miR-146a及其靶mRNA與初發Graves病的相關性研究

許 靜， 李 姍， 蔡俊瑋， 黃成虎， 龔 麗， 李 敏， 李雪鋒

Graves病(Graves′ disease,GD)是一種自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune thyroid disease，AITD)[1]。由于目前的治療方法均不能針對其病因進行治療，故復發率高。因此，有必要進一步探索GD的病因及發病機制。微小RNA-146a(micro-RNA-146a，miR-146a)與免疫反應有關的靶mRNA包括白細胞介素1受體相關激酶1/2(interleukin-1 receptor-associated kinase 1/2，IRAK1/2)、腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF-6)、白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、CC趨化因子配體5/8[chemokine(C-C motif) ligand 5/8，CCL5/8]和Fas相關死亡結構域蛋白(Fas-associated protein with death domain，FADD)等[2-6]。本研究通過實時定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)技術檢測初發GD患者與正常人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中miR-146a及其與免疫相關的靶mRNA的表達情況，旨在從轉錄后水平初步探討miR-146a及其靶mRNA與初發GD的相關性。

1 對象與方法

1.1對象 收集2017年9月-2018年8月就診的初發GD患者30例，男性9例，女性17例，年齡(34.30±11.87)歲(16～62歲)。入選標準：(1)有甲狀腺功能亢進(甲亢)的高代謝癥狀和體征；(2)觸診和B超均證實甲狀腺彌漫性腫大；(3)血清游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，FT3)、游離四碘甲狀腺原氨酸(free tetraiodothyronine，FT4)、總三碘甲狀腺原氨酸(total triiodothyronine，TT3)、總四碘甲狀腺原氨酸(total tetraiodothyronine，TT4)均升高，促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)降低；(4)突眼或促甲狀腺激素受體抗體(thyrotropin receptor antibody，TRAb)陽性；(5)年齡14～70歲，性別不限；(6)未進行任何抗甲亢治療；(7)近期無感染史；(8)無甲狀腺危象、甲亢心、淡漠型甲亢、T3型甲狀腺毒癥、妊娠期甲亢等特殊臨床表現及并發癥；(9)無其他嚴重器質性疾病或慢性病史。

同期招募年齡、性別與GD組相匹配的來自體檢中心的健康志愿者26例作為對照組，男性9例，女性17例，年齡(38.40±15.31)歲(18～69歲)。入選標準：(1)血常規、肝腎功能、甲狀腺功能及促甲狀腺受體抗體均正常；(2)無自身免疫性疾病家族史和嚴重器質性疾病；(3)近期無感染史；(4)未使用任何影響免疫功能的藥物。所有患者和志愿者標本采集前均被告知，并簽署知情同意書。兩組的一般臨床資料見表1。

1.2方法

1.2.1主要試劑及儀器 (1)試劑：人外周血淋巴細胞分離液(LTS1077，中國天津灝洋華科生物科技有限公司)；Trizol試劑(15596018，美國Invitrogen公司)；mRNA熒光定量PCR相關試劑(FSQ-301和QPS-201，日本TOBOYO公司)；miRNA熒光定量PCR相關試劑(KR211，FP411和E132-01A，中國TIANGEN公司)；實驗所需mRNA引物采用Primer 5軟件設計，miRNA引物由上海生工總公司在線設計，所有引物均由上海生工武漢分公司合成(表2)。(2)儀器：超凈工作臺(SW-CJ-1FD，中國AIRTECH公司)，PCR儀(C1000 TouchTM)及凝膠成像儀(1708195)(美國BIO-RAD公司)，實時熒光定量PCR儀(QuantStudio5，美國ABI公司)。

表1 研究對象的一般臨床資料

TSH：促甲狀腺激素；FT3：游離三碘甲狀腺原氨酸；FT4：游離四碘甲狀腺原氨酸；TT3：總三碘甲狀腺原氨酸；TT4：總四碘甲狀腺原氨酸；TRAb：促甲狀腺激素受體抗體. TRAb取值上限為30. 與對照組比較，☆☆：P<0.01.

1.2.2標本預處理 收集研究對象清晨空腹新鮮EDTA-K2抗凝靜脈血10 mL，20 ℃，2 000 r/min離心20 min，分離血漿備用，加入0.01 mol/L的PBS(DEPC水配制并高壓滅菌)，于剩余血細胞中稀釋補足至總體積20 mL，并上下顛倒充分混勻，按LTS1077說明書采用密度梯度離心法分離，獲得較純的PBMC，加入1 mL Trizol試劑，混勻，室溫下裂解5 min，轉移至新的無RNA酶的1.5 mL EP管中，并置于-80 ℃冰箱保存，以備提取RNA之用。

1.2.3提取PBMC總RNA 取出用Trizol均質化的PBMC，室溫融化后按Trizol試劑說明書提取總RNA。用Nanodrop 2000檢測RNA濃度及純度，確保OD260/280為1.8～2.0。用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，要求凝膠圖譜中顯示28S，18S及5S 3條帶。檢測合格的產品立即進行逆轉錄或置于-80 ℃冰箱備用。

表2 PCR引物序列

1.2.4miR-146a相對表達水平檢測 按KR211說明書將檢測合格的含有miRNA的總RNA先采用加尾法逆轉錄成cDNA；然后以U6為內參，以RNase-Free水代替cDNA作為陰性對照，按FP411說明書進行熒光定量PCR反應檢測miR-146a的相對表達量。所有反應(包括陰性對照)均設有3個復孔以保證實驗的重復性。逆轉錄及熒光定量PCR反應體系見表3。miRNA逆轉錄的反應條件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min；熒光定量PCR的反應條件：95 ℃ 15 min→5×(94 ℃ 20 s→64 ℃ 30 s→72 ℃ 34 s)→40×[94 ℃ 20 s→60 ℃ 34 s(該過程收集熒光信號)]→溶解曲線分析。

1.2.5miR-146a靶mRNA的相對表達水平檢測 按照FSQ-301說明書將總RNA中的mRNA逆轉錄成cDNA(以5×RT Master Mix Ⅱ no-RT Control代替5×RT Master Mix Ⅱ作為陰性對照)。然后以β-actin為內參，以RNase-Free水及加入5×RT Master Mix Ⅱ no-RT Control的逆轉錄反應液代替cDNA作為陰性對照，按照說明書進行熒光定量PCR檢測靶mRNA表達。所有反應(包括陰性對照)均設有3個復孔以保證實驗的重復性。反應體系見表3；反應條件如下：mRNA逆轉錄反應條件為RNA變性(65 ℃ 5 min→立即置于冰上冷卻)→去除基因組DNA(37 ℃溫育5 min→立即置于冰上冷卻)→逆轉錄反應(37 ℃ 15 min→50 ℃ 5 min→98 ℃ 5 min→4 ℃ hold)。熒光定量PCR反應條件為95 ℃ 1 min→40×(95 ℃ 15 s→延伸45 s)→溶解曲線分析。延伸溫度可根據mRNA引物做適當調整，延伸階段采集熒光值。

表3 miRNA或mRNA的逆轉錄及熒光定量PCR反應體系

1.2.6RT-PCR相對定量基因表達數據分析 采用軟件SDS Relative Quantifacation 7500 software v2.1(美國Applied Biosystems公司)自動計算RT-PCR相對定量表達的平均Ct值及閾值，采用2-ΔΔCt法計算分析各檢測基因的相對表達量。

1.2.7甲狀腺功能及TRAb測量方法 采用化學發光法進行檢測。各指標的正常值范圍分別是：TSH 0.4～5.0 mIU/L，TT3 0.95～2.60 nmol/L，TT4 0.73～84 nmol/L，FT3 2.76～7.65 pmol/L，FT4 10.29～25.70 pmol/L，TRAb 0～1.5 IU/L。

2 結 果

2.1PBMC中miR-146a及其靶mRNA的相對表達水平比較 與對照組比較，初發GD患者的PBMC中，miR-146a，TRAF-6和CCL5的相對表達量顯著下降(P<0.01)；IL-8和CCL8的表達水平顯著上升(P<0.05)；IRAK1，IRAK2及FADD的表達水平差別則無統計學意義(P>0.05)，具體見表4。

表4初發GD和正常人PBMC中miR-146a及其靶mRNA的相對表達水平

Tab 4Relative expression levels of miR-146a and its target mRNA in PBMCs in primary GD patients and healthy controls

檢驗指標對照組初發GD組miR-146a1.01±0.34 0.67±0.19☆IL-80.75(0.30～2.90)2.20(2.04～2.83)☆IRAK11.18(0.45～2.37)0.98(0.74～1.42)IRAK20.99(0.66～1.27)0.81(0.73～0.96)TRAF-61.05±0.340.67(0.53～0.82)☆FADD1.07±0.41 0.94±0.30CCL51.22±0.990.64(0.40～0.86)☆CCL80.85(0.46～3.49)1.90(0.74～5.11)☆

GD:Graves病. 與對照組比較，☆：P<0.01.

2.2miR-146a表達水平與IL-8及CCL8相關性分析 Spearman相關性分析結果顯示，miR-146a表達水平與IL-8顯著負相關(r=-0.294，P<0.05)，與CCL8也呈負相關(r=-0.298，P<0.05)。

2.3miR-146a與IL-8及CCL8的mRNA和各臨床因子間相關性分析 Spearman相關性分析顯示，miR-146a，IL-8及CCL8與臨床指標(TSH，TT3，TT4，FT3，FT4，TRAb)間具有明顯相關性(表5)。miR-146a表達水平與TSH水平呈正相關(P<0.01)，與TT3，TT4，FT3，FT4及TRAb呈負相關(P<0.05)。IL-8和CCL8的mRNA表達水平與TSH水平呈負相關(P<0.05)，與TT3，TT4，FT3，FT4及TRAb水平呈正相關(P<0.01)。

表5 miR-146a與IL-8及CCL8水平和臨床各因子間相關性分析

TSH：促甲狀腺激素；FT3：游離三碘甲狀腺原氨酸；FT4：游離四碘甲狀腺原氨酸；TT3：總三碘甲狀腺原氨酸；TT4：總四碘甲狀腺原氨酸； TRAb：促甲狀腺激素受體抗體.

3 討 論

GD是最常見的甲亢，以產生自身抗體TRAb而使促甲狀腺激素分泌過多導致甲亢、彌漫性甲狀腺腫和Graves眼病(Graves ophthalmopathy，GO)等為特征，嚴重者甚至可因誘發甲亢危象或甲亢心而死亡[7]。雖然通過現有臨床表現、甲狀腺功能和TRAb已可對GD做出診斷，診斷價值已很高，但是仍然有必要進一步研究探索GD的病因和發病機制。

miR-146a是重要的免疫調節分子，可通過抑制其靶mRNA的表達或翻譯成蛋白質而在TLR-NF-κB信號通路、FADD介導的細胞凋亡通路以及RIG-1-I型干擾素途徑等信號途徑中發揮免疫應答調節作用，從而參與類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)、系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、干燥綜合征(sjogren syndrome，SS)、1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)等多種自身免疫性疾病的發病過程，且其表達水平及所調控的靶mRNA在不同疾病中存在差異[2,6,8-12]。而高通量測序技術發現，miR-146a在GD的不同組織中均存在差異性表達現象[13-18]。故推測miR-146a可通過差異性表達及調控不同的靶mRNA而在GD中發揮作用。

既往研究顯示，miR-146a在PBMC中的表達情況存在爭議。楊文娟等研究發現，miR-146a在GD的PBMC中表達量降低[18]；但Otsu等研究認為，miR-146a在GD的PBMC中表達量增加[13]。本實驗顯示，初發GD的PBMC中miR-146a表達量降低，與楊文娟等的研究結果一致。進一步分析發現，Otsu等只納入了經甲巰咪唑治療后的緩解期GD和TRAb至少5年仍陽性的頑固性GD患者，并未納入未進行抗甲狀腺治療的初發GD患者；而楊文娟等納入的研究對象與本研究的實驗組納入標準一致，均為未經治療的初發GD患者，且本實驗結果證實了楊文娟等的結論，并進一步發現miR-146a的表達水平與TT3，TT4，FT3，FT4及TRAb水平呈顯著負相關，與TSH水平呈顯著正相關。同時研究表明，miR-146a在初發GD患者的甲狀腺組織、血清中的表達量也降低[15，17]。故推測不同組織中表達量降低的miR-146a可能在初發GD中發揮了重要作用，而抗甲狀腺藥物治療GD的機制可能涉及到增加miR-146a的表達量。

既往對GD的研究并未涉及到miR-146a免疫相關性靶mRNA在GD中的表達情況。本研究進一步測定了初發GD患者PBMC中IRAK1/2，TRAF，IL-8，CCL5，FADD及MCP2的mRNA的表達水平，結果顯示，初發GD患者PBMC中IL-8和CCL8表達量升高，與miR-146a的表達水平趨勢相反，且呈顯著負相關。推測miR-146a可能通過負性調控IL-8和CCL8的表達水平而在初發GD中發揮作用。

IL-8和CCL8均屬于趨化因子家族成員。IL-8即CXC趨化因子配體8[chemokine( C-X-C motif) ligand 8，CXCL8]，在炎性細胞趨化、血管生成、有絲分裂和細胞增殖中發揮正向調節作用[19]。既往研究表明，GD患者血清miR-146a的表達水平下降[17,20]，IL-8水平升高，并與TRAb呈正相關[21]；GO患者脂肪細胞和眼眶成纖維細胞中miR-146a表達量增高[22-23]，人源性單克隆抗IGF-1R阻斷抗體——Teprotumumab可通過顯著性抑制IL-8的mRNA表達而抑制眼眶成纖維細胞中IGF-1誘導的免疫炎癥反應[24]。CCL8又稱為單核細胞趨化蛋白2( monocyte chemotactic protein 2， MCP2)，屬于CC家族成員，可通過與CCR1，CCR2，CCR3，CCR5及CCR8等結合，從而在炎癥反應、腫瘤免疫等中發揮作用[25]。例如，有研究發現，HIV-1感染后的人腦小膠質細胞中高表達的miR-146a可抑制CCL8的表達，從而抑制CCR5介導的HIV-1感染[4]。本實驗結果顯示，GD患者PBMC中IL-8和CCL8的mRNA表達水平升高，并與血清TSH呈負相關，與TT3，TT4，FT3，FT4及TRAb呈正相關。故推測低表達的miR-146a可通過靶向升高IL-8和CCL8的mRNA的表達而在炎性細胞趨化、細胞增殖以及血管生成等方面發揮促進作用，從而導致彌漫性甲狀腺腫和自身免疫性炎癥反應，但具體機制有待于進一步闡明。

同時，本研究發現，初發GD患者PBMC中TRAF-6和CCL5的mRNA表達量降低，與miR-146a的表達水平趨勢一致，且IRAK1/2和FADD水平與對照組之間無明顯差異。這些結果與miR-146a及其靶mRNA在其他自身免疫性疾病(如SS)的PBMC中的表達結果不同[17]，進一步證實了miR-146a可能通過差異性表達及調控不同靶mRNA而參與不同自身免疫性疾病的發病機制這一觀點。但目前并不能說明這些靶mRNA與初發GD無關，因為miR-146a還可能通過抑制這些mRNA翻譯成蛋白質而參與GD的發病，或者還有其他miRNA參與了對這些靶mRNA的表達調控，下一步實驗可通過測定GD患者與正常人PBMC中這些靶蛋白的表達量以及其他與這些靶mRNA相關的miRNA的表達量而進一步闡釋該觀點。

總之，本實驗結果表明，miR-146a與GD的發生密切相關，其可能通過抑制其靶基因IL-8和CCL8的mRNA的表達而參與GD的發病，雖然其診斷價值不大，但其表達水平未來可能作為預測GD發生的輔助潛在生物學指標，未來也有可能成為治療GD的生物學靶點。但由于樣本量有限，還未能完全闡明其具體作用機制，有待于進一步研究。