小麥類成束阿拉伯半乳糖蛋白編碼基因TaFLA的克隆與表達分析

郝小聰，徐 磊，汪德州，房兆峰，柳 珊，孫 瑞，王偉偉，趙昌平，高世慶，唐益苗

(1.北京農學院植物科學技術學院，北京 102206; 2.北京市農林科學院雜交小麥工程技術研究中心，北京 100097)

類成束阿拉伯半乳糖蛋白編碼基因Fasciclin-LikeArabinogalactan-protein(FLA)普遍存在于植物、動物和細菌中[1]。目前，已有大量關于FLA基因參與植物逆境脅迫反應的報道[2]，如在鹽脅迫下，擬南芥FLA4的Fasciclin結構域突變導致根膨脹，說明該蛋白在鹽脅迫逆境條件下具有細胞擴增功能[3]。FLA基因在植物花藥發育中也發揮重要作用[4]，擬南芥FLA3在花粉粒和花粉管中特異性表達，其蛋白質與質膜緊密結合，通過細胞膜質沉積參與小孢子發育，從而影響花粉粒的形成。fla3缺失突變體植株表現出花粉晚熟，且花粉粒發育異常和育性降低，FLA3的過量表達導致雄性花絲伸長缺陷和花粉育性降低，最終降低種子的結實率[5]。在水稻中，發現了一種FLA糖蛋白MTR1，其控制水稻花粉細胞及周圍營養層細胞的共同發育[6]。MTR1含有兩個Fasciclin結構域、兩個N糖基化位點和一個細胞膜定位的分泌性的N端信號肽。MTR1在花藥中特異性表達，它的缺失突變體在營養層細胞絨氈層和小孢子的發育上都出現了缺陷，導致完全雄性不育。然而，大多數植物FLA蛋白的生物學功能尚不清楚[7]。小麥作為主要糧食作物之一，目前已經利用EST序列信息報道了34個與小麥FLAs蛋白相關的基因，并發現了一些組織特異性表達和受到逆境脅迫誘導表達的FLAs基因，如TaFLA9在根部特異性表達，TaFLA4受到干旱誘導時上調表達[8]。但FLAs在小麥雄性不育中發揮的作用仍未見報道。

雜種優勢利用被認為是今后大幅度提高小麥產量的主要途徑之一。目前，在水稻、玉米、棉花和油菜等作物中，已在生產上大面積推廣應用，但小麥雜種優勢利用仍處于初級階段[9]。小麥溫敏雄性不育系是高溫表現可育，低溫表現不育，可以通過溫度調節生產雜交種。目前利用小麥溫敏雄性不育系已經培育出京麥6號、京麥7號和京麥8號等雜交小麥品種。然而，關于小麥溫敏核不育系敗育的分子機理尚不清楚。本研究根據水稻已發表的相關絨氈層特異性FLA蛋白不育基因MTR1的序列信息，利用同源克隆法，獲得1個新的小麥FLA基因，并進行生物信息學分析，研究其組織特異性、非生物脅迫反應及其在小麥溫敏雄性不育系表達方面的特性，為進一步研究其響應逆境脅迫和溫敏雄性不育的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及其處理

以本實驗室保存的溫敏雄性不育系BS366及普通六倍體小麥品種京411、小白麥為供試材料。將小白麥種子置于25 ℃的培養間，每天16 h的光照水培培養，生長14 d后進行高鹽(250 mmol·L-1NaCl)、低溫(4 ℃)、干旱(濾紙吸干水，空氣中晾干)、脫落酸(200 mol·L-1ABA)脅迫處理，分別在處理0 h、2 h、5 h、8 h、12 h、24 h時取各幼苗整株，液氮冷凍，保存于 -80 ℃超低溫冰箱，用于目的基因的脅迫表達分析。

取北京海淀區田間種植的開花15 d后小白麥的根、莖、葉、花藥減數分裂前期小花(除雄蕊)，液氮冷凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱，用于目的基因的組織特異性表達分析。

取北京(高溫)和河南鄧州(低溫)田間種植的溫敏雄性不育系BS366和可育品種京411，待挑旗以后，分別取減數分裂前期、二分體時期、四分體時期和小孢子期的雄蕊，取材參照Tang等[10]的方法，液氮冷凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱，用于分析目的基因在不育環境下和可育環境下雄蕊的表達特性。

1.2 RNA提取及cDNA合成

利用Trizol法提取小麥不同組織器官及幼苗的總RNA[11]，測定OD260/280值，同時利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，置于 -80 ℃超低溫冰箱備用。經DNase I(Promega，美國)處理后作為模板，以Oligo dT為引物，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反轉錄合成cDNA，-20 ℃保存備用。

1.3 小麥Fasciclin蛋白編碼基因的克隆

根據水稻上已發表的相關絨氈層特異性FLA蛋白不育基因MTR1(Os02g0491300)，用Gramene(http://gramene.org/)網站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)進行生物序列同源性檢索，選取相似度達63.29%的序列TraesCS5B02G045400。設計引物TaFLA-F/TaFLA-R(表1)，以BS366和京411的小孢子時期雄蕊cDNA作為模板進行PCR擴增。擴增體系20 μL，包括2×Trans TaqHigh Fidelity PCR SuperMix(Transgen，北京)10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，模板DNA(100 ng·L-1)1 μL、ddH2O 7 μL。擴增程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段經膠回收純化并連接到pEASY-T1(Transgen，北京)載體上，轉化大腸桿菌感受態細胞TOP10，經菌落PCR鑒定后，每個樣品選取3個獨立克隆進行測序(北京六合華大基因公司)。

表1 引物名稱及序列

1.4 TaFLA蛋白的生物信息學分析

利用Pfam(http://pfam.xfam.org/)預測TaFLA蛋白結構；從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取關于基因的cDNA序列和染色體位置的信息[12]。

將TaFLA的蛋白序列作為目標序列，在Gramene(WWW.gramene.org/)網站搜索，獲得粗山羊草(Aegilopstauschii)、烏拉爾圖小麥(Triticumurartu)、大麥(Hordeumvulgare)、短柄草(Brachypodiumdistachyon)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)、谷子(Setariaitalica)的同源蛋白序列，并對以上蛋白序列在Pfam(http://pfam.xfam.org/)中進行保守結構域分析。對于系統發育分析，使用MUSCLE(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)進行多序列比對分析(參數使用網站默認參數)，輸出序列比對結果，在MEGA 6.0軟件中構建系統進化樹，使用鄰接法和泊松校正模型，其中bootstrap值設置為1 000次重復。

1.5 TaFLA基因的表達分析

利用WheatExp(https://wheat.pw.usda.gov/WheatExp/)網站對小麥TaFLA基因的表達進行預測分析，根據TaFLA基因cDNA序列，避開保守結構域設計表達分析引物TaFLA-qPCR-F/TaFLA-qPCR-R(表1)。以小麥Actin為內參對照，以反轉錄的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析。PCR反應體系為10 μL，包括2×TB Premix Ex Taq 5 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL、cDNA模板 1 μL(100 ng)，其余用ddH2O補足。PCR擴增于Bio-Rad qPCR儀上進行，反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環；后增加熔解曲線環節，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，95 ℃變性15 s，通過擴增曲線和熔解曲線確定引物特異性。每個反應3次重復，并采用2-△△Ct法[13]計算基因相對表達量，同時計算其標準差。

2 結果與分析

2.1 TaFLA基因克隆及其編碼蛋白結構分析

以BS366/京411小孢子時期雄蕊的cDNA為模板，利用引物TaFLA-F/TaFLA-R(表1)進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到大小為1 800 bp左右的單一條帶(圖1)。將目的片段純化、克隆并測序后，經Blast比對分析，該基因與水稻MTR1(Os02g0491300)相似，暫命名為TaFLA(TraesCS5B02G045400)。通過比較基因組區域(http://www.gramene.org)和全長cDNA序列確定Fasciclin蛋白的基因結構，TaFLA轉錄物的長度為1 812 bp，含有1 530 bp的編碼序列，37 bp的5’非翻譯區(UTR)和247 bp的3’UTR。預測的TaFLA蛋白長509個氨基酸并含有預測的N-末端信號肽，2個Fasciclin結構域(氨基酸205-300、371-474)和兩個N-glycosylation sites(氨基酸369和487)(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)(圖2)。利用Pfam(http://Pfam.xfam.org/)分析TaFLA基因所編碼的氨基酸序列，發現其含有FLA domain superfamily，進一步說明TaFLA基因屬于FLA基因家族。

M：DL2000；366：BS366擴增產物；411：京411擴增產物。

M:DL2000; 366:BS366 amplification product; 411:Jing 411 amplification product.

圖1TaFLA凝膠電泳擴增產物

Fig.1 Amplicons ofTaFLAseparated by electrophoresis

2.2 TaFLA同源蛋白序列的比對及進化分析

為了分析TaFLA基因的系統進化關系，將其蛋白序列進行Blastp全長序列比對，結果發現，其蛋白序列與來源于二粒小麥(TRIDC5BG-007410)、大麥(HORVU5Hr1G010360)、粗山羊草(AET5Gv20128400)、短柄草(BRADI_3g29350v3)、水稻(Os02g0491300)的蛋白序列相似性分別為100%、99%、55%、78%、57%。所有Fasciclin蛋白均包含2個Fasciclin結構域，且位置完全相同(圖2)。利用鄰接法構建進化樹，結果表明，單子葉和雙子葉植物FLA蛋白分別聚為兩類，小麥與二粒小麥親緣關系最近(圖3)。

2.3 TaFLA基因的組織特異性表達分析

利用WheatExp(https://wheat.pw.usda.gov/WheatExp/)網站查找轉錄組數據，對小麥TaFLA基因不同時期不同組織的表達分析表明，該基因在根、莖、葉、花、籽粒中均有表達，而在穗中的早期表達量最高，有明顯的組織特異性。將小白麥開花15 d后不同組織的cDNA進行熒光定量PCR，結果(圖4)表明，TaFLA基因在減數分裂時期的雄蕊及其穗中高度表達，與小麥轉錄組數據表達模式一致。

2.4 TaFLA基因在不同非生物脅迫下的表達 分析

為進一步了解TaFLA基因對逆境脅迫的響應，以提取的不同脅迫處理下小白麥幼苗的cDNA 作為模板，利用熒光定量PCR技術，分析在低溫、高鹽、干旱和ABA處理下小麥幼苗中該基因的表達情況。結果(表2)表明，該基因對低溫脅迫敏感，表達量先持續下降，到8 h時驟然上升至處理前的2.4倍，達到最高值，隨后表達水平下降，表明TaFLA表達受低溫脅迫誘導；在干旱脅迫處理下，該基因表達量在24 h時達到最低值，大約為處理前表達量的10%，其余時期表達量基本維持在一個穩定的水平；高鹽處理2 h后，該基因表達量急劇下降至最低；ABA處理下表達量均有所下降，24 h達到最低值。以上結果表明，TaFLA基因在低溫誘導下強烈表達，而在干旱，高鹽和ABA誘導下表達受到抑制。

2.5 TaFLA基因在小麥溫敏雄性不育系BS366雄蕊中的表達分析

小麥溫敏雄性不育系BS366種植于北京(高溫)表現花粉可育，種植于河南鄧州(低溫)表現出花粉敗育。為了進一步明確TaFLA基因在小麥溫敏雄性不育中的調控機制，以小麥溫敏雄性不育系BS366和普通小麥品種京411(對照)為實驗材料，利用熒光定量PCR技術，分析TaFLA基因在可育和不育環境下雄蕊中的表達特性(圖5)，結果表明，在溫敏雄性不育系BS366中該基因在不育環境下(10 ℃)二分體時期雄蕊中高度表達，約為可育環境下 (20 ℃)二分體時期的雄蕊中表達量的29倍，但在京411中該基因表達量變化不大，說明TaFLA基因可能參與小麥溫敏雄性不育調控反應。

1.黑色方框代表TaFLA與其他9種植物序列包含的Fasciclin結構域；2.黑色橢圓框代表TaFLA序列中包含的兩個N-glycosylation sites位點。

1.The black box represents the Fasciclin domain contained in TaFLA and the nine sequences in other plants; 2.The black oval box represents the two N-glycosylation sites in the TaFLA sequence.

圖2 TaFLA蛋白與其他9種植物FLA蛋白序列的比對

Fig.2 Comparison of TaFLA protein and the nine FLA protein sequences in other plants

鄰接法構建的進化樹，表示TaFLA與其他9種植物FLA系統進化關系。

The phylogenetic tree was constructed by the adjacency method,representing the evolution analysis of TaFLA and the nine FLA proteins in other plants.

圖3 TaFLA系統進化分析

Fig.3 Phylogenetic analysis of FLA proteins

1：根；2：莖；3：葉；4：小穗(除去雄蕊)；5：減數分裂時期的雄蕊；6：穎殼；7：葉鞘。

1:Root; 2:Stem; 3:Leaf; 4:Spikelet(removal of stamen); 5:Stamen at meiosis; 6:Glume; 7:Leaf sheath.

圖4 小麥TaFLA基因在不同器官中的相對表達量

Fig.4 Relative expression ofTaFLAgene in different organs in wheat

3 討 論

Fasciclin蛋白在植物中廣泛存在，且在擬南芥、水稻等植物中均有報道[14]，但小麥作為世界最重要的糧食作物之一，目前基于小麥EST序列信息只有34個小麥FLA蛋白基因被報道。隨著小麥基因組測序工作完成，將有更多的FLA蛋白基因被克隆，并進行功能鑒定。本研究基于水稻雄性不育基因MTR1基因序列，在小麥中同源克隆了該基因，考慮小麥中有A,B,D三個亞基因，TaFLA可能存在來自不同A,B,D三個亞基因組的同源基因，在Gramene(www.gramene.org/)中，僅發現了TaFLA-B和TaFLA-D，設計不同引物進行全長克隆，但僅克隆出B亞基因組中TaFLA-B，并命名為TaFLA，目前尚未見該基因在小麥中有研究報道。序列比對結果表明，TaFLA基因所編碼的氨基酸序列與水稻、擬南芥等植物Fasciclin氨基酸序列同源性高，且含有2個FLA保守結構域[15]，屬于Fasciclin蛋白 家族。

表2 小麥TaFLA基因在不同脅迫處理下的相對表達量

10 ℃的MMC、Dyad、Tetrad、MP分別表示在不育環境下的減數分裂前期、二分體期、四分體期和小孢子期；20 ℃的MMC、Dyad、Tetrad、MP分別表示在可育環境下的減數分裂前期、二分體期、四分體期和小孢子期。

MMC,Dyad,Tetrad and MP at 10 ℃ indicate pre-meiosis,bipartite,tetrad and microspores in infertile environment,respectively; MMC,Dyad,Tetrad and MP at 20 ℃,represent pre-meiosis,bipartite,tetrad and microspores in fertile environment,respectively.

圖5 小麥TaFLA基因在可育和不可育環境下的抽穗期四個階段的相對表達量

Fig.5 Relative expression ofTaFLAgene in wheat at four stages of heading stage in fertile and infertile environments

TaFLA具有兩個預測的Fasciclin結構域[16]，與擬南芥序列相比，序列具有很大的差異，但與水稻相似性極高，說明單子葉和雙子葉植物的FLA家族可能在單子葉植物和雙子葉植物進化之前就開始分化了。FLA家族是擬南芥中發現的主要類型的Fasciclin蛋白。FLA可能因為其缺乏AGP的保守序列，影響植物細胞壁的形成，從而在植物生長發育過程中發揮重要作用[17]。水稻MTR1是花藥絨氈層細胞和花粉形成的必需基因。使用遺傳互補和生化分析，發現其質膜定位、N-糖基化以及兩個Fasciclin結構域對于MTR1在花藥發育和花粉成熟中的作用是不可或缺的。水稻MTR1基因的mtr1突變體表現出花藥發育缺陷和繁殖力降低[6]。本研究發現，小麥TaFLA在小穗和減數分裂時期的雄蕊中表達量均高于其他組織，表現出組織特異性表達，且在二分體期雄蕊中表達量最高，推測該基因可能在小麥雄蕊發育過程中起到重要作用。

小麥溫敏雄性不育系BS366在高溫表現為雄性可育，低溫表現為雄性不育的特性。唐忠輝[9]等報道小麥溫敏雄性不育系BS366在10 ℃生長條件下(即不育環境)，其雄蕊細胞質分裂異常，不能形成正常的二分體；在20 ℃生長條件下(即可育環境)雄蕊細胞質分裂正常，形成二分體。研究結果表明，TaFLA基因與水稻中控制花粉育性MTR1高度同源[18]，在低溫誘導下大量表達，且在小麥花藥中高度表達，TaFLA基因在溫敏雄性不育系BS366不育環境下的雄蕊中，在二分體時期表達達到最高，比可育環境下相應時期的表達量有極顯著的提高。而該基因在可育系京411的二分體時期，低溫處理環境(10 ℃)和正常生長環境(20 ℃)差異不大，說明TaFLA可能參與小麥溫敏雄性不育信號網絡途徑。

TaFLA在小麥正常發育的雄蕊中表現為特異性表達，該基因可能是小麥花藥正常發育的必要基因，缺失TaFLA可能導致小麥花粉育性下降，其功能可能與水稻MTR1類似；而過量表達也同樣可能引起植物的雄性不育，如本研究中發現TaFLA在小麥溫敏雄性不育系中不育環境下(10 ℃)的大量表達，但還需進一步驗證。據此推測，精確適量表達TaFLA才能確保小麥花藥的正常的發育，這可能是導致小麥溫敏雄性不育花粉敗育的主要原因，上述推斷為研究小麥溫敏雄性不育和花藥發育提供了新的思路和方法。