植物油中維生素E異構體在C18和CSH Fluoro-Phenyl固定相上的保留特征及含量差異

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(1.重慶第二師范學院生物與化學工程學院,重慶 400067;2.重慶第二師范學院,脂質資源與兒童日化品協同創新中心,重慶 400067;3.重慶江源油橄欖開發有限公司,重慶 401587;4.蘭州海關綜合技術中心,甘肅蘭州 730000)

維生素E(Vitamin E,VE)是一種脂溶性維生素,是目前食品行業中最主要的抗氧化劑之一。VE不僅能有效抑制油脂氧化、防止油脂酸敗變質,而且具有防癌、抗衰老等功效[1-3]。根據甲基的數目和位置的不同,天然維生素E分為α-VE、β-VE、γ-VE和δ-VE4種同分異構體,其中α-VE生理活性最強,β-和γ-VE次之,δ-VE幾乎沒有活性[4]。有研究表明,不同種類植物油中VE含量有較大差異,可作為植物油類別的指紋圖譜用于植物油的鑒別和質量控制[1,5]。因此,如何快速、準確分析測定植物油中VE的種類及含量,對油脂摻偽、品質評價及質量控制至關重要。

表1 色譜柱信息及流動相Table 1 Mobile phase and information of columns

關于植物油中VE組分及其含量的研究報道較多,包括電化學法[6-7]、熒光光譜法[8-9]、氣相色譜串聯質譜法[10]、超臨界流體色譜法[11-12]和高效液相色譜串聯質譜法[13],由于反相液相色譜-熒光檢測法具有較高的穩定性、靈敏度以及較低的檢測成本,目前已成為VE分離分析的主流方法[14-16]。在眾多相關研究中,未見對VE異構體在不同固定相上的保留特征參數進行系統性的研究,這在一定程度上限制了VE在不同固定相上色譜保留的特征,以及進一步對VE組分進行有效的分離檢測。為了更準確的對VE異構體進行分離及定量,本文基于超高效液相色譜-熒光檢測器,系統研究了不同固定相(BEH C18以及CSH FL色譜柱)對四種VE異構體的分離效果;通過對四種VE異構體的保留時間(Retention time,tR),分離度(Resolution,R)、拖尾因子(Tailing factor,Tf)以及容量因子(Capacity factor,k)作為指標對其保留特征進行討論,而后對柱溫、流動相及流速等色譜參數的優化,建立了一種高效、靈敏、準確測定不同的VE異構體測定方法,以期為VE的異構體在不同固定相上的保留特征以及植物油的鑒別和質量控制提供技術支持和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

初榨橄欖油(O1-O13)、調和油(T1-T2)、牡丹籽油(M1)、葵花籽油(K1)、大豆油(D1)、菜籽油(C1)、胡麻油(H1-H3)、芝麻油(Z1) 所有植物油樣品均購自本地超市,樣品避光冷藏保存;標準品α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE純度>95%) 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇 均為色譜純;其余試劑如無特殊說明均為分析純。

Acquity UHPLC儀配熒光檢測器 美國Waters公司;MS3渦旋儀 德國IKA公司;3K30冷凍離心機 美國Sigma公司;分析天平(±0.1 mg) 德國Sartorius公司;移液槍(100～1000、20～100 μL) 美國Thermo Electron公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制 標準貯備液:分別精確稱取α-VE、β-VE、γ-VE和δ-VE各5.00 mg,用乙腈溶液準確定容至100 mL容量瓶中,配制成50 mg/L的標準儲備液,4 ℃冷藏待用。

標準工作液:分別準確轉移0.2、2.0、10.0、20.0 mL標準貯備液至100 mL容量瓶中,乙腈準確定容,配制成0.1,1.0,10.0和20.0 mg/L的標準工作液;然后再分別準確轉移0.1 mg/L的標準工作液10.0、5.0和2.0 mL至100 mL容量瓶中,配制成0.01,0.005和0.002 mg/L的標準工作液,4 ℃下冷藏待用。

1.2.2 樣品處理 稱取1.00 g樣品于50 mL聚乙烯管中,加入20 mL乙醇溶液,渦旋2.0 min,放置-20 ℃冰箱冷凍15 min,然后置于2 ℃冷凍離心機中以10000 r/min離心5 min,取上清液1.5 mL,經0.22 μm有機相膜過濾后進樣。整個處理過程避光進行。

1.2.3 UPLC色譜條件 色譜柱信息見表1;熒光檢測器激發波長為300 nm,發射波長為330 nm;柱溫30 ℃,進樣量為1.0 μL;流動相A為乙腈或甲醇;流動相B為水,等度洗脫;使用Empower軟件進行數據處理。

1.3 數據處理

2 結果與分析

為了深入研究維生素E異構體在不同固定相上的保留特征,本研究以四種VE異構體在不同固定相上的tR,R、Tf以及k的變化為指標,評價VE異構體的色譜保留特征。

2.1 BEH C18固定相下不同流動相及溫度對異構體保留特征的影響

傳統C18色譜柱由于鍵合技術及是否封尾從而直接影響色譜分離的穩定性、重現性、pH范圍以及極性和/或堿性化合物的保留。亞乙基橋雜化(Ethylene Bridged Hybrid,BEH)顆粒技術是UPLC填料的主流技術,通過鍵合C18基團并經末端封尾,是UPLC分離中的通用型色譜柱。研究表明,BEH C18相較于傳統C18而言,它們采用三鍵鍵合化學,不僅具有較低的鍵合相流失,且能在pH1～12的范圍內使用,同時保證極性和/或堿性化合物較好的峰形及保留[17]。色譜分離條件見表1,當流動相分別為乙腈-水(9∶1,v/v)和甲醇-水(9∶1,v/v)時,四種VE異構體的分離見圖1。

圖1 BEH C18固定相下不同有機相分離四種維生素E異構體標準色譜圖Fig.1 Separation of four vitamin E isomers by differentorganic phases under BEH C18 stationary phase注:A:甲醇-水;B:乙腈-水。

由圖1可知,BEH C18固定相在VE異構體保留上和傳統C18固定相相同,β和γ-維生素E不能分離,且柱溫在35 ℃時,作為質子供體的甲醇和非質子供體的乙腈分別為流動相時,目標物保留時間改變分別為0.41、0.60和0.36 min,這說明目標物在保留過程中,流動相是否為質子供體,對目標物的保留影響不大。為了更好地研究BEH C18在不同溫度及流動相下的保留特征,本試驗以甲醇和乙腈分別作為流動相,柱溫變化范圍為30 ℃～50 ℃,以保留時間(tR)、分離度(Rs)、拖尾因子(Tf)及容量因子(k)為指標對VE異構體的保留特征進行研究,見表2。

由圖1和表2可知,隨著溫度的升高,無論使用甲醇或者乙腈,β-VE和γ-VE均不能進行有效分離,目標物的Tf在1.14～1.46之間,基本滿足色譜對稱性的要求(0.9

2.2 CSH Fluoro-Phenyl固定相下不同溫度及流動相對異構體保留特征的影響

表面帶電雜化顆粒(Charged Surface Hybrid,CSH)技術下的氟苯基柱(CSH Fluoro-Phenyl)由于氟苯基的存在,帶有低水平的表面電荷,提高樣品負載量的同時保持了峰的對稱性,在分離過程中具有偶極-偶極作用、芳香性(π-π)作用和疏水作用等多種保留機理,不僅對位置異構體、鹵代化合物和極性化合物具有優異選擇性,且可增強對酸性化合物的保留[19-20]。色譜分離條件見表1,當流動相分別為乙腈-水(7∶3,v/v)和甲醇-水(7∶3,v/v)時,四種VE異構體的分離見圖2。

表2 不同溫度及流動相時的tR,k,Rs,Tf和NTable 2 tR,k,Rs,Tf and N at different temperature and mobile phase

注:n.a:未響應;表3、表6同。

圖2 CSH Fluoro-Phenyl固定相下不同有機相分離四種維生素E異構體標準色譜圖Fig.2 Separation of four vitamin E isomers by different organic phases under CSH Fluoro-Phenyl stationary phase注:A:甲醇-水;B:乙腈-水。

為了更好的研究CSH Fluoro-Phenyl在不同溫度及流動相下的保留特征,本試驗同樣以具有質子供體的甲醇和非質子供體的乙腈作為流動相,柱溫變化范圍為30～50 ℃,tR、Rs、Tf及k為指標對VE異構體的保留特征進行研究,見表3。

表3 不同溫度及流動相時的tR,k,Rs,Tf和NTable 3 tR,k,Rs,Tf and N at different temperature and mobile phase

由圖2和表3可知,CSH Fluoro-Phenyl為固定相時,當使用質子供體的甲醇和非質子供體的乙腈時,由于在分離過程中存在偶極-偶極作用、芳香性(π-π)作用和疏水作用等作用力,使得四種VE異構體的保留特征有著很大的區別。隨著溫度的升高,使用甲醇-水為流動相時,β和γ-VE能夠達到部分分離,分離度在0.39～0.55之間,當溫度達到50 ℃時,β-VE和γ-VE重合。此外,目標物的Tf在0.68～3.71之間,特別是溫度為50 ℃,甲醇-水為流動相時γ-VE的Tf達3.71,這可能是由于固定相上存在多種保留機理,且較高的溫度增加了目標物的二次吸附,導致拖尾[21,23]。再者,當使用甲醇-水為流動相時,目標物tR是乙腈-水為流動相時的3.7～6.2倍,且β-VE和γ-VE部分分離。k隨著溫度的升高,使用甲醇-水為流動相時,δ-VE、β-VE和α-VE的平均k值分別是乙腈-水為流動相時的5.65、6.16和6.57倍,這說明甲醇-水為流動相時,CSH Fluoro-Phenyl固定相對目標物具有較強的保留能力。由此可以看出,使用CSH Fluoro-Phenyl為固定相時,甲醇-水作為流動相,因為多種保留機理共同的作用,對四種VE的保留能力具有較大的影響[21]。

2.3 BEH C18及CSH Fluoro-Phenyl固定相的比較

通過2.1和2.2節分別對VE異構體在BEH C18及CSH Fluoro-Phenyl固定相上保留行為的研究可知,BEH C18在乙腈和/或甲醇作為流動相時,VE異構體的保留行為并未得到較大的改變,β-VE和γ-VE不能進行分離,這是因為鍵合的C18主要具有較強的非極性作用,且固定相、目標物以及流動相之間的作用力主要為疏水作用力[23]。而使用CSH Fluoro-Phenyl固定相作為色譜柱時,雖然乙腈-水作為流動相時,溫度的改變對VE異構體的保留影響不大,但是甲醇-水作為流動相時,就VE異構體的tR而言,目標物的tR是乙腈作為流動相時的3.7～6.2倍,這主要是由于甲醇作為質子供體,與鍵合相氟苯基作用力增加,且由于氟苯基的存在,固定相、目標物以及流動相之間除了疏水作用外,還存在偶極-偶極作用、芳香性(π-π)作用等多種分子間作用力,對于異構體具有較強的分離能力,故β和γ-VE有了部分分離[22]。雖然CSH Fluoro-Phenyl固定相在甲醇-水作為流動相時對β-VE和γ-VE有一定的分離能力,但是較高的保留時間,嚴重的拖尾現象以及β-VE和γ-VE僅有的部分分離,影響VE的檢測靈敏度及γ-VE定量的準確性[24]。鑒于此,本文僅將CSH Fluoro-Phenyl與傳統BEH C18作為不同固定相對VE保留行為的影響進行對比,后續研究將以BEH C18作為固定相進行方法學考察及實際樣品的檢測研究。

表4 維生素E異構體的線性范圍及檢出限Table 4 Linear range and detection limit of vitamin E isomer

表5 回收率實驗結果(n=6,%)Table 5 Results of recovery tests

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍和最低檢出限 取標準儲備液,稀釋成5個濃度梯度,按優化后色譜條件進行測定,并繪制樣品濃度(橫坐標x,mg/L)與峰面積(縱坐標y,AU)標準曲線,進行線性回歸分析,且當S/N為3和10時,該方法的最低檢出限(LOD)及定量限(LOQ)如表4所示。結果表明,使用該方法對目標物的檢測,在線性范圍內具有良好的線性(r>0.9993),均能滿足對植物油中VE異構體檢測的要求。

2.4.2 樣品加標回收率和精密度 在空白樣品中添加高、中、低濃度的VE標準溶液,渦旋2.0 min后靜置10 min,按1.2.2進行樣品前處理,按1.2.3所述的色譜條件測定,以濃度值計算加標回收率。每一添加濃度樣品重復測定6次來計算其精密度。結果見表5,結果顯示,加標回收率在82.34%～105.17%之間,相對標準偏差(RSD)在1.7%～3.8%之間。

2.5 實際樣品的測定

取所收集的23批次植物油樣品,準確稱取1.00 g,按1.2.2進行樣品處理,按1.2.3所述的色譜條件進樣分析,重復3次,計算VE的含量,若VE含量超出線性范圍,則使用乙腈對樣品進行相應的稀釋處理,結果見表6;部分植物油樣品色譜圖見圖3～圖6。

圖3 大豆油樣品色譜圖Fig.3 Chromatography of soybean oil sample

圖4 橄欖油樣品色譜圖Fig.4 Chromatography of the olive sample

表6 植物油樣品中維生素E的含量Table 6 Contents of vitamin E in oil samples

圖5 菜籽油樣品色譜圖Fig.5 Chromatography of the colleseed oil

圖6 牡丹籽油樣品色譜圖Fig.6 Chromatography of the Peony seed oil sample

由表6可以看出,所分析的23批植物油中,大豆油含有較高的δ-VE和β+γ-VE,含量分別達109.61和131.19 mg/L,調和油和菜籽油的VE含量相近,δ-VE、β+γ-VE和α-VE分別為6.01～6.32、69.26～69.99和38.50～43.31 mg/L之間;對于葵花籽油,牡丹籽油、芝麻油和胡麻油而言,葵花籽油具有較高的α-VE,但牡丹籽油和芝麻油中β+γ-VE卻較高,胡麻油中β+γ-VE和α-VE含量高于δ-VE;作為果肉油的橄欖油,α-VE含量范圍達103.39～304.54 mg/L,遠高于β+γ-VE和δ-VE的含量,甚至部分橄欖油中未能檢出δ-VE。由此可推斷果肉油為代表的橄欖油與種子油中VE異構體含量有明顯的差別。

3 結論

本研究利用RP-UPLC作為表征手段,以BEH C18和CSH Fluoro-Phenyl作為兩種不同的固定相,通過Rs、Tf及k為指標對目標物保留特征進行評價,研究目標物在不同的色譜柱溫度(30、35、40、45、50 ℃)及不同的有機相(甲醇和乙腈)下的保留特征。結果表明,甲醇為有機相,CSH Fluoro-Phenyl為固定相時,就VE異構體的tR而言,目標物的tR是乙腈作為流動相時的3.7～6.2倍,這主要是由于甲醇作為質子供體,以及固定相自身具有偶極-偶極作用、芳香性(π-π)作用等多種分子間作用力,對于異構體具有較強的分離能力,故β-VE和γ-VE有了部分分離。其余固定相及色譜條件均未有明顯選擇性差異。此外,利用BEH C18為固定相,乙腈為流動相對不同來源植物油進行了含量測定,方法學參數表明該方法可以滿足植物油中VE的快速、準確、高通量的檢測。通過不同植物油中的VE異構體含量的比較,果肉油為代表的橄欖油與種子油中VE異構體含量有明顯差別,研究方法可為橄欖油等植物油摻偽鑒別提供依據及參考。