轉谷氨酰胺酶對乳清濃縮蛋白-納米微晶纖維素復合膜性能的影響

(大連工業大學食品學院,遼寧大連 116034)

乳清蛋白膜具有黏性和伸縮性,在較低的濕度條件下具有優良的氧氣和油脂阻隔性。然而由于含有較多的親水性氨基酸,乳清蛋白膜的機械強度和水蒸氣阻隔性能較差,因此利用可再生的纖維素和殼聚糖等添加入蛋白膜基質進行共混改性,對乳清蛋白膜的性能進行改良[1-2]。Yoo等[3]研究纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉分別與乳清蛋白制備復合膜,其表現出更低的透光率,更高的熱穩定性,且具有與純的蛋白膜相似的阻水特性。

應用酶法改性,也是改善蛋白質成膜性質的一種有效途徑。轉谷氨酰胺酶(TG)可以催化發生酰基轉移反應,促進蛋白質分子間或分子內發生交聯反應,從而可以改善蛋白膜的性能。韓翠萍等[7]將TG酶應用于制備乳清蛋白膜,發現TG酶顯著增強了乳清蛋白膜的機械性能。

目前相關研究中關于纖維素對乳清蛋白膜的共混改性修飾和TG酶對乳清蛋白膜的改性研究較多,而利用多糖和TG酶共存條件對乳清蛋白膜性能修飾作用的研究較少。基于前期研究發現,NCC和TG酶在共存條件對乳清蛋白膜的性能具有修飾作用。本文側重研究TG酶的添加量對WPC-NCC復合膜的機械性能和屏障性能的影響作用,并探究TG酶對WPC-NCC復合膜微觀結構的影響,為TG酶交聯WPC-NCC復合膜的開發應用提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清濃縮蛋白WPC-80 德國米萊乳品公司;納米微晶纖維素水凝膠 納米微晶纖維素,干物質含量為2% 上海開翊新材料有限公司;轉谷氨酰胺酶 酶活為100 U/g蛋白江蘇一鳴生物制品有限公司;甘油 天津市恒興化學試劑公司;其他試劑 均為分析純。

IKA RT5磁力攪拌器 德國IKA有限公司;恒溫恒濕箱(KBF720) 德國Binder有限公司;質構儀(TA-XT plus) 英國Stable Micro System公司;傅里葉紅外光譜儀(Spectrum 10) 美國PE公司;場發射掃描電子顯微鏡(JSM-7800F) 日本電子株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 復合膜制備 將乳清濃縮蛋白粉末緩慢加入一定量的納米微晶纖維素水凝膠中,緩慢磁力攪拌2 h,避免出現氣泡,使其充分溶解均勻。隨后定容,使混合溶液中的蛋白終濃度為10%,NCC的干物質含量為蛋白質量的10%。分別向混合溶液中添加3、6、9、12 U/g蛋白的TG酶液,于50 ℃恒溫水浴反應2 h。然后在80 ℃水浴滅酶10 min,迅速冷卻至室溫。最后加入45%的甘油(以蛋白質量為基準)作為增塑劑,緩慢攪拌1 h,制得均勻的混合膜液。以未加TG酶處理的復合膜液為對照。

將成膜液倒入平皿中(90 mm×90 mm),緩慢晃動平皿,使液面水平,置于恒溫恒濕箱中于35 ℃,RH 40%條件下烘干,揭膜后于25 ℃、RH 50%條件回軟24 h,備用。

1.2.2 厚度測定 采用均值法[8]。使用數顯外徑千分尺測定膜的厚度,在制備好的膜上任意選擇5個點,測量厚度,取其平均值為膜的厚度。所測得膜的厚度作為機械性能和水蒸氣透過率的計算依據。

1.2.3 機械性能測定 采用質構儀法[9]。根據ASTM D882-02方法,使用A/TG探頭測定復合膜的抗拉強度和斷裂伸長率。將膜裁剪為1 cm×4 cm的長方形膜片,初始夾距設置為20 mm,拉伸速度設置為10 mm/s,有效拉伸距離為20 mm,記錄下膜樣品斷裂時的抗拉強度和斷裂伸長率。樣品斷裂以在中間處斷裂為準,每組樣品重復測定9次。

1.2.4 透光率測定 采用分光光度計法。膜的透光率使用可見光分光光度計測定。根據Soazo等[7]方法,將膜裁剪成1 cm×4 cm的長條膜片,置于比色皿內側,在波長600 nm下測定膜的透光值,以空皿作為對照。

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1.2.5 水蒸氣透過率測定 采用擬杯子法[10]。將膜樣品置于恒溫恒濕箱25 ℃、RH 50%條件下24 h,達到平衡。將3.0 g無水氯化鈣添加至稱量皿中(直徑為2.6 cm,深度為3.0 cm),用各種膜樣品封蓋。將稱量皿放置于恒溫恒濕箱(25 ℃、RH 50%)中,每隔1 h稱量并記錄下封膜后稱量皿的質量,持續稱量9 h。水蒸氣透過率值的計算,參考González等的方法[11],水蒸汽傳輸速率以通過膜進入稱量皿的水蒸汽質量相對于時間的變化繪圖曲線的斜率表示。

WVT=F/A

式(1)

式中,WVT-水蒸汽傳輸速率;F-線性圖斜率;A-暴露于蒸汽傳輸的面積,m2。

式(2)

式中,WVP-水蒸汽透過率,gmPa-1s-1m-2;S-在25 ℃時的飽和壓力,Pa;(RH1-RH2)-杯內外部濕度差;e-膜的厚度,m。

1.2.6 紅外光譜 將不同TG酶添加量的WPC-NCC復合膜分別與一定量KBr用研缽充分研磨成均勻粉末,壓制成薄片。傅里葉紅外光譜儀進行全波段掃描(4000～400 cm-1),掃描次數為4次,分辨率4 cm-1,平行4次。用Omnic 8.2軟件在譜帶范圍內(酰胺I帶1700～1600 cm-1)進行基線校正,并經去卷積處理,在二階導數譜圖基礎上用高斯(Gaussian)曲線擬合,估算出子峰的個數和位置,調整各子峰的半峰寬。確定各子峰與各個二級結構單元的對應關系后,根據峰面積計算各二級結構組分的相對百分含量[12]。

1.2.7 掃描電鏡 采用掃描電鏡(SEM)觀察。使用掃描電子顯微鏡掃描成膜的表面結構。樣品剪成固定的形狀粘在金箔條上,在真空的條件下對樣品進行處理,加速電壓為25 kV,10000倍的放大倍數下觀察膜表面的微觀結構。

1.3 數據處理

每組實驗至少重復3次,除去失敗膜的結果,試驗結果主要采用軟件IMB SPSS Statistics 20中Duncan檢驗進行差異顯著性分析,P<0.05時認為差異顯著。用不同字母表示復合膜性能的差異顯著(P<0.05),利用軟件Origin 8.5繪圖報告結果。

2 結果與分析

2.1 膜的機械性能分析

抗拉強度和斷裂伸長率等機械性能是探究生物材料內部結構重要的指標。包裝材料應具有一定強度、韌性和延展性。如圖1所示,不同TG酶添加量對WPC-NCC復合膜抗拉強度的影響。可以看出,復合膜的抗拉強度隨著TG酶添加量的增加而先增大后減小。與未添加TG酶的復合膜相比,當TG酶添加量為9 U/g蛋白,抗拉強度由1.3 MPa增長至2.38 MPa,達到最大值。這是由于TG酶的加入,促使乳清蛋白發生共價交聯,對復合膜的抗拉強度起到了一定的增強效果。張春紅等[13]在研究TG酶改性對花生蛋白膜性能的影響中,發現了相似結果,TG酶的交聯作用,使蛋白膜的拉伸強度和斷裂伸長率都得到了較大程度的提高。

TG酶的添加對復合膜的斷裂伸長率具有增強效果。如圖1所示,隨著TG酶添加量的增加,復合膜的斷裂伸長率顯著增大。與未添加TG酶的WPC-NCC復合膜相比,當TG酶的添加量達到12 U/g蛋白,復合膜的斷裂伸長率增長了約30%。這主要由于TG酶的交聯作用,在分子內和分子間形成了酰胺鍵,分子間作用力增強[14],從而在一定程度上提高了復合膜的斷裂伸長率。這一結果與Wang等[15]研究不同添加量TG酶對明膠-碳酸鈣復合膜的影響的結果相一致,研究發現不同添加量的TG酶對復合膜斷裂伸長率的增長具有顯著作用。

圖1 TG酶對WPC-NCC復合膜機械性能的影響Fig.1 Effect of TGase on mechanicalproperties of WPC-NCC composite film注:不同小寫字母代表抗拉強度差異顯著(P<0.05);不同大寫字母代表斷裂伸長率差異顯著(P<0.05)。

2.2 膜的屏障性能分析

包裝材料的透光性,能夠直觀地反映TG酶對乳清蛋白基質膜表觀結構的影響。圖2為不同TG酶添加量對WPC-NCC復合膜透光率的影響。可以看出,隨著TG酶添加量的增加,復合膜的透光率在一定程度上有所下降,但差異不顯著。復合膜的外觀沒有太大的變化,呈現光滑透明的狀態,復合膜在600 nm處的透光率保持在約為50%～60%。這一結果與姜燕[16]等利用TG酶對食物蛋白質成膜性能的影響相一致,姜燕等中指出TG酶可以引起乳清蛋白的聚集和交聯,成膜溶液的濁度增加,從而使成膜后透光率下降。

水蒸氣透過率(WVP)能夠代表包裝材料在包裝食品與外界環境之間,阻礙水分子的遷移能力,這一特性主要由包裝材料內部的微觀結構所決定。圖2為不同TG酶添加量對WPC-NCC復合膜的水蒸氣透過率的影響。與未經TG酶處理的WPC-NCC復合膜相比,當TG酶添加量超過9 U/g蛋白,復合膜的水蒸氣透過率下降。這主要由于在TG酶的誘導作用下,可以在賴氨酸和谷氨酰胺之間形成共價鍵,從而形成致密的網絡結構[17],因此可以降低WPC-NCC復合膜的水蒸氣透過率。而Oh等[18]研究表明TG酶對酪蛋白膜、乳清蛋白膜、玉米蛋白-酪蛋白和玉米蛋白-乳清蛋白膜的水蒸氣透過率具有不同程度的影響,這可能由于制備方法、蛋白種類不同、以及交聯程度等因素共同調控著包裝材料的水蒸氣屏障性。

圖2 TG酶對WPC-NCC復合膜屏障性能的影響Fig.2 Effect of TGase on barrierproperties of WPC-NCC composite film注:不同小寫字母代表透光率差異顯著(P<0.05);不同大寫字母代表水蒸氣透過率差異顯著(P<0.05)。

2.3 紅外光譜分析

紅外光譜能夠表明分子中官能團的振動模式,并通過波數的變化顯示分子間的相互作用。圖3顯示為經過不同TG酶添加量處理的WPC-NCC復合膜樣品的FTIR譜圖(4000～400 cm-1)。3600～3300 cm-1范圍為N-H伸縮振動以及O-H伸縮振動。文獻表明,當形成分子內或分子間氫鍵時,O-H的吸收峰向低波數移動,且與N-H的振動吸收峰重疊而峰形變寬[19-20]。由圖5可見,隨著TG酶添加量的增加,復合膜樣品于3500 cm-1附近的吸收峰分別為:3414.65(0 U/g蛋白)、3401.93(3 U/g蛋白)、3386.86(6 U/g蛋白)、3386(9 U/g蛋白)、3370.71 cm-1(12 U/g蛋白)。表明經過TG酶的處理,復合膜可能產生較強的分子內或分子間氫鍵連接。

另外,波數1700～1600 cm-1范圍為酰胺I區(C=O伸縮振動),這一區域主要與蛋白質的二級結構緊密相關[21]。對酰胺Ⅰ帶進行去卷積和二階導數技術處理后,疊加峰分解為9～13個子峰的高斯曲線擬合。表1是分別經過不同添加量TG酶(0～12 U/g蛋白)處理的WPC-NCC復合膜樣品的二級結構含量變化,隨TG酶添加量的增加,α-螺旋(1650～1660 cm-1)在二級結構中的比例顯著增大(P<0.05),而β-折疊(1610～1640 cm-1,1670～1680 cm-1)和無規則卷曲(1640～1650 cm-1)的含量顯著下降(P<0.05)。在不同加酶量處理的WPC-NCC復合膜中,其二級結構主要以β-轉角(166～1670 cm-1,1680～1700 cm-1)和β-折疊為主,這兩者主要與弱相互作用有關,如氫鍵、范德華力和靜電相互作用等,說明弱相互作用在維持成膜結構具有很大的作用。而α-螺旋和無規卷曲(random coil)含量相對較少。α-螺旋主要與蛋白質結構的穩定性有關,而無規卷曲的含量影響著蛋白結構的有序性。TG酶的交聯作用,使得α-螺旋含量升高,無規卷曲的含量下降,表明乳清蛋白的結構向穩定性和有序性變化,增強了成膜基質結構的穩定性。這一結果與圖1中WPC-NCC復合膜的機械性能隨加酶量的增加而顯著提升密切相關。Wu等[12]研究TG酶對膠原膜的機械性能和熱穩定性能,得出了相似結果,指出TG酶的交聯處理使得蛋白質中的弱相互作用增強,蛋白質的無序性降低,從而使蛋白膜的熱穩定性和機械性能顯著提高。

表1 不同TG酶添加量的WPC-NCC復合膜的二級結構(平均值±標準差)Table 1 Secondary structure of WPC-NCC composite films with different concentrations of TGase treated(Mean±SD)

圖3 不同TG酶添加量的WPC-NCC復合膜的紅外光譜Fig.3 FITR spectra of WPC-NCC composite filmswith different concentrations of TGase treated

注:同列數據右上角標示不同小寫字母表示二級結構含量差異顯著性(P<0.05)。

2.4 掃描電鏡分析

膜的各種性能,很大程度上依賴于成膜材料的分子排列規整性,分子間作用力強弱以及大分子在成膜溶液中的溶解性等[15],因此復合膜微觀結構與成膜性能密切相關。不同TG酶添加量的WPC-NCC復合膜在掃描電鏡10000倍下觀察的結果如圖4所示。經TG酶處理的WPC-NCC復合膜與未經TG酶處理的復合膜樣品的表面形貌沒有顯著差別。在10000倍掃描電鏡觀察下,未經TG酶處理的WPC-NCC復合膜呈現凹凸不平,粗糙的結構,且具有大量不規則孔洞,因此WPC-NCC復合膜仍具有較高的水蒸氣透過率。而隨著TG酶添加量的增加,復合膜表面的孔洞數量顯著減少且直徑減小,這一結果與圖2中水蒸氣透過率隨著加酶量的增加而降低密切相關。當TG酶量超過9 U/g蛋白,復合膜的結構呈現出更加致密的結構,主要由于TG酶的交聯作用,使乳清蛋白生成大分子聚合物,具有一定的空間結構,因此在WPC-NCC復合膜表面呈現不均勻,不平整的結構。本研究結果與Wang等[15]在TG酶誘導明膠-碳酸鈣交聯膜相似,其研究中指出TG酶的交聯作用,使得復合膜的表面微觀結構更加致密緊湊,同時顯著增加了不均勻的程度。

圖4 不同TG酶添加量的WPC-NCC復合膜的電鏡掃描圖(×10000倍)Fig.4 SEM micrographs of WPC-NCC composite filmswith different concentrations of TGase treated(×10000)

3 結論

TG酶對WPC-NCC復合膜的的機械性能和屏障性能影響顯著。當TG酶量達到12 U/g蛋白時,WPC-NCC復合膜的抗拉強度由1.78 MPa增長至2.25 MPa,斷裂伸長率由56.53%增長至86.75%,水蒸氣透過率由4.97×10-12gmPa-1s-1m-2降低至4.40×10-12gmPa-1s-1m-2,蛋白的二級結構向穩定有序的方向轉化,復合膜的表觀結構發生變化。TG酶交聯WPC-NCC復合膜的研究,將拓展乳清蛋白基復合膜的開發應用。