差;氨基酸鈣劑化學穩定性好,能使鈣通過氨基酸載體被人體較完整地吸收,但價格昂貴[13]。肽鈣是由小肽末端氨基及鄰近的肽鏈與鈣形成單環螯合結構,和氨基酸鈣相比,具有吸收速度更快,更穩定且不易飽和等優點[12],因此肽鈣螯合物近年來已成為補鈣制劑的新研究熱點。目前相關研究主要是集中在魚鱗[14]、卵黃[15]、蛋清[16]、大豆[17]等原料,而水解蝦殼蛋白制備肽鈣螯合物的研究鮮有報道。

本研究以蝦殼為原料,以水解度和持鈣能力為評價指標,研究了蛋白酶水解制備促鈣吸收肽的最佳工藝,為蝦殼資源的后續研究和開發利用提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝦殼 溫州市錦達味業食品有限公司;中性蛋白酶(200 U/mg)、木瓜蛋白酶(100 U/mg)、風味蛋白酶(15000 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、堿性蛋白酶(200 U/mg) 北京索萊寶科技有限公司;甲醛、氫氧化鈉、濃鹽酸、無水乙醇、氯化鈣、鈣羧酸指示劑、乙二胺四乙酸 國藥集團;試驗所用試劑均為分析純。

AL204電子天平 梅特勒儀器有限公司;PHS-3C型pH計 上海雷磁儀器廠;DF-2集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 常州華奧儀器制造有限公司;UNIVERSAL 320R離心機 德國Hettich科學儀器有限公司;WF18超微粉碎機 溫州頂歷醫療器械有限公司;722型可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蝦殼粉末制備 蝦殼經100 ℃熱風干燥去除水分后,用超微粉碎機進行粉碎,蝦殼粉末置于4 ℃密封保存備用。

1.2.2 氨基酸組成分析 蝦殼的氨基酸組成按照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》[18]的方法進行預處理,采用日立L-8800全自動氨基酸分析儀進行氨基酸組成分析。

1.2.3 酶活力測定 實驗用蛋白酶活力測定采用福林酚法[19]。以酪蛋白溶液為底物,在各蛋白酶適宜的條件下每分鐘催化酶解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需的酶量定義為一個酶活力單位(U)。酪氨酸濃度(μg/mL)與吸光度的關系為y=0.0103x+0.0024(R2=0.9993)。

1.2.4 酶解工藝 稱取適量的蝦殼粉,按照物料質量加入一定體積的去離子水,置于磁力攪拌器上,調節溶液pH后按一定比例加入蛋白酶,在蛋白酶最適溫度下進行酶解反應。酶解過程中每隔15 min 用3 mol/L HCl或NaOH維持pH穩定。酶解結束后95 ℃滅酶15 min,冷卻至室溫后調節酶解液pH至7.0,4000 r/min離心15 min。取上清液定容后,于4 ℃保存備用。

1.2.5 水解度測定 采用中性甲醛電位滴定法[20]測定游離氨基氮含量。樣品總氮含量采用凱氏定氮法[21]測定。

1.2.6 鈣離子結合活性測定 在乙醇等有機溶劑中,螯合鈣的溶解度較小,而未螯合的多肽和鈣離子可以在溶劑中溶解,因此可以采用乙醇沉淀法將酶解液螯合鈣從溶液中分離出來[22]。鈣離子結合活性測定按照趙立娜等[16]的方法略加修改,在具塞試管中加入5 mL酶解液、少量5mmol/L的CaCl2和30 mL無水乙醇,充分混勻后在37 ℃溫育30 min。然后4 ℃ 8000 r/min離心15 min,棄去上清液。取沉淀加入去離子水溶解,定容后用EDTA絡合滴定法檢測沉淀中的鈣含量[23]。

1.2.7 單因素實驗 分別以酶解液的水解度和鈣結合量為指標,首先比較堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶在各自的適宜條件下對蝦殼蛋白的水解效果,反應條件見表1。再按照堿性蛋白酶酶解基礎條件:酶添加量3000 U/g,底物濃度10%,pH10.0,反應溫度50 ℃,水解時間4 h,以鈣結合量和水解度為評價指標,固定其他變量來分別考察各單因素對水解效果的影響,單因素試驗水平表見表2。

表1 五種酶的酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions of five kinds of enzymes

表2 酶解單因素試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of single-factortest for enzymatic hydrolysis

1.2.8 響應面試驗 根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理,基于單因素試驗結果,以鈣結合量為響應值,進行響應面實驗確定最佳酶解條件,因素水平表見表3。

表3 響應面分析試驗設計因素水平表Table 3 Factors and levels table of response surface design

1.3 數據處理

2 結果與討論

2.1 蝦殼氨基酸組成分析

肽的氨基酸組成及結構會在一定程度上影響其結合鈣離子能力,如酪蛋白磷酸肽[24-26]和卵黃磷酸肽[27-29]中富含的磷酸絲氨酸基團被認為與其結合金屬離子的能力密切相關。也有研究表明,不含磷酸基團的肽也有鈣結合能力[14,30],其中的谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、組氨酸、精氨酸和甘氨酸等在肽與鈣結合過程中起著重要作用[31-33]。對蝦殼進行氨基酸分析,結果見表4。

表4 蝦殼氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of shrimp shell

氨基酸組成分析表明,蝦殼中蛋氨酸含量最高,其次為谷氨酸和天門冬氨酸,分別占總量的12.3%、12.0%和9.6%。吳長平等[34]利用鰻魚尾制備鈣螯合肽后發現反應中,谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸的貢獻最大。包小蘭[17]的研究也表明,大豆蛋白肽的鈣結合活性與肽鏈中谷氨酸和天冬氨酸含量呈正相關。此外,甘氨酸、亮氨酸、精氨酸等含量也較豐富。因此蝦殼蛋白是一種較好的鈣離子結合活性肽原料。

2.2 蛋白酶的篩選

通過蛋白酶的酶切作用,可以從蛋白質中釋放出具有生物活性的肽類,測定蝦殼在各蛋白酶的適宜pH與酶解溫度下(表1)所得酶解液的氨基態氮含量和鈣離子結合活性,結果見圖1。

圖1 不同蛋白酶對水解度和鈣結合量的影響Fig.1 Effect of different proteases on theDH and calcium-binding amount

由圖1可以看出,在堿性蛋白酶作用下,蝦殼的水解度最高,且酶解液鈣離子結合能力最強,這主要是由于堿性蛋白酶是一種有著寬廣作用范圍的絲氨酸內肽酶,能夠裂解Glu、Met、Leu、Tyr、Lys和Gly的羧端肽鍵。胰蛋白酶酶解能力與堿性蛋白酶相當,但鈣離子的螯合力弱于堿性蛋白酶。綜合考慮酶解液的兩項指標,選擇堿性蛋白酶作為實驗的酶解用酶。

2.3 單因素試驗

2.3.1 pH對蝦殼粉酶解效果的影響 根據堿性蛋白酶的最適pH范圍,取pH分別為9.0、9.5、10.0、10.5、11.0進行實驗。由圖2可知,在該反應體系中,pH大小對產物水解度和鈣結合能力均有較顯著的影響。這主要是由于堿性蛋白酶有其最適pH,當溶液中pH較低時,會影響酶構象改變,降低酶活力[35]。由圖2看出,隨反應液pH的升高,樣品的水解度和鈣結合量都逐步提高,至pH為10.0時趨于平緩。因此,綜合考慮選擇酶解的pH范圍為10.0～11.0。

圖2 pH對水解度和鈣結合量的影響Fig.2 Effect of pH on the DH and calcium binding amount

2.3.2 酶添加量對蝦殼粉酶解效果的影響 由圖3可知,當堿性蛋白酶添加量從2500 U/g增加到3500 U/g,樣品水解度明顯提高,在4000 U/g以上時趨于穩定,說明此時對底物的酶解效果接近飽和。產物對鈣離子的結合能力在蛋白酶添加量為4000 U/g時達到峰值,繼續增大酶用量反而抑制鈣結合量。這說明雖然酶添加量提高可以使蝦殼蛋白的水解度提高,但同時也會使酶解液中的鈣離子結合活性肽更易被降解為無鈣結合能力的游離氨基酸,令其純度降低。結合兩種指標,選擇酶添加量為3500～4500 U/g。

圖3 酶添加量對水解度和鈣結合量的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on theDH and calcium binding amount

2.3.3 酶解時間對蝦殼粉酶解效果的影響 由圖4可知,反應前期,水解度和鈣結合量均明顯上升,并在水解5 h時達到最高值。這可能是因為隨著水解程度的提高,產物中的多肽含量提高,與鈣結合的位點變多,使產物的鈣結合能力變強[36]。但5 h后多肽被分解為氨基酸的速度大于多肽產生的速度,因此兩項指標均出現下降。結合兩種指標,確定酶解時間范圍為4～6 h。

圖4 酶解時間對水解度和鈣結合量的影響Fig.4 Effect of time on theDH and calcium binding amount

2.3.4 酶解溫度對蝦殼粉酶解效果的影響 反應體系中,溫度的提高會加快物質運動速率,特別是底物與酶的接觸幾率,從而促進反應。但過高的溫度也會導致蛋白酶的分子結構的次級鍵斷裂,導致酶活性降低,延緩了酶解進程[37]。從圖5中看出,在40～55 ℃的溫度范圍內,隨溫度升高,酶解液中的水解度逐漸提高,酶解液的鈣離子結合能力也隨溫度升高而上升。而當溫度高于55 ℃,相對高溫會使堿性蛋白酶的活性減弱,影響酶解效率。另外,高溫也可能導致促鈣吸收肽的結構被破壞。雖然產物的水解度變化不大,但鈣離子結合能力有所減弱。結合兩種指標,確定最佳酶解溫度范圍在50～60 ℃。

圖5 酶解溫度對酶解液的水解度和鈣結合量的影響Fig.5 Effect of temperature on theDH and calcium binding amount

2.3.5 底物濃度對蝦殼粉酶解效果的影響 不同底物濃度對蝦殼蛋白水解度和鈣結合量的影響見圖6。隨底物濃度從低到高,底物與酶的接觸機會變多,前期樣品水解度和鈣結合能力不斷提高。當底物濃度大于6%,濃度提高反而使水解度降低,且當濃度超過10%時急速下降。而鈣結合能力也隨底物濃度變大呈現先升高后降低的趨勢,在10%達到峰值。可能是由于較高的底物濃度會導致酶解液過于粘稠,令有效的酶切位點減少,影響目標肽的生成[38]。綜合兩個指標,選擇底物濃度為10%。

圖6 底物濃度對酶解液的水解度和鈣結合量的影響Fig.6 Effect of substrate concentrationonthe DH and calcium binding capacity

2.4 響應面試驗分析

2.4.1 響應面試驗結果 在單因素實驗基礎上進行響應面試驗對水解條件進行優化,選擇pH(A)、酶添加量(B)、酶解時間(C)、酶解溫度(D)4個因素,以鈣結合量(Y)為響應值,采用Box-Behnken設計實驗,根據Design-Expert設計試驗方案和結果見表5。通過回歸擬合后,得到鈣結合量與4個因素之間的回歸方程:Y=1.91+0.077A+0.11B+0.12C-0.031D

表5 Box-Behnken實驗設計及結果Table 5 Box-Behnken experimental design and results

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis for the established native regression model

注:*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。-1×10-2AB-7.5×10-3AC+1×10-2AD+7.5×10-3BC+5×10-3BD+0.032CD-0.11A2-0.24B2-0.16C2-0.095D2。

方差分析結果與顯著性檢驗結果見表6。模型的F值為111.06,P值小于0.0001,表明模型極顯著。失擬項的P值大于0.05,表明模型失擬不顯著。其中,A、B、C、D、A2、B2、C2、D2的P值小于0.01,差異極顯著;CD的P值小于0.05,差異顯著。

表7 模型的可信度分析Table 7 The credibility analysis of the model

2.4.2 響應面曲面分析 響應面圖和等高線圖能直觀地反映出各因素間的相互關系及相互作用程度。對于雙因素間的交互作用,模型中只有CD(酶解時間-酶解溫度)交互作用顯著(P<0.05)。根據Design Expert軟件得出的回歸模型各因素相互之間作用如圖7所示。

圖7 酶解時間與酶解溫度間的交互作用分析Fig.7 The interaction of time and temperature

從圖中可以看出,pH和酶添加量一定時,隨著酶解時間和溫度的升高,酶解液的鈣結合能力先升高后降低,在接近中心點時取得最大值。

2.4.3 最佳工藝參數確定及驗證試驗 以酶解液的鈣結合量最大值為指標,經過模型預測,最佳提取條件為:pH10.16,酶添加量4116 U/g,酶解時間5.374 h,酶解溫度54.617 ℃,預測的鈣結合量可達到1.957 mg/mL。考慮到實際應用,調整驗證工藝參數為pH10.2,酶添加量4100 U/g,酶解時間5.5 h,酶解溫度55 ℃,在此條件下試驗3次。實際測得的酶解液水解度達到16.33%±0.27%,鈣結合量平均值為(1.954±0.02) mg/mL,與理論值僅差0.003 mg/mL,說明該模型具有較好的實用價值。

3 結論

本研究以蝦殼為原料,研究促鈣吸收肽的酶解工藝。通過單因素試驗和響應面優化,結合實際生產條件,確定其最佳酶解條件為pH10.2,堿性蛋白酶添加量4100 U/g,酶解時間5.5 h,酶解溫度55 ℃,在此條件下酶解液的水解度可達到16.33%,鈣結合量達1.954 mg/mL。制備得到的蝦殼多肽具有較強的鈣離子結合能力,在新型鈣制品開發的領域具有較好的前景。