正常白蛋白尿期糖尿病患者血清miR-16-5p與FGF2的相關性及在腎損傷隨訪中的意義

唐平易， 張 琳， 唐東興， 劉立亞

微小RNA(microRNA,miR)是一類調節基因表達的非編碼小分子RNA。新的證據表明，miR在糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease,DKD)的發病中起著非常重要的作用[1]。前期研究發現miRNA-16-5p(miR-16-5p)與DKD相關[2-3]，可能調控有關基因參與炎癥、腎血管重構和間質纖維化過程，但如何導致和促進糖尿病患者腎損傷的機制目前尚不完全清楚。成纖維細胞生長因子2(fibrolast growth factor 2,FGF2)作為慢性腎臟病重要的致病因子已得到廣泛認可，其在糖尿病腎病患者體內表達上調，可導致腎間質纖維化，是DKD重要的損傷因子[4]。miR-16-5p是否通過調控FGF2表達參與DKD的早期腎損害目前未見報道。本研究擬通過對正常白蛋白尿期的2型糖尿病患者進行隨訪觀察，測定其血清miR-16-5p和FGF2水平，并進行相關性分析和生物信息學分析，同時測定腎血管阻力指數等腎損傷指標，探討miR-16-5p在DKD早期腎損傷中的可能作用機制。

1 對象與方法

1.1對象 本研究以課題組前期研究收集的2016年6-10月衡鋼社區體檢和南華大學附屬第二醫院就診的78例2型糖尿病患者為觀察對象。入組標準：符合糖尿病診斷標準確診為2型糖尿病，病程>10年;入組即時尿標本白蛋白/肌酐比率(urinary albumin creatinine ratio,UACR)<30 mg/g(3次非同日尿標本檢測中，2次及以上均<30 mg/g);糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,HbA1c)水平控制在4%～7%;自愿參加此項調查研究者。排除標準：過去3月內及觀測期間有發熱及急慢性炎癥，有其他急慢性腎病、高血壓病，急慢性傳染性疾病，嚴重血液、心、肝、肺、神經系統疾病，器官移植、腫瘤、自身免疫性疾病及合并其他遺傳和(或)代謝異常性疾病者。觀測期間有劇烈運動、高蛋白飲食及使用對蛋白尿有影響的藥物(如血管緊張素轉化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等)及不配合隨訪者。最終至截止觀察期24月后，剩余病例60例，男性31例，女性29例，年齡(58.9±9.8)歲(39～72歲)。依據前期研究確定的DKD患者血清miR-16-5p診斷界值為0.665[3]，將病例組分為血清miR-16-5p水平<0.665(A)組和≥0.665(B)組。選取衡鋼社區同期體檢的78例健康隨機個體為對照組(C組)。24月觀測期間未有發熱、劇烈運動、高蛋白飲食等任何可能影響蛋白尿生成的行為并堅持配合隨訪。最終至截止觀察期C組剩余70例，男性37例，女性33例，年齡(56.1±9.9)歲(32～72歲)。本研究均已獲得受測者知情同意。

1.2方法

1.2.1標本留取和檢測 所有受試者于清晨空腹留取血標本和尿標本，用于檢測空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、HbA1c、血清miR-16-5p、FGF2、尿白蛋白和尿肌酐(留取3次非同日尿標本)，計算UACR(取3次UACR平均值)。隨訪24月后，留取3次非同日尿標本檢測尿白蛋白和尿肌酐，其中兩次及以上均>30 mg/g判定為微量白蛋白尿或明顯蛋白尿。用于檢測miR-16-5p和FGF2的血清標本于-80 ℃冰箱保存，于標本收集結束后統一檢測，其余檢測均于標本留取當天完成。標本留取、保存及FBG、HbA1c、miR-16-5p、尿白蛋白和尿肌酐檢測具體方法均參照課題組前期研究[5]，血清FGF2采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測，試劑盒購自美國R&D Systems公司，酶標儀為Multiskan MK3酶標儀(Thermo公司)，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.2腎臟超聲檢查 所有研究對象在入組時和隨訪24月后，于清晨空腹由同一名經驗豐富的超聲診斷醫師完成腎臟B超檢測。檢查設備為LOGIQ 3 Expert型GE彩色超聲診斷儀。具體操作如下：被檢查者取側臥位，首先選擇3.5 MHz探頭，腎臟模式掃描，初步觀察腎臟形態、內部回聲，并測量和記錄與長軸垂直的腎臟最大橫切面積。然后改用彩色多普勒模式觀察腎臟血流情況，并記錄腎主動脈(master renal artery,MRA)、腎錐體間葉間動脈(interlobar renal artery,IRA)與腎竇部段動脈(segmental renal artery,SRA)的阻力指數(resistance index,RI)。每位被測者左、右腎臟檢測重復3次，取平均值為其最終測量數值。

1.2.3生物學數據庫分析靶向結合關系 為明確miR-16-5p與FGF2基因表達之間的可能相關性，通過查詢miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)和TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)兩種miRNA靶基因數據庫，分別分析miR-16-5p與FGF2基因的可能靶向結合關系。

2 結 果

2.1一般資料及分組情況 對入組時研究對象的一般資料特征進行分析。病例組A和B組分別與對照組(C組)在性別、年齡、血壓兩兩比較，差別無統計學意義。A，B組血清miR-16-5p水平明顯低于C組(P<0.01,P<0.05);而FPG,HbA1c,UACR及最大橫切面面積、各級血管阻力指數和FGF2均高于C組(P<0.05或P<0.01)。A，B組間FPG，HbA1c，UACR及最大橫切面面積和血管(IRA和SRA)阻力指數比較，差別無統計學意義(P>0.05)，但A組miR-16-5p水平明顯低于B組(P<0.01)，MRA阻力指數和FGF2水平明顯高于C組(P<0.05，P<0.01，表1)。

表1 研究對象一般資料特征

1 mmHg=133.3 Pa. FPG：空腹血糖； HbA1c：糖化血紅蛋白； UACR：尿標本白蛋白/肌酐比率； RIMRA：腎主動脈阻力指數；RIIRA：腎錐體間葉間動脈阻力指數； RISRA：腎竇部段動脈阻力指數； FGF2：成纖維細胞生長因子2. A組：血清miR-16-5p水平<0.665； B組：血清miR-16-5p水平≥0.665； C組：對照組. 與C組比較，☆：P<0.01，#：P<0.05； A與B組比較，$：P<0.05，￥：P<0.01.

2.2入組時miR-16-5p與FGF2相關性 對病例(A+B)組入組時血清miR-16-5p表達水平與FGF2水平進行Pearson相關分析，發現二者之間呈顯著負相關(r=-0.683，P<0.01)。A，B組FGF2表達水平進行比較，A組FGF2水平明顯高于B組(P<0.01，表1)。

2.3生物信息學數據庫分析結果 通過miRDB數據庫查詢發現FGF2基因3′-UTR區存在4個“5′-UGCUGCU-3′”核苷酸片段序列，為miR-16-5p種子序列“5′-AGCAGCA-3′”靶向結合位點，而TargetScan數據庫查詢同樣也發現FGF2基因3′-UTR區存在5個核苷酸片段序列是miR-16-5p種子序列的潛在靶向識別位點，包含了前者4個序列。相同的序列分別位于FGF2基因3′-UTR區1 113～1 119、5 066～5 073、5 599～5 606、5 640～5 647位核苷酸序列區。

2.4隨訪后尿白蛋白發生情況比較 隨訪24月后，病例(A+B)組出現微量白蛋白尿或明顯蛋白尿的總發生率為35.00%，其中A組18例(43.90%)，而B組3例(15.79%)，兩組白蛋白尿轉化發生率比較，差別有統計學意義(P<0.05)，而C組轉化發生率為0。

2.5不同組腎臟超聲指標變化情況 所有研究對象在入組時行腎臟超聲探查，腎臟實質回聲無明顯異常，隨訪24月后實質回聲均無明顯異常改變。為進一步了解各研究對象腎臟超聲觀察指標變化情況，取各觀察指標變化(△=隨訪結束時測量值-入組時測量值)。A，B組腎臟最大橫切面積增加均大于C組(P均<0.01)，且A組橫切面積增大超過B組(P<0.05)。同樣A，B兩組各血管阻力指數增加值均大于C組(P均<0.01)，且A組血管阻力指數增加值超過B組(P均<0.05，表2)。

表2隨訪24月后腎臟超聲指標變化情況比較

Tab 2The changes of renal ultrasound indexes were compared after 24 months of follow-up

腎臟超聲指標A組B組C組n411970s最大橫切/cm25.21±4.60☆#3.25±3.98☆0.22±1.67△RIMRA0.045±0.047☆#0.019±0.0340.011±0.021△RIIRA0.042±0.046☆#0.019±0.0300.010±0.019△RISRA0.043±0.045☆#0.020±0.0300.010±0.019

3 討 論

DKD是我國終末期腎病的常見原因之一，是糖尿病的慢性并發癥，經歷了從無明顯白蛋白尿向微量白蛋白尿、大量白蛋白尿、終末期腎功能衰竭漸進發展的臨床過程。臨床上發現，在發展為臨床蛋白尿之前，同樣存在一個較長的腎損傷階段。盡管通過控制血糖和血壓等治療，仍不足以完全阻斷DKD患者腎損傷病情進展[6]，其機制尚不完全清楚。明確腎損傷的可能機制并開展有效的干預將有利于改善糖尿病患者預后。

研究發現，表達下調的miR-16-5p與DKD患者病情密切相關。低表達的miR-16-5p可通過上調不同的靶基因表達參與炎癥、微血管功能障礙和纖維化等過程。通過提高miR-16-5p的表達能減輕糖尿病大鼠腎臟纖維化損傷[7]。本研究發現，處于正常白蛋白尿期的2型糖尿病患者血清miR-16-5p表達明顯低于對照組；而臨床常用于監測糖尿病病情的指標，如FBG、HbA1c、尿白蛋白、腎臟體積和腎血管阻力指數指標卻高于對照組，這提示miR-16-5p的低表達可能與早期DKD病情相關。

腎小球硬化、微血管病變和腎間質纖維化等病理改變是早期DKD腎損傷的有效觀察指標。但腎臟病理檢查是有創檢測，并不適合作為預防疾病的觀測指標。本研究選取了UACR和超聲腎臟最大橫切面積、腎血管阻力指數作為早期腎損傷觀察指標。DKD初期患者的臨床腎臟超聲檢查并無明顯腎實質回聲變化，但隨著正常白蛋白尿期向微量白蛋白尿和大量白蛋白尿進展，腎血管阻力指數逐漸增加，腎臟體積可暫時增加。超聲腎臟最大橫切面積、腎血管阻力指數可作為早期DKD患者檢測腎臟損傷的指標。隨訪24月后，A組有43.90%的患者進展為微量白蛋白尿或明顯蛋白尿，發生率明顯高于B組(15.79%,P<0.05)，C組卻沒有出現白蛋白尿轉化發生情況。超聲檢查顯示A組腎臟最大橫切面積和血管阻力指數24月后較基線值增加明顯高于B，C組(P均<0.05)。由此可見，miR-16-5p下調幅度大者更容易出現腎損傷，miR-16-5p水平的下降可能加劇正常白蛋白尿2型糖尿病患者的腎損傷。

本研究通過病例對照研究發現，正常白蛋白尿期的患者血清FGF2表達水平明顯高于對照組。同時分析發現,該期患者miR-16-5p表達水平與FGF2表達呈明顯負相關，且A組患者FGF2水平明顯高于B組。進一步通過生物信息學軟件分析證實,miR-16-5p與FGF2編碼基因3’-UTR區存在靶向結合關系。FGF2是DKD發生發展的重要影響因子。FGF2高表達與內皮細胞受損有關；FGF2高表達可以引起足細胞足突融合、消失、退縮，甚至從腎小球基底膜分離，導致腎小球濾過屏障受損，對蛋白通透性增加，發生蛋白尿；FGF2高表達還可以作用于腎小管上皮細胞使其表達成纖維細胞特征蛋白，發生上皮-間葉轉化(epithelial mesenchymal transitios,EMT)，導致腎間質纖維化[8-9]，引起血管變形；同時可以作用于系膜細胞引起系膜損傷和增生[10]，使毛細血管管腔變小，進而發展為結節性腎小球硬化，從而增加血管阻力。結節性腎小球硬化是DKD的特征性病理改變，微血管病變和間質纖維化是其本質表現。纖維化也可發生在早期DKD[11]。因此，筆者認為，miR-16-5p顯著低表達可通過上調FGF2加重早期DKD患者腎損傷，導致其隨訪后出現尿白蛋白增加和血管阻力指數增加，miR-16-5p/FGF2可能是DKD早期腎損傷重要的調控通路。

總之，本研究選擇正常白蛋白尿期的糖尿病患者與健康對照進行研究發現，低表達的miR-16-5p與上調的FGF2密切相關，隨訪腎損傷發生率更高，miR-16-5p可能通過上調FGF2表達影響早期2型糖尿病患者腎損傷病情進展。本研究由于所選的糖尿病患者受具體病程、治療方法等因素影響，且為觀察性研究，存在一些局限性，下一步仍需通過擴大樣本量、增加觀察時間和更深入的臨床研究和動物實驗進一步明確。