小分子阿膠肽的免疫調節作用

梁 榮,樊 琛,李 燕,曾慶華,劉 冉,郭興峰

(聊城大學農學院,山東聊城 252000)

阿膠(Collacoriiasini)為馬科動物驢(EquusasinusL.)的干皮或鮮皮經煎煮、濃縮制成的固體膠,與人參、鹿茸并稱為滋補三寶,始載于《神農本草經》[1]。阿膠含明膠、蛋白質、微量元素等多種有效成分,具有抗疲勞、抗氧化、增強免疫、促進造血功能等多種功效[2-5]。

目前,通常采用直接加入阿膠原粉的方式制成阿膠制劑,如口服液、泡騰片、軟膠囊等[6-7]。阿膠蛋白需要經蛋白酶降解為小分子肽后才能被吸收,但對于脾胃虛弱、消化能力低下的人群,直接服用阿膠或其制劑不但給胃腸帶來較大負擔,而且阿膠的功效也得不到充分發揮[8]。因此,通過可控酶解技術將阿膠水解成小分子肽,能夠有效增強阿膠的生物利用度[9-10]。近代科研工作者運用現代化技術手段,對阿膠化學成分、功效物質、藥理作用及質量標準等進行了多方面的探討和研究,并取得了顯著的研究成果[11-14]。然而,長期以來受到技術條件和傳統思想的限制,阿膠的很多功效還未得到足夠的現代科學理論和實驗的證實。特別是在調節機體免疫功能方面,雖然已經有相關的實驗研究報道,但是研究內容不夠充分[15-16]。黃宏軼等[17]研究發現參苓阿膠復方膏對氣虛體質小鼠免疫調節能力具有改善作用;李志等[18]研究發現阿膠口服液能提高小鼠的細胞免疫和體液免疫功能。關于阿膠免疫調節的研究多集中在一些阿膠制劑的生理活性方面,并且這些研究對阿膠免疫調節機制的研究并不深入。

因此,本研究以小分子阿膠肽(LMWPC)為實驗對象,通過研究LMWPC對小鼠體液免疫及細胞免疫兩方面的影響,深入探討和解析LMWPC對機體免疫功能的調節機制,為阿膠新型制劑及保健品的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小分子阿膠肽(LMWPC,MW<1000 Da) 東阿阿膠股份有限公司;SPF級健康ICR雌性小鼠,體重18～22 g 實驗動物合格證號SCXK(京)2012-0001,北京維通利華實驗動物技術有限公司;動物飼料(許可證號:SCXK(京)2014-0008) 北京華阜康生物科技股份有限公司;Yac-1細胞 山東省醫學科學院;INT、PMS、NAD、Giemsa染液 美國Sigma公司;0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液、Hanks液、SA緩沖液、PBS緩沖液、1% NP40、RPMI1640培養液 美國Gibco公司;YAC-l細胞、綿羊紅細胞(SRBC)、補體(豚鼠血清)、ConA、小牛血清、都氏試劑 杭州四季青生物材料有限公司;其他試劑 均為分析純。

上海晟聲K1301 K1302半自動凱氏定氮儀 上海雙旭電子有限公司;Waters 1515 GPC凝膠色譜儀 美國Waters公司;SPECTRAMAX plus 酶標儀 美國MD公司;PL203 型電子天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;Thermo 3111 CO2培養箱 美國Thermo公司;SW振蕩水浴槽 優萊博技術(北京)有限公司;Sorvall ST8R高速冷凍離心機 美國Thermo公司;BDS-300倒置生物顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質含量的測定 采用凱氏定氮法測定LMWPC中的蛋白質含量[19]。樣品消解:用電子天平分別稱取0.1 g硫酸銅、3 g硫酸鉀、0.3 g粉末樣品、10 mL硫酸加入定氮管中,放入消解爐逐漸升溫至400 ℃待內容物全部炭化,泡沫全部停止后,液體變成澄清透明藍綠色后繼續加熱30 min,停止加熱,冷卻取出。定氮蒸餾:用半自動凱氏定氮儀進行定氮蒸餾,經計算確定蒸餾參數,稀釋水量為10 mL、硼酸體積為10 mL、加堿體積為30 mL、蒸餾時間為210 s、淋洗水量為8 mL。鹽酸滴定:選用濃度為0.1 mol/L鹽酸對吸收氨氣后的硼酸溶液進行滴定,利用滴定管記錄滴定體積。

蛋白質含量(g/100 g)=(V1-V2)×C×0.0140×6.25×100/(M×10/100)

式中:V1是滴定時消耗鹽酸的量(mL);V2是空白實驗所消耗的鹽酸量(mL);C是鹽酸標準液濃度(mol/L);M是樣品質量(g);6.25為氮換算為蛋白質的平均系數。

1.2.2 分子量分布的測定 應用高效凝膠色譜法對LMWPC的分子量(MW)分布進行測定[20]。色譜柱:TSKgel 2000 SWXL;流動相:乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1 (v/v);流速:0.5 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量:10 μL,分別以乙胺酸-乙胺酸-乙胺酸(MW=189)、乙胺酸-乙胺酸-酪氨酸-精氨酸(MW=451)、桿菌酶(MW=1450)、抑肽酶(MW=6500)、細胞色素C(MW=12500)5種樣品為標準品。

1.2.3 實驗動物分組與給藥 小鼠在溫度20～22 ℃,相對濕度45%～65%環境中飼養,適應飼養7 d,適應期內小鼠自由攝食和取水,適應期結束后按體重采用隨機區組設計分組法分為五組,即對照組、免疫一組(血清溶血素測定)、免疫二組(進行抗體生成細胞檢測)、免疫三組(遲發型變態反應實驗)和免疫四組(小鼠脾淋巴細胞轉化實驗)。阿膠人體推薦量為每天2.1 g/60 kg·bw[21],實驗設計低、中、高三個劑量組,即0.18、0.35、1.05 g/kg·bw,三組劑量分別相當于人體推薦攝入量的5倍、10倍、30倍(每小組均為6只小鼠)[22]。以蒸餾水為溶劑將樣品分別配至所需濃度,同時設立蒸餾水溶劑對照組,按每天0.2 mL/10 g·bw連續經口灌胃30 d 后,測各項免疫指標。

1.2.4 血清溶血素測定 實驗結束前5 d,小鼠腹腔注射綿羊紅細胞(SRBC),摘眼球取血,離心取血清稀釋100倍,進行半數溶血值(HC50)測定。實驗組加入稀釋后的血清100 μL,對照孔加入100 μL SA 緩沖液(5倍稀釋),而后依次加入 50 μL 10% SRBC和100 μL補體。37 ℃恒溫水浴鍋中反應30 min后,離心 5 min(1500 r/min)取上清液50 μL,加入150 μL都氏試劑,半數溶血孔設置為12.5 μL 10%(v/v)SRBC,加入200 μL都氏試劑。采用微量振蕩器混合均勻,靜置 10 min 后,應用酶標儀測定540 nm波長處的光密度值[23]并依據如下公式計算其HC50。

HC50=樣品光密度值/SRBC半數溶血光密度值×稀釋倍數

1.2.5 抗體生成細胞檢測 根據Jerne改良玻片法檢測抗體生成細胞[24]。SRBC免疫后的小鼠頸椎脫臼處死,取出脾臟制備脾細胞懸液。將表層培養基加熱溶解后,50 ℃水浴保溫,與等量pH7.2～7.4的2倍濃度Hank’s液混合,并分裝于小試管(每管0.5 mL)。向管內加入50 μL 10% SRBC,20 μL 脾細胞懸液(5×106個/mL)迅速混勻,而后傾倒于玻片上做平行片。待瓊脂凝固后,將玻片水平扣放在片架上,放入CO2培養箱溫育1.5 h,加補體后繼續溫育1.5 h后,計數溶血空斑數。

1.2.6 遲發型變態反應(DTH) 實驗結束前5 d,小鼠腹腔注射2%(V/V)綿羊紅細胞(SRBC),致敏后4 d測量左后足距厚度,然后在測量部位皮下注射20%(VN)SRBC,每鼠注射20 μL,注射后24 h測量左后足距部厚度,同一部位測量三次,取均值。以攻擊前后足蹈厚度差值(足距腫脹度)來表示DTH的程度[25]。

1.2.7 小鼠脾淋巴細胞轉化 無菌環境下取出小鼠脾臟,置于裝有 5 mL Hank’s 液(無菌)的平皿中,并將紗布置于脾臟上方,用一次性注射器內芯,輕微用力將脾臟磨碎,制備脾細胞懸液。用Hanks液洗2次,每次離心10 min(1000 r/min),將細胞懸浮于1 mL RPMI1640完全培養液中,調整細胞濃度為 3×l06個/mL。將細胞懸液分兩孔加入24孔培養板中,每孔1 mL,一孔加入75 μL ConA液,另一孔作為對照,置于5% CO2、37 ℃培養箱中培養72 h。培養結束前4 h,每孔吸取上清液0.7 mL,加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培養液,同時加入MTT 50 μL,繼續培養4 h。培養結束后,每孔加入l mL酸性異丙醇,吹打均勻使紫色結晶完全溶解,在570 nm波長處測定OD值,以加 ConA孔的OD值減去不加ConA孔的OD值表示淋巴細胞增殖能力[26]。

1.3 數據處理

實驗均重復3次以上,以Excel軟件建立數據庫,使用SPSS軟件中Dunnett檢驗方法進行統計分析,實驗結果用平均值±標準差表示,顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 小分子阿膠肽(LMWPC)蛋白質含量及分子量分布的測定結果

采用凱氏定氮法測定了LMWPC中的蛋白質含量,結果顯示LMWPC中的主要成分為蛋白質,含量高達(88.84±1.77) g/100 g。應用高效凝膠色譜法對小分子肽分子量(MW)分布進行測定,獲得LMWPC的分子量分布如圖1所示。測定標準品的出峰時間(如圖2所示),用各自標準樣品的分子量取對數的lgMw并與保留時間作圖得到線性關系,回歸方程為:y=-0.227x+6.991,R2=0.963。根據標準曲線測定結果,經回歸方程計算發現LMWPC的分子量絕大部分分布在1000 Da以下,并由4個主要片段組成,由右向左四個峰對應的分子量分別為:66、105、223和581 Da。

圖1 小分子阿膠肽的高效凝膠色譜圖Fig.1 High performance gel chromatogram of LMWPC

圖2 標準樣品的高效凝膠色譜圖Fig.2 High performance gel chromatogram of standard samples

LMWPC是以阿膠為原料,使用現代生物酶解技術,將傳統阿膠大分子蛋白或多肽,進行進一步的水解,使其分子量進一步減小,以期減弱阿膠的滋膩之性[27]。經本研究的測定發現,LMWPC不但蛋白質含量豐富,而且酶解后的相對分子量分布在1000 Da以下。分子質量的降低使阿膠具有較好的溶解性,減輕了阿膠的滋膩性,使機體更容易消化吸收,從而提高了阿膠的生物利用度[28]。劉元濤等[29]研究發現經仿生酶解后的阿膠<3000 Da的小肽含量增加、分子量降低,且仿生酶解后的阿膠比普通阿膠具有更好的提高小鼠抗缺氧能力、游泳時間、胸腺和脾臟指數以及耐寒能力的效果。

2.2 小分子阿膠肽(LMWPC)對小鼠血清溶血素水平的影響

研究表明,阿膠能夠顯著提高血液白細胞水平,從而提高機體的免疫能力[30]。小分子阿膠為阿膠水解物,同樣具有良好的免疫調節功能。血清溶血數(半數溶血值,HC50)和抗體生成細胞檢驗(溶血空斑實驗是體外檢測單個抗體形成細胞B淋巴細胞)的測定常被用來檢測機體體液免疫的功能狀態[31]。LMWPC對小鼠血清溶血素水平的影響如圖3所示,高劑量組(1.05 g/kg·bw)小鼠的半數溶血值(HC50)與對照組(63.6±5.5)比較差異性極顯著(P<0.01),可達76.8±4.2;低劑量組和中劑量組的小鼠HC50分別為69.3±4.1和68.6±5.7,與對照組相比差異顯著(P<0.05)。該實驗結果表明LMWPC能明顯增加小鼠血清溶血素水平,對小鼠的體液免疫功能有增強作用。崔金玉[32]研究發現阿膠丁、蛤粉炒阿膠珠和微波制阿膠珠都可以提高正常小鼠巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數,同樣證明阿膠可以提高小鼠的免疫能力。

圖3 小分子阿膠肽對小鼠血清溶血素水平的影響Fig.3 Effect of LMWPC on the rite ofblood serum hemolysin in mice注:*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05);**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01);圖4～圖6同。

2.3 小分子阿膠肽(LMWPC)對小鼠脾細胞抗體生成的影響

圖4為LMWPC對小鼠脾細胞抗體生成的影響結果,小分子阿膠低聚肽0.35 g/kg·bw中劑量組小鼠的溶血空斑數(×103/全脾)與對照組比較差異性顯著(P<0.05);低、高劑量組小鼠的溶血空斑數與對照組的差異均無顯著性(P>0.05),這可能是由于低劑量下的LMWPC對小鼠脾細胞抗體生成的影響不顯著,而高劑量的LMWPC抑制小鼠脾細胞抗體生成導致的。實驗結果表明,中劑量(0.35 g/kg)的LMWPC顯著增加了空斑的形成,進一步促進B細胞的轉化,促進B細胞產生抗體,增強機體的體液免疫功能。付英杰等[33]研究表明,不同給藥途徑的阿膠低肽均可顯著增加模型小鼠脾重指數,表現出一定的免疫增強作用。盧艷等[22]研究發現阿膠棗能夠調節小鼠體液免疫功能,調節小鼠巨噬細胞吞噬能力,同時不同劑量的阿膠棗未見免疫抑制現象。LMWPC源于阿膠,在某種程度上能夠代表阿膠的功能活性,因此本研究的實驗對象LMWPC和阿膠棗均表現出了類似的免疫調節能力。

圖4 小分子阿膠肽對小鼠脾細胞抗體生成的影響Fig.4 Effect of LMWPC on hemolytic antibody in mice

2.4 小分子阿膠肽(LMWPC)對小鼠遲發型變態反應(DTH)的影響

狹義的細胞免疫(cellular immunity)僅指T細胞介導的免疫應答,其特征是出現以單核細胞浸潤為主的炎癥反應和/或特異性的細胞毒性[34]。廣義的細胞免疫還包括原始的吞噬作用以及NK細胞介導的細胞毒作用。細胞免疫是清除細胞內寄生微生物的最為有效的防御反應,也是排斥同種移植物或腫瘤抗原的有效手段[35]。小鼠遲發型變態反應實驗和ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化的測定常被用來檢測細胞免疫的功能狀態[18]。圖5為LMWPC對小鼠DTH的影響結果,由圖5可知對照組小鼠足趾腫脹為(0.27±0.06) mm,低劑量組小鼠足趾腫脹與對照組比較無顯著性差異;中、高劑量組小鼠足趾腫脹分別為(0.34±0.07) mm和(0.35±0.03) mm,與對照組相比差異極顯著(P<0.01),因此0.35 g/kg中劑量組和1.05 g/kg高劑量組LMWPC對SRBC誘導的小鼠足趾腫脹厚度具有明顯增強作用。由于SRBC是細胞免疫的誘導劑,實驗組小鼠足趾腫脹程度的增加,說明LMWPC能夠通過增強機體的細胞免疫功能而增加足趾的腫脹。張珣等[36]研究表明,阿膠同樣能夠增加小鼠血清溶血素含量,增強小鼠的遲發型變態反應和脾淋巴細胞的增殖能力;并且能顯著提升免疫低下模型小鼠的胸腺指數、小鼠腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬率和吞噬指數;還能調節血清中免疫細胞因子的水平,表明阿膠對小鼠特異性及非特異性免疫機能具有顯著調節作用。

圖5 小分子阿膠肽對小鼠遲發型變態反應(DTH)的影響Fig.5 Effect of LMWPC on thedelayed hypersensitivity in mice

2.5 小分子阿膠肽(LMWPC)對小鼠脾淋巴細胞轉化的影響

LMWPC對小鼠脾淋巴細胞轉化的影響結果如圖6所示,實驗小鼠經口灌胃LMWPC 30 d后,與對照組OD值(0.253±0.082)比較,低劑量組OD值(0.280±0.074)和中劑量組OD值(0.315±0.067)小鼠的脾淋巴細胞轉化差異均無顯著性(P>0.05);而高劑量組(OD值0.344±0.052)對小鼠脾淋巴細胞的增殖能力最強,差異極顯著(P<0.01)。因此,1.05 g/kg高劑量LMWPC能夠明顯增加脾淋巴細胞的成熟,從而促進T淋巴細胞介導的細胞免疫反應,最終增強機體的免疫功能。安夢培等[37]發現阿膠能顯著提高免疫低下小鼠的體液免疫和細胞免疫,提高CD3+、CD3+CD4+陽性細胞比例,但是對非特異性免疫無明顯影響。巢警殳[38]研究發現林蛙皮生物活性肽能夠提高誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖能力和ConA誘導的小鼠遲發型變態反應能力,具有增強機體細胞免疫功能。小分子阿膠肽與林蛙皮生物活性肽均來源于動物皮,因此可能均有相似的免疫調節功能。

圖6 小分子阿膠肽對小鼠脾淋巴細胞轉化的影響Fig.6 Effect of LMWPC on theblastisation of spleen lymphocyte in mice

3 結論

本研究通過凱氏定氮及分子量分析實驗證明LMWPC的蛋白質含量豐富,分子量主要集中在1000 Da以下;利用小鼠免疫實驗模型,發現LMWPC能夠通過增加小鼠血清溶血素水平、增加小鼠脾細胞抗體生成、增強小鼠遲發型變態反應和促進小鼠脾淋巴細胞轉化增殖,提高小鼠的體液免疫及細胞免疫功能,對小鼠的免疫功能有正向調節作用。本研究為LMWPC及相關系列食品的開發提供科學依據。