人體乳腺礦化集合體類型與臨床相關性分析

張 巖，李 艷，程 瀟，魯安懷，王長秋，梅 放，柳劍英，王大翠

(1. 礦物環境功能北京市重點實驗室， 北京大學， 北京 100871； 2. 北京大學醫學部 基礎醫學院病理學系，北京 100083； 3. 鐘祥市人民醫院病理科， 湖北 鐘祥 431900)

人體礦化可分為生理性礦化(功能性礦化)和病理性礦化。功能性礦化包括具有支撐人體結構功能的骨和具有咀嚼功能的牙齒等(Carlinfanteetal., 2003；Boskeyetal., 2007；Boonrungsimanetal., 2012)。病理性礦化與多種人體疾病相關，醫學上通常描述為鈣化、鈣沉著或結石(韓志江，2012)，可出現在人體各個部位的病變中，包括腦膜瘤(楊若晨等， 2008)、甲狀腺癌(趙文雯等， 2009)、乳腺癌(孟繁露等， 2013)、卵巢癌(熊翠娥等， 2011)、心血管疾病(朱梅倩等， 2011)等，其中一些特殊結構礦化已成為醫學影像學手段進行腫瘤診斷的重要輔助手段(Hakaetal., 2002； Stone and Matousek, 2008)。

乳腺中的礦化作為乳腺癌早期診斷的重要指標，在X射線檢查、超聲檢測、CT和核磁共振中得到了充分的運用(Lingetal., 2013)。其中乳腺X射線檢查通過對乳腺微礦化的形態和分布進行系統的分類和界定，現已成為最重要的乳腺癌篩查項目(Gümüetal., 2013)。活檢樣品X光片中有礦化的病例診斷正確率高達99%，明顯高于無礦化組的87%(Katsamenisetal., 2012)。調查發現，該種手段在50歲以下年齡段中存在較高的漏診率(67%)，部分學者推測原因為50歲以下患者的腫瘤生長較快，未產生礦化(Tseetal., 2008)。在乳腺X射線的微礦化形態觀察及分布區域界定時，受制于常規X光檢查的分辨率(Bakeretal., 2007)，對于直徑小于500 μm的可疑礦化與乳腺病變的關系當前仍缺乏探討。隨著學界對于乳腺影像檢查漏診率進一步降低的需求，以及現代影像學檢測儀器分辨率的不斷提高與功能的不斷完善，500 μm以下可疑礦化物特征與乳腺病變的相關性則成為提高乳腺疾病早期檢出率與診斷準確度的關鍵問題。

現代礦物學研究手段可在微納尺度上對礦化物的形貌分布、化學組分和晶體結構進行精細研究。當前，針對人體礦化這一交叉領域的研究，前人已從醫學或礦物學單一維度進行了深入系統的研究(Reinholzetal., 2001； C?lfen, 2010； 崔福齋， 2012； Coxetal., 2012)，在此基礎上，將重要的醫學指標年齡、疾病類型和腫瘤良惡性與礦物學500 μm以下顯微形貌分類統計數據相結合，可對乳腺疾病臨床影響診斷數據進行更加科學完善的分類，以便為探究鈣化在乳腺疾病中的成因以及為乳腺癌臨床精細診斷提供依據。

本文通過礦物形態學研究手段，對乳腺增生癥、乳腺炎癥、乳腺纖維腺瘤以及乳腺癌等123例乳腺良、惡性疾病開展了組織礦化的分類研究，統計計算了不同礦化集合體形態在不同患者年齡、不同疾病類型以及不同癌變階段的比率，探討了不同類型礦化集合體形貌差異及其對乳腺疾病良惡性的指示意義，為未來乳腺疾病醫學影像學精確診斷提供參考。

1 材料與方法

從北京大學第三醫院和湖北鐘祥人民醫院病歷庫中所存的2010年1月至今的所有與鈣化相關的乳腺標本(以下各章樣品來源同此)篩選出乳腺礦化病例共123例，患者年齡分布從21歲到86歲不等，平均年齡為50.0±12.3歲。其中乳腺癌77例(包括Tis期7例、T1期16例、T2期28例、T3期22例、其它4例無臨床分期信息)，乳腺纖維腺瘤31例，乳腺增生癥8例，乳腺炎癥7例。在TNM腫瘤分期標準中，Tis期代表原位癌，而乳腺浸潤性癌可根據腫瘤大小劃分為T1期(癌瘤長徑≤2 cm)、T2期(癌瘤長徑2～5 cm)和T3期(癌瘤長徑>5 cm)。用Leica超薄切片機對上述石蠟包埋樣品塊進行連續切片。對于每一例樣品，取1張4 μm薄片制成普通蘇木素-伊紅(HE)玻片，1張10 μm薄片置于20 mm×20 mm硅片上制成硅質薄片，用于原位觀察。利用北京大學物理學院場發射環境掃描電鏡Quanta 200和北京大學地球與空間科學學院場發射環境掃描電鏡Quanta 600進行二次電子像和背散射電子像觀察，分辨率為3.5 nm。選取鈣化較多的病例，將數張連續切片置于1.5 mL離心管中，進行分離處理。制樣方法和步驟參見趙文雯等(2009)。病理科制備的蘇木素-伊紅染色切片(HE)中，乳腺組織礦化物呈深染。

利用JEM-2100F高分辨透射電鏡拍攝電子衍射圖像，選區大小約為200 nm×200 nm，使用measureIT軟件對衍射環半徑進行測量，計算出晶面間距，根據碳羥磷灰石(PDF#19-0272)或羥基磷灰石(PDF#09-0432)的標準晶面間距進行標定。在北京大學化學與分子工程學院利用NICOLET iN10 MX顯微紅外光譜儀對粉末樣品進行透射模式的顯微紅外測試，分辨率4 cm-1。

通過光學顯微鏡(Nikon LV100 POL)對大量乳腺疾病病例的組織切片進行觀察，按以下標準對乳腺組織礦化進行分類分級。其中，礦化程度分為+/-(僅見極個別小的粒狀礦化，不超過10倍鏡視域的2%)，+(可見少量散在粒狀或不規則塊狀礦化，可占10倍鏡視域的2%～10%)，++(可見較多量粒狀或不規則塊狀礦化，可占10倍鏡視域的10%～30%)及+++(粒體或不規則塊狀礦化極其豐富，可占10倍鏡視域的30%以上)4級。

為考察礦化集合體類型與患者年齡、乳腺疾病類型以及癌變階段的相關性，利用IBM SPSS Statistics 20軟件對樣品數據進行了統計學分析。分析方法為描述性統計中的交叉表，由于存在理論頻數小于5的格子，進行Fisher精確檢驗，雙側精確sig，結果計為p。同步輻射X射線三維成像在北京同步輻射裝置4W1A-X射線成像實驗站進行。使用AB膠將樣品固定在針尖上，置于樣品臺上進行測試。采用大視場模式獲取吸收襯度像，測試能量為8 keV，分辨率100 nm。數據采用XMController軟件進行處理，三維重構后導出逐幀圖像、3D動畫和斷層圖像。

2 結果與分析

2.1 乳腺疾病礦化樣品的病理組織切片分級

通過光學顯微鏡(Nikon LV100 POL)下123例乳腺疾病礦化樣品的病理組織切片觀察，對乳腺組織礦化進行了分類分級。其中，礦化集合體類型分為粒狀、塊狀和兩種混合3組(圖1)：粒狀集合體為小于200 μm的規則粒狀鈣化，少部分有環帶結構；塊狀集合體為大于200 μm的片狀鈣化，或略小于200 μm但形狀非常不規則的鈣化；粒狀塊狀混合集合體，可觀察到兩種集合體，不限于同一視域。

2.2 乳腺疾病礦化集合體的物相組成

采用透射電子顯微鏡(TEM)和傅里葉變換顯微紅外光譜(FTIR)對分離出的礦化集合體粉末進行測試，以確定人體乳腺組織礦化的礦物物相。結果(圖2)顯示乳腺癌礦化、乳腺炎癥礦化和乳腺增生癥礦化的主要物相為碳羥磷灰石，而乳腺纖維腺瘤礦化的主要物相為羥基磷灰石。這兩種礦物物相的主要差別在于(112)等晶面的發育程度。此外，也可觀察到晶體在(002)方向上不同程度的擇優取向，即在各電子衍射圖中呈現為弧形而非完整的衍射環，在乳腺癌礦化中最明顯，在乳腺纖維腺瘤礦化中最不明顯。

2.3 礦化集合體掃描電鏡下分類特征

粒狀與塊狀集合體在掃描電子顯微鏡下的微形貌特征如圖4所示。其中，塊狀集合體較為致密(圖4a～4c)，內部無明顯的特殊結構特征，以不規則礦化為主，集合體附近的膠原上可見明顯的礦化小球(圖4b)。粒狀集合體個體之間的排列則較為松散(圖4d～4f)，之間可見膠原纖維(圖d)相連。無論是塊狀集合體還是粒狀集合體，均無法觀察到明顯的單晶礦物，表明其均為納米礦物集合體。

從集合體個體結構特征來看，粒狀集合體具有明顯的環帶結構，環帶間隙由有機質填充(圖4d，4e)。結合同步輻射X射線三維成像，可以進一步確認在三維空間內具有環帶結構的粒狀集合體圍繞一到兩個核心從內到外生長(圖5)。平面吸收襯度像(圖5a)顯示礦化顆粒中清晰的分層結構，與光鏡和掃描電鏡下觀察結果一致。將旋轉測試獲得的721張平面圖進行三維重構，獲得礦化顆粒的三維高分辨像(圖5b)，顯示顆粒內部殼層在三維空間中的連續性。進一步可獲得平行入射光方向的斷層圖(圖5c)，顯示該顆粒內部有2個核心。由于該粒狀集合體有2個核心，且外部殼層連續，可知其由內向外生長。此外，三維高分辨像(圖5b)清晰地顯示出有環帶結構的粒狀集合體各層之間由有機物進行連接。

圖 1 不同乳腺疾病中的不同類型、不同豐富程度的礦化Fig. 1 Different types and amounts of mineralization in different breast diseases

圖 2 不同乳腺疾病礦化的選區電子衍射圖Fig. 2 Electron diffraction patterns of mineralization in different breast diseases

圖 3 不同乳腺疾病礦化的傅里葉變換顯微紅外光譜Fig. 3 Micro-FT-IR spectra of mineralization in different breast diseases

2.4 礦化集合體類型與患者年齡相關性

將患者年齡按照≤30歲、31～50歲、51～70歲和>70歲分為4個年齡組。統計分析結果(表1)顯示，30歲以下年齡組中塊狀和粒狀集合體占比分別為33.3%和50%；31～50歲年齡組中塊狀和粒狀集合體占比分別為26.9%和53.7%；51～70歲年齡組中塊狀和粒狀集合體占比分別為56.4% 和23.1%；70歲以上年齡組中塊狀和粒狀集合體占比分別為63.6%和27.3%。各年齡組患者的乳腺組織礦化集合體類型差異具有顯著性(p=0.018， <0.05)，隨著年齡增加，塊狀集合體的出現概率增加，粒狀集合體的出現概率減少，敏感分區年齡為50歲；粒狀集合體在50歲以上和50歲以下患者中單獨出現的概率分別為24%和53%。在圖6中可以更為直觀地看出這一差異：50歲以下患者的乳腺組織礦化以粒狀集合體為主(72.6%)，而50歲以上患者的乳腺組織礦化以塊狀集合體為主(76%)。

圖 4 電鏡下的塊狀集合體(a～c)和粒狀集合體(d～f)特征Fig. 4 ESEM images showing the morphology of granular aggregate (a～c) and mass aggregate (d～f)

圖 5 人體乳腺微礦化的同步輻射光源X射線三維成像結果Fig. 5 Three-dimensional imaging results of breast cancer calcificationa—垂直入射光方向的平面圖； b—三維重構圖； c—平行入射光方向的斷層圖a—the plane perpendicular to the incident ray； b—three-dimensional restructuring graph； c—section plane parallel to the incident ray

2.5 礦化集合體類型與乳腺疾病類型相關性

針對不同乳腺疾病類型病例中的乳腺組織礦化集合體類型進行統計學分析，結果(表2)顯示乳腺癌中塊狀與粒狀集合體分別占比46.8%與33.8%；乳腺纖維腺瘤中塊狀與粒狀集合體分別占比25.8%與64.5%；乳腺增生癥中塊狀與粒狀集合體分別占比37.5%與25.0%；乳腺炎癥中塊狀與粒狀集合體分別占比28.6%與42.9%。各礦化集合體類型在乳腺增生癥、乳腺炎癥、乳腺纖維腺瘤以及乳腺癌患者中的分布無顯著差異性(p=0.057， >0.05)。僅考察108例乳腺腫瘤，即乳腺癌(惡性)和乳腺纖維腺瘤(良性)兩個疾病類型組，則礦化集合體類型差異顯著(p=0.016， <0.05)。在圖7中可以更為直觀地看出這一差異：乳腺癌患者中粒狀集合體單獨出現的概率(33.8%)遠遠低于乳腺纖維腺瘤患者中粒狀集合體單獨出現的概率(64.5%)；乳腺癌中出現礦化灶的概率較良性病變中多；在乳腺癌中不同礦化集合體類型分布無明顯差異。

表 1 不同年齡組中乳腺組織礦化集合體類型的比較Table 1 Comparison of types of breast mineralization among different age groups

乳腺疾病類型塊狀粒狀兩種病例數構成比/%病例數構成比/%病例數構成比/%合計p值乳腺癌3646.8 2633.81519.577乳腺纖維腺瘤825.82064.539.731乳腺增生癥337.5225.0337.58乳腺炎癥228.6342.9228.67合計4939.85141.5 2318.7123p=0.057,只考察乳腺癌和乳腺纖維腺瘤p=0.016

圖 7 不同乳腺疾病中礦化集合體類型的比較Fig. 7 Comparison of types of breast mineralization in different breast diseases

2.6 礦化集合體類型與癌變階段相關性

針對不同癌變階段病例中的乳腺組織礦化集合體類型進行統計學分析，結果(表3)顯示乳腺原位癌(Tis期)中塊狀集合體占比71.4%，粒狀集合體占比為0；乳腺浸潤性癌T1期中塊狀與粒狀集合體占比分別為18.8%與43.8%；乳腺浸潤性癌T2期中塊狀與粒狀集合體占比分別為60.7%與21.4%；乳腺浸潤性癌T3期中塊狀與粒狀集合體占比分別為36.4%與54.5%。乳腺原位癌(Tis期)和乳腺浸潤性癌T1、T2、T3期患者的乳腺組織礦化程度差異具有顯著性(p=0.008， <0.05)。在圖8中可以更為直觀地看出這一差異：所有乳腺原位癌礦化均出現了塊狀集合體(100%)， T2期病例中乳腺組織礦化塊狀集合體的出現概率也較高，為78.6%。相對而言，T1和T3期病例中礦化中塊狀集合體出現的概率明顯降低，分別占56.2%和45.5%。粒狀集合體在T3期病例中單獨出現的概率最高，為54.5%。此外值得關注的是，乳腺原位癌病例中不存在僅含有粒狀礦化集合體的情況。

表 3 不同癌變階段乳腺組織礦化集合體類型的比較Table 3 Comparison of types of breast mineralization among different cancer stages

圖 8 不同癌變階段乳腺組織礦化程度的比較Fig. 8 Comparison of types of breast mineralization among different cancer stages

3 討論

3.1 塊狀與粒狀集合體形貌差異

影像學上主要通過鈣化的形態和分布對乳腺鈣化進行分類。例如：可疑鈣化細線樣或細線樣分支狀鈣化描述為細而不規則線樣鈣化，直徑小于500 μm，常不連續，有時也可見分支狀，提示鈣化是由于被乳腺癌侵犯在導管腔內形成，其惡性的陽性預測值約為70%，乳腺影像數據報告系統中分類應為高度可疑惡性但不肯定，建議進行活檢(中國抗癌協會乳腺癌專業委員會， 2015)。病理學上，將具有環帶的尺寸較小的鈣化顆粒稱為砂粒體，導管壞死中成片的鈣化稱為壞死性鈣化。然而這兩種鈣化的分類并不能囊括所有乳腺組織鈣化的形態，對于一些微小鈣化，由于其環帶結構十分模糊，并不符合沙礫體鈣化的定義，而大部分尺寸較大的鈣化并不與壞死組織直接接觸也無法確定其壞死成因，因而不適于統稱為壞死型鈣化。醫學影像學上對于鈣化的最小尺寸界定標準直徑500 μm，醫學影像學上未關注到的微小鈣化在光鏡和電鏡下需要進一步細分。

結合光鏡和掃描電鏡的觀察可以發現，塊狀集合體較為致密，內部無明顯的特殊結構特征，與膠原纖維聯系緊密。塊狀集合體附近，鈣化小球分布較密集；而遠離塊狀集合體的部位，鈣化小球分布較稀疏。塊狀集合體邊緣由鈣化小球堆積而成。成堆的鈣化小球間被絮狀物充填，整體形態已接近塊狀鈣化，但比較松散。鈣化小球直徑約在 0.1～5 μm之間，依附膠原纖維生長。最初觀察到鈣化小球分散并被膠原纖維包圍。在粒狀集合體中，小球形顆粒最終形成致密聚集體，而在塊狀集合體中觀察到的小球形顆粒則相對松散地沉積在礦化和周圍組織之間的邊界處，相對而言，良性組織中塊狀集合體和粒狀集合體的表面比惡性中的表面更平滑。

塊狀與粒狀集合體宏觀的形貌差異一定對應著微觀的礦物組分及結構差異，但在本文中通過對人體乳腺組織微礦化的物相組成進行分析，發現乳腺癌、乳腺炎癥和乳腺增生癥礦化的主要物相均為碳羥磷灰石Ca5[PO4,CO3]3(OH) (CHA， PDF#19-0272)，而乳腺纖維腺瘤礦化的主要物相為羥基磷灰石Ca5(PO4)3(OH)(HA， PDF#09-0432)，但這兩種物相極為相似，其結構上的差異主要由于碳酸根的替代量不同而產生，不同礦物集合體之間并未出現組構上的明顯不同。

3.2 礦化集合體類型對乳腺病變良惡性的指示意義

在病理學觀察實踐中，人體乳腺組織礦化的形態和尺寸的確呈現出一定的差異性，對其中規律的揭示，有利于對病理學診斷提供參考。在文中的分類體系下，可以看出礦化集合體類型與患者年齡、乳腺疾病類型、癌變階段存在一定相關性，總結于表4中。

表 4 礦化集合體類型與患者年齡、病變類型的統計對應關系Table 4 The statistical corresponding relationship between the type of mineralization aggregation and the patient’s age as well as the pathological type

結合鈣化的形貌特征可以判斷，大部分塊狀集合體均一致密，應是鈣化的最終產物，且會隨著沉積時間的持續鈣化物尺寸不斷增大，因此該類礦化集合體在50歲以上患者中出現概率較高，但部分壞死型鈣化也會出現短時間的大量鈣化堆積，因而塊狀結合體在低年齡患者群體中也會出現。乳腺纖維腺瘤中膠原纖維十分豐富，大量礦化小球在膠原上生長，而小球附近的膠原又發生礦化作用，后礦化生成的小球在較早生成的小球上生長，隨著時間的推移，堆積形成了較大的砂粒體顆粒，因而產生塊狀集合體的概率較低。數據結果與上述分析也較為吻合，塊狀集合體更多地出現在50歲以上患者中(58%)，在乳腺原位癌(71.4%)和乳腺浸潤性癌T2期(60.7%)患者中占主導，而粒狀集合體更多地出現在50歲以下患者中(53.4%)，在乳腺纖維腺瘤(64.5%)和乳腺浸潤性癌T1期(43.8%)、T3期(54.5%)患者中占主導。這一輔助診斷標準在病理學診斷中極易推廣使用。在診斷實踐中，如果塊狀集合體出現在50歲以下的患者中，則其患乳腺癌的概率更高，且為乳腺原位癌(Tis)或乳腺浸潤性癌T2期可能性大。此外，由于乳腺原位癌病例中不存在僅含有粒狀礦化集合體的情況(表3)，因此僅觀察到粒狀礦化集合體時，所患癌癥為浸潤性癌可能性大。這一結果對乳腺癌病理學診斷提供了全新的可行性方法，可起到重要的輔助診斷作用。

乳房X射線照相術是早期發現乳腺癌的最有效篩查方法。美國食品藥品監督管理局鼓勵女性做到根據篩查指南或醫師建議，定期接受乳房X射線照相檢查，相對來講，腫瘤早期是最容易治療的階段。但乳房X射線照相術在普查過程中，40～49歲婦女的生存沒有得到改觀，而50～60歲的婦女確能明顯受益于乳房X射線照相術普查。醫學上普遍認為這是由于年輕女性的腫瘤生長較快導致的(張安秦等， 2000)，本文的研究可以較為合理的解釋這一現象，乳腺X射線的分辨率只能識別100 μm以上的鈣化，主要集中在塊狀集合體這一區域，從表4中可以看到塊狀集合體主要出現在50歲以上患者中，占比高達(58%)，因此在這一年齡區間乳房X線普查具有極高的敏感性，漏診率較低。而在發生乳腺纖維腺瘤以及乳腺癌的年輕患者中(小于50歲)，雖然病變過程中也出現了鈣化，但鈣化以粒狀集合體為主(53.4%)，影像學手段無法識別，因此乳房X射線檢查的敏感性較差，漏診率較高。

4 結論

選取乳腺癌、乳腺纖維腺瘤、乳腺增生癥、乳腺炎癥共123例乳腺鈣化樣品，重點探討了乳腺礦化集合體類型與患者年齡，患者乳腺病變類型和癌變階段的關系。其中塊狀集合體更多地出現在50歲以上患者中(58%)，在乳腺原位癌(71.4%)和乳腺浸潤性癌T2期(60.7%)患者中占主導；粒狀集合體更多地出現在50歲以下患者中(53.4%)，在乳腺纖維腺瘤(64.5%)和乳腺浸潤性癌T1期(43.8%)、T3期(54.5%)患者中占主導；乳腺原位癌中不存在僅含有粒狀集合體的情況，觀察到粒狀礦化集合體時，所患癌癥為浸潤性癌可能性大。本研究可為未來乳腺癌的診斷提供基于乳腺礦化精細礦物學特征的輔助新方法。