利用細胞破碎法提取螺旋藻中葉綠素的提取液研究

楊軍，曹菊秀，楊文華，王艷菊

利用細胞破碎法提取螺旋藻中葉綠素的提取液研究

楊軍，曹菊秀，楊文華，王艷菊

（云南省麗江市質量技術監(jiān)督綜合檢測中心，云南 麗江 674100）

在螺旋藻葉綠素檢測中目前采用《進出口螺旋藻中藻藍蛋白、葉綠素含量的測定方法》（SN/T 1113—2002），該方法樣品前處理需要反復研磨、萃取、洗滌等10多個步驟，客觀存在耗時長、對檢驗人員在各個環(huán)節(jié)的把控能力要求較高、單次檢測時容易產生較大誤差、多次復測時重現(xiàn)性差等問題。而采用超聲破壁、離心分離的方法，不僅簡化了實驗步驟，且結果的復現(xiàn)性穩(wěn)定。重點研究了在對螺旋藻中的葉綠素進行提取時所使用的提取液。

細胞破碎；葉綠素；提取液；丙酮

葉綠素是高等植物和其他所有能進行光合作用的生物體含有的一類綠色色素，屬于脂溶性色素，存在于一切綠色植物中，可溶于乙醚、丙酮、乙醇等有機溶劑，不溶于水。因此，可用極性溶劑如乙醚、丙酮、乙醇等進行葉綠素提取。

1 擬定提取液組合

為了尋找到最佳的葉綠素提取液組合，本試驗依據實施方案對多種有機溶劑進行了組合，具體情況如表1所示。

表1 提取液及其組合比例

序號試劑組合組合比例（體積比） 1無水乙醇1 2無水乙醇-乙醚（V/V=1∶1）1∶1 3無水乙醇-乙醚2∶1 4無水乙醇-乙醚1∶2 5丙酮1 6丙酮-乙醇1∶2 7丙酮-乙醚1∶1 8丙酮-無水乙醇-乙醚1∶1∶1 9丙酮-乙醇1∶1 10丙酮-水85∶15 11質量分數(shù)為85%的丙酮水溶液-乙醇1∶1 12質量分數(shù)為85%的丙酮水溶液-乙醇3∶1 13質量分數(shù)為85%的丙酮水溶液-乙醇2∶1 14質量分數(shù)為85%的丙酮水溶液-乙醇1∶2 15質量分數(shù)為85%的丙酮水溶液-乙醇1∶1 16質量分數(shù)為85%的丙酮水溶液-乙醇1∶3 17質量分數(shù)為85%的丙酮水溶液-乙醇1∶4 18丙酮-乙醇-水4.5∶4.5∶1

2 提取液的篩選

在提取液的篩選試驗中，本試驗將篩選過程分為以下3個階段：①初選階段。從18組中選出分層較好的7組。

②復選階段。從7組中選擇提取效果最佳的1組。③確定階段。通過重復試驗驗證提取液的有效性。

3 篩選試驗

3.1 初選

操作步驟：本試驗將《進出口螺旋藻中藻藍蛋白、葉綠素含量的測定方法》（SN/T 1113—2002）中質量分數(shù)為85%丙酮水溶液替換成表1中的18種提取液組合進行試驗。挑選出了7組分層效果好的提取液，如表2所示。

表2 初選提取液一覽表

序號提取液分層效果初選結果 1無水乙醇-乙醚（V/V=1∶1）很好保留 2質量分數(shù)為85%的丙酮水溶液-無水乙醇（V/V=1∶1）較好保留 3質量分數(shù)為85%的丙酮水溶液-無水乙醇（V/V=3∶1）較好保留 4質量分數(shù)為85%的丙酮水溶液-無水乙醇（V/V=2∶1）較好保留 5質量分數(shù)為85%的丙酮水溶液-無水乙醇（V/V=1∶2）較好保留 6質量分數(shù)為85%的丙酮水溶液-無水乙醇（V/V=1∶1）較好保留 7丙酮-乙醇-水（V/V/V=4.5∶4.5∶1）較好保留

3.2 復選試驗

本試驗針對初選的7組提取液進行了結果分析，研究其提取效果。操作步驟：稱取樣品0.1 g（精確至0.000 1 g）至15 mL具塞塑料離心管中；加入10 mL提取液，第一次超聲提取30 min，3 000 r/min離心5 min，提取液轉入125 mL分液漏斗（部分盛有20 mL的水，部分不加水）中；向15 mL離心管中加入10 mL提取液，振搖混合，第二次超聲提取15 min，3 000 r/min離心5 min，提取液并入125 mL分液漏斗中；向分液漏斗中加入20 mL乙醚，之前未加水的加入20 mL水，輕搖，靜置分層，棄去水層；用水洗滌2次，每次20 mL，輕搖，靜置分層，棄去水層；將乙醚層通過一裝

有5 g無水硫酸鈉的小漏斗，濾入50 mL棕色容量瓶中，用少量乙醚洗滌分液漏斗，并洗去無水硫酸鈉層中的色素，定容，搖勻，待測；將上述待測液立即于分光光度計上測定642 nm及660 nm處的吸光值，1 cm比色皿，乙醚作空白；運用《進出口螺旋藻中藻藍蛋白、葉綠素含量的測定方法》（SN/T 1113—2002）中的計算方法計算。

本試驗采用上述方法共進行了4次復選試驗，結果如下所示。

3.2.1 第一次提取液復選試驗

第一次提取液復選試驗結果如表3所示。

表3 第一次提取液復選結果一覽表

方法條件：溫度為45 ℃；時間方面，第一次為30 min，第二次為15 min 序號提取液稱樣量/gABS/nmX5/（mg/L）X6/（mg/100 g） 642.00 660.00 1丙酮-乙醇-水 （V/V/V=4.5∶4.5∶1)0.101 30.2041.25512.366610.4 2質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V= 1∶2)0.101 70.4721.50918.674918.1 3質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=1∶1)0.104 90.4481.98921.6941 034.0 4質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=2∶1)0.104 40.181.08110.721513.5 5質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=3∶1)0.102 90.2151.29312.815622.7 6乙醇-乙醚（V/V=1∶1)0.101 30.4131.98721.0831 040.6 0.104 40.4082.04821.4391 026.8 7丙酮-乙醇-乙醚（V/V/V=1∶1∶1)0.102 60.3001.70417.169836.7 0.102 00.3681.96220.152987.8

分析：采用乙醇-乙醚（/= 1∶1）、丙酮-乙醇-乙醚（//=1∶1∶1）、質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（/=1∶1）、質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（/=1∶2），這四組提取效果較好。從分層的速度來看，乙醇-乙醚（/=1∶1）分層最快。

3.2.2 第二次提取液復選試驗

通過第一次試驗發(fā)現(xiàn)，將提取液轉移至125 mL分液漏斗中，分層效果會受到加水量的影響。因此在本次試驗中加入2個第一次加水量為40 mL的試驗組作為對比。第一次超聲時間為30 min，第二次超聲時間為10 min，其余條件與第一次提取液復選試驗相同。試驗結果如表4所示。

分析：通過第二次提取液復選試驗，1號、3號、6號提取液提取效果較好。從分層的難易程度分析，6號分層最快，檢測結果相對于其余組別仍然較高，7號檢測結果重復性差。

3.2.3 第三次提取液復選試驗

通過第二次復選試驗，發(fā)現(xiàn)2號、3號、4號、5號、7號的第一次加水順序對分層效果影響較大。本次試驗1號和6號先向空分液漏斗中加入20 mL水，轉移提取液后加入20 mL乙醚；其余5個試驗組先向空分液漏斗中轉移提取液，再順次加入20 mL乙醚和20 mL水進行試驗。試驗結果如表5所示。

分析：1號分層效果不佳，所以未進行結果的測定；1號在前兩次試驗中能分層但耗時長，本試驗計劃在下次試驗中改變加水順序繼續(xù)研究；2號檢測數(shù)值最大（1 120.1 mg/100 g）。

表4 第二次提取液復選結果一覽表

方法條件：溫度為45 ℃；時間方面，第一次為30 min、第二次為10 min；第一次加水：空分液漏斗中先加水，1～6號、8號為20 mL，7號、9號為40 mL 序號提取液稱樣量/gABS/nmX5/（mg/L）X6/（mg/100 g） 642.00 660.00 1丙酮-乙醇-水 （V/V/V=4.5∶4.5∶1）0.102 70.3151.98619.435946.2 2質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V= 1∶2）0.105 40.2761.62816.231770.0 3質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=1∶1）0.102 30.3341.98719.759965.7 4質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=2∶1）0.102 30.2571.55415.388752.1 5質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=3∶1）0.101 10.1090.6426.402316.6 6乙醇-乙醚（V/V= 1∶1）0.101 10.3432.08220.5861 018.1 0.101 50.3422.07920.5481 012.2 7丙酮-乙醇-乙醚（V/V/V=1∶1∶1）0.102 30.1821.13411.135544.2 0.102 70.0240.1381.38867.6

表5 第三次提取液復選結果一覽表

方法條件：溫度為45 ℃，時間方面，第一次為30 min、第二次為10 min；加水順序：2號、3號、4號、5號、7號試驗組先加入20 mL乙醚后再加入20 mL水；1號、6號先加20 mL水再加入20 mL乙醚 序號提取液稱樣量/gABS/nmX5/（mg/L）X6/（mg/100 g） 642.00 660.00 1丙酮-乙醇-水 （V/V/V=4.5∶4.5∶1）0.100 9//// 2質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=1∶2）0.101 00.4112.20922.6271 121.3 3質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=1∶1）0.101 20.3512.13521.1011 044.6 4質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=2∶1）0.101 20.3642.24122.0741 090.6 5質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=3∶1）0.100 90.3602.1921.6411 072.4 6乙醇-乙醚（V/V=1∶1）0.100 50.3232.01619.780984.1 7丙酮-乙醇-乙醚（V/V/V=1∶1∶1）0.101 30.3492.12220.9691 035.0

3.2.4 第四次提取液復選試驗

本次試驗6號先加入20 mL水，其余6組順次加入20 mL乙醚和20 mL水，檢測結果如表6所示。

分析：1號改變加水順序，檢測結果超過1 000 mg/100 g，再次證明第一次加水的順序對螺旋藻中葉綠素的分層效果影響很大。

表6 第四次提取液復選結果一覽表

方法條件：溫度為45 ℃，時間方面，第一次為30 min、第二次為10 min。第一次加水：1～5號及7號試驗組先加入20 mL乙醚再加20 mL水，6號先加入20 mL水再加入20 mL乙醚 序號提取液稱樣量/gABS/nmX5/（mg/L）X6/（mg/100 g） 642.00 660.00 1丙酮-乙醇-水 （V/V/V=4.5∶4.5∶1）0.101 00.3812.23922.3501 106.4 2質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=1∶2）0.101 00.4642.28624.0791 192.0 3質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=1∶1）0.101 20.3662.21821.9391 083.9 4質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=2∶1）0.101 20.1691.02910.162502.1 5質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（V/V=3∶1）0.101 10.3592.18821.6071 068.6 6乙醇-乙醚（V/V=1∶1）0.101 20.3422.10920.7701 026.2 7丙酮-乙醇-乙醚（V/V/V=1∶1∶1）0.101 20.3221.98319.531965.0

3.3 試驗結果

通過復選試驗發(fā)現(xiàn)，當提取液為質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（/=1∶2）時，檢測值最大且穩(wěn)定性最好，所以質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（/=1∶2）提取液最有優(yōu)勢。同時，研究了第一次加水的用量和順序對分層效果的影響。

4 小結

通過本次試驗研究得出如下結論：①質量分數(shù)為85%的丙酮-乙醇（/=1∶2）提取液為超聲提取葉綠素的最佳試劑組合，提取效果最佳；②加水順序直接影響分層效果，提取液轉移后先加入20 mL乙醚，再加入20 mL水的分層效果最佳。

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Q945

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2019.17.003

2095－6835（2019）17－0007－03

楊軍（1975—），男，云南麗江人，本科，高級工程師，主要從事產品質量管理與研究。

〔編輯：張思楠〕