4-硝基苯甲酰氯柱前衍生-超高效液相色譜/質譜法測定煙葉中氨基酸

黃曼艷　陳森林　林云　陶紅　阿文偉　胡玉玲　葉為民　李攻科

摘 要 建立了4-硝基苯甲酰氯柱前衍生、超高效液相色譜/質譜法測定煙葉中氨基酸的方法。樣品經超聲輔助提取后，提取液與4-硝基苯甲酰氯可快速發生衍生化反應。優化后的衍生化條件為： NH4HCO3-NH3·H2O緩沖溶液（pH=9.0）， 室溫下振蕩衍生1 min。此反應具有反應條件溫和、衍生時間短等優點。通過優化多通道反應監測參數，進一步提高了方法的靈敏度。方法的線性相關系數R2在0.9951～0.9998之間，檢出限為0.01～2.10 μg/L，加標回收率為81.7%～103.6%，相對標準偏差為0.5%～8.0%，具有良好的穩定性和精密度。采用本方法測定3種不同產地煙葉樣品中氨基酸含量，結合多元統計分析方法進行分析，分類效果良好。

關鍵詞 4-硝基苯甲酰氯; 液相色譜-質譜聯用; 衍生; 氨基酸; 煙葉

1 引 言

氨基酸是煙葉中的初級和次級代謝產物，在陳化過程中，與還原糖發生酶及非酶催化反應或自身降解生成致香成分，是煙葉中重要的香氣前體物質。煙葉中氨基酸的組成和含量與煙葉的品質有關，每種氨基酸對香味的貢獻值不同。總氨基酸含量與評吸總得分呈現二次曲線的相關關系，與煙葉品質密切相關。因此，常作為檢測煙葉品質的重要指標，在煙葉中品質研究中具有重要作用[1，2]。

煙葉中氨基酸測定方法主要有氣相色譜法[3，4]、離子色譜法[5，6]、液相色譜法[7]和氨基酸流動分析法[8]等。由于氨基酸不易揮發，當采用氣相色譜檢測時，常與N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（N，O-bis（trimethylsilyl） trifluoroacetamide， BSTFA）等衍生化試劑反應生成易揮發物質后進行測定。由于BSTFA遇水易失效，對反應條件要求較苛刻，穩定性較差[9]。采用離子色譜測定時，基質離子干擾較大，會影響定量分析的準確性。而氨基酸不具有紫外和熒光吸收，雖可采用液相色譜-質譜聯用測定，但氨基酸極性大，不易保留，離子化效率較低[10，11]。因此，柱前衍生仍是目前氨基酸檢測的重要手段。食品和煙葉中氨基酸的檢測主要采用茚三酮作為柱前衍生試劑結合氨基酸流動分析儀進行測定，而柱前衍生結合液相色譜進行檢測較為簡便、靈敏和快速。常用的柱前衍生試劑主要有熒光胺（Fluorescamine， FA）、丹磺酰氯（Dansyl chloride， dansyl-Cl）[12，13]，在衍生的過程中，會產生副產物，影響衍生產物的測定。氯甲酸-9-芴基甲酯（Fluorene methyl chloroformate， FMOC-Cl）[14]水解產物有熒光干擾，過量的衍生化試劑需用戊烷除去，操作繁瑣，定量結果偏差較大; 2，4-二硝基氟苯（2，4-Dinitrofluorobenzene， DNFB）[15]衍生過程中需要避光處理，容易產生副產物; 6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯（AQC）[16]是氨基酸衍生化試劑，加熱衍生5 min即可完成，但試劑較昂貴，且多余的衍生化試劑水解后也會產生較強的紫外吸收，其保留時間與丙氨酸接近，對丙氨酸的測定產生干擾。為提高衍生反應速率，減少實驗操作步驟，實現批量煙葉樣品的快速測定，發展氨基酸衍生化新方法具有重要意義。 4-硝基苯甲酰氯作為醇類、胺類物質等[17～19]的衍生化試劑，其酰氯基團可與氨基酸中的氨基迅速發生酰基化反應，而硝基又可降低衍生試劑的水解速度，因此具有反應條件溫和、衍生時間短、簡便快速等特點。

本研究采用4-硝基苯甲酰氯作為衍生化試劑，與LC-MS/MS聯用測定煙葉中的氨基酸，并探究了不同產地煙葉中氨基酸含量的差異。結果表明，4-硝基苯甲酰氯可作為一種新型氨基酸衍生化試劑，應用于煙葉中氨基酸的測定。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LC-MS 8050超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀（日本島津公司）; H1850高速離心機（湖南湘儀離心機有限責任公司）; AB204-S電子天平、Mettler-Toledo FE20 臺式酸度計 （瑞士梅特勒-托利公司）; KQ5200數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）; 0.22 μm聚四氟乙烯過濾器（上海安譜科學儀器有限公司）; 色譜柱Shim-pack XR-ODS Ⅲ（200 mm × 2.0 mm，2.2 μm， 日本島津公司）。

20種氨基酸分析標準品（純度>98%，上海源葉生物科技公司）， 均為L構型; 乙腈（色譜純，DIMA公司）; 甲酸（色譜純， Sigma公司）; 4-硝基苯甲酰氯、3，5-二硝基苯甲酰氯、3-硝基苯甲酰氯（色譜純，北京百靈威科技有限公司）; 其它試劑均為分析純。實驗用水均為超純水（18.25 MΩ·cm，美國Millipore公司）。煙葉樣品由廣東中煙公司提供。

2.2 標準溶液和樣品的制備

分別稱取10.0 mg氨基酸標準品，用水溶解并定容至10.0 mL，稀釋配成10.0 mg/L混合母液，于4℃避光保存，待用。采用 0.1 mol/L NH4HCO3-NH3·H2O緩沖溶液（pH 9.0）稀釋，配制二級標準儲備液，采用逐級稀釋法配成一系列濃度的混合標準溶液。4-硝基苯甲酰氯采用無水乙腈配成10.0 mg/L的衍生試劑溶液。

按照YC/T31-1996《煙草及煙草制品試樣的制備和水分測定烘箱法》[20]處理煙葉樣品。 準確稱取100.0 mg樣品，加水萃取10 min后，離心分離后所得的上清液用0.22 μm的水相濾膜過濾，得到萃取液。取100 μL萃取液，采用0.1 mol/L NH4HCO3-NH3·H2O緩沖溶液（pH 9.0）稀釋至10.0 mL，待用。

2.3 衍生化反應

室溫下，取900 μL 10.0 μg/L氨基酸混合標準溶液，加入100 μL 10.0 mg/L 4-硝基苯甲酰氯衍生化試劑，振蕩1 min后進樣分析，完成萃取衍生，經0.22 μm 聚四氟乙烯 （PTFE） 濾膜過濾后進行測定。其反應方程式如下式。

NO2+H2NCHRCOOHpH=9NO2ONHCHRCOOH

2.4 色譜和質譜條件

色譜柱Shim-pack XR-ODS Ⅲ（200 mm×2.0 mm， 2.2 μm）; 流動相A為0.1%甲酸，B為乙腈; 梯度洗脫： 0～15 min， 5%～70% B; 15～20 min， 70%～5% B，流速為0.3 mL/min，柱溫35℃，進樣量20 μL。

電噴霧離子源（ESI）; 毛細管電壓3.0 kV; 離子源溫度300℃; 脫溶劑氣溫度400℃; 脫溶劑氣流量650 L/h; 錐孔氣流量50 L/h; 負離子掃描模式，選擇多反應監測（MRM）模式分析。

2.5 數據處理

應用SPSS-24軟件進行主成分分析和判別分析。煙葉香型由廣東中煙提供，其中1～11號產自貴州，12～23號產自湖南，24～37號產自云南。

3 結果與討論

3.1 衍生反應機理

4-硝基苯甲酰氯具有酰氯基團，可用于胺類物質的衍生，具有較高的靈敏度[21]。由于酰氯基團較易水解，引入硝基可抑制其水解的速度，當氨基酸與酰氯基團完全反應后，多余的衍生化試劑發生水解，不影響衍生產物的測定。其部分產物離子掃描圖見圖1，分別代表4種氨基酸，在負離子模式下均出現母離子峰，說明此衍生反應符合取代反應的過程。由圖1A、1B、1C可知，當采用4-硝基苯甲酰氯為衍生化試劑時，均產生m/z 122.0和150.0的碎片離子，增大了離子的響應。此外，由圖2D可知，脯氨酸作為二級氨基酸，也產生m/z 122.0的碎片離子，說明此衍生化方法具有良好的適用性，可用于煙葉中一、二級氨基酸的測定。

3.2 MRM方法的建立

分別取900 μL 10.0 μg/L氨基酸單標準溶液，加入100 μL 10.0 mg/L 4-硝基苯甲酰氯衍生化試劑反應后分別進行母離子和產物離子掃描，得出每個氨基酸衍生特征產物離子碎片。通過優化定量離子對、最優化碎裂電壓和電離能等，最終得到20種氨基酸多反應監測（MRM）參數見表1。

3.3 衍生條件的探究

3.3.1 衍生試劑的選擇 為了探究硝基苯甲酰氯的衍生效果，在相同的衍生條件下分別考察3-硝基苯甲酰氯、4-硝基苯甲酰氯、3，5-二硝基苯甲酰氯3種不同衍生化試劑的衍生效果，結果如圖2A所示。對比主要氨基酸衍生產物峰面積可知，4-硝基苯甲酰氯衍生產物峰面積更大，其衍生的效果更好，可能是因為當硝基處于對位時，能減少位阻的影響，更有利于發生親核取代反應。

3.3.2 緩沖溶液pH值的選擇 考察了衍生化過程中緩沖溶液pH值對衍生化過程的影響。4-硝基苯甲酰氯在堿性條件下可與氨基酸發生反應，故在堿性條件下研究pH值的影響。取10.0 mg/L氨基酸混合溶液，分別采用pH為8.0、8.5、9.0、9.5、10.0濃度為0.1 mol/L的NH4HCO3-HN3·H2O緩沖溶液稀釋成10.0 μg/L溶液。采用相同的方法衍生和測定，對比峰面積的差異。由圖2B可見，當pH=9.0時，除了脯氨酸的峰面積下降外，其它氨基酸的衍生效果最好，最終確定最佳pH=9.0。

3.3.3 振蕩輔助衍生 以10.0 μg/L氨基酸混合標準溶液為分析對象，考察振蕩衍生時間分別為1、5、10、15和20 min時衍生反應結果。從圖3A可見，隨著時間增長，衍生產物峰面積差異不大，最終選擇振蕩衍生時間為1 min。從圖3B可見，采用振蕩輔助衍生的效果略優于室溫下不經輔助衍生的方式，脯氨酸在振蕩條件下的衍生效果較好。最終選擇室溫下振蕩輔助衍生作為后續的衍生方式。

3.3.4 穩定性 以10.0 μg/L氨基酸混合標準溶液為分析對象，在最佳的衍生條件下反應，探究批間和日間8 h內衍生反應產物的穩定性。通過峰面積的對比，批間相對標準偏差介于1.1%～6.0%，日間衍生產物峰面積變化不大，其相對標準偏差為2.3%～10.5%。結果表明，此衍生反應產物能夠穩定存在，可以保證后續實驗中氨基酸的定量分析。

3.4 分析方法性能和實際樣品的測定

利用逐級稀釋法配制氨基酸混合標準溶液，與LC-MS/MS聯用進行測定，各氨基酸的線性范圍、相關系數、檢出限及回收率見表2，其中，天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的線性范圍為0.5～500 μg/L， 脯氨酸為0.1～1000 μg/L，其余氨基酸為0.5～100 μg/L，各氨基酸在各自線性范圍內具有良好的線性相關性，線性相關系數R2在0.9951～0.9998之間，檢出限為0.01～2.10 μg/L，加標回收率為81.7%～103.6%， 滿足前處理和分析檢測方法的要求，可用于煙葉氨基酸的測定。不同氨基酸檢測方法對比結果如表3所示，此衍生化方法衍生時間短，操作簡便快速，檢出限低，可用于氨基酸含量的檢測。圖4A和4B分別為標準溶液色譜圖和煙葉樣品色譜圖。

3.5 不同產地煙葉樣品的判別分類

選擇3個產地的37份煙葉樣品，采用本方法測定煙葉中氨基酸的含量，并結合判別分析方法對樣品進行分類和判定。樣品的KMO值為0.811，樣品顯著性較強，前3個主成分累積貢獻率為83.85%，具有初步的分類效果。其樣品的方差分析見電子版文后支持信息表S1所示。在表4中，將貴州、湖南、云南樣品分別設定為1、2、3組，采用判別分析對樣品進行分析。在自身驗證中，樣品均未產生誤判，三者的總平均準確率為100%。在交互驗證中，其中有1份貴州樣品誤判為云南煙葉，湖南煙葉有2份誤判為云南煙葉，云南煙葉有1份誤判為貴州煙葉，判別準確率分別為90.9%、83.3%和85.7%， 而交互驗證的平均準確率為86.5%，說明本方法模型可應用于不同產地煙葉樣品的預測。

4 結 論

建立了4-硝基苯甲酰氯柱前衍生與超高效液相色譜/質譜聯用測定煙葉中氨基酸的方法。此衍生反應條件溫和，衍生時間僅為1 min，衍生完成后可直接進行測定。采用本方法測定3個不同產地煙葉樣品，結合多元統計分析對產地進行分析，判別分析的準確率為86.5%，具有良好的實用性。 本方法還可用于研究氨基酸與煙葉其它品質的關系，為煙葉質量判定提供依據。

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Analysis of Amino Acids by Ultra High Performance Liquid

Chromatography-Electrospray Ion Tandem Mass Spectrometry

Using 4-Nitrobenzoyl Chloride as Precolumn Derivatization

HUANG Man-Yan1， CHEN Sen-Lin2， LIN Yun2， TAO Hong2， A Wen-Wei1，

HU Yu-Ling， YE Wei-Min2， LI Gong-Ke

1（School of Chemistry， SunYat-sen University， Guangzhou 510275， China）

2（China Tobacco Guangdong Industrial Co. Ltd.， Guangzhou 510385， China）

Abstract A pre-column derivatization method for determination of amino acids in tobacco leaves by ultra-high performance liquid chromatography-electrospray ion tandem mass spectrometry using 4-nitrobenzoyl chloride as derivatization reagent was developed. The sample was extracted by ultrasound-assisted extraction， and then the extracts were rapidly derived with 4-nitrobenzoyl chloride. The derivative reaction was performed in NH4HCO3-NH3·H2O buffer solution at pH 9.0 and room temperature with oscillation assistance for 1 min. To enhance the sensitivity， the parameters of multiple reaction monitoring were also optimized. This method had many advantages including mild reaction condition， simple procedure and short derivatization time. The method showed a good linearity with correlation coefficients of 0.9951-0.9998. The detection limits were 0.56-2.00 μg/L with RSDs of 0.5%-8.0%. This method coupled with multivariate statistical analysis method was successfully employed for determination of amino acids in tobacco leaves from three different geographical origins， showing a good classification results.

Keywords 4-Nitrobenzoyl chloride; Ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry; Derivatization; Amino acid; Classification