冰糖草莖葉總黃酮測定及其清除亞硝酸鹽的作用

勞佳麗 高麗玉 陳麗珍 魚清雅 畢進 張思程

摘? ? ? 要：為了建立冰糖草莖葉總黃酮的含量測定方法，并研究其對亞硝酸鹽的清除作用。以蘆丁為對照品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法及分光光度法測定冰糖草莖葉總黃酮含量;以Vc為對照，采用對氨基苯磺酸-鹽酸奈乙二胺分光光度法，評價總黃酮對亞硝酸鹽的清除作用。考察的結果符合定量要求，蘆丁質量濃度在4.9～78.7 μg/mL的范圍內，吸光度線性關系良好（r = 0.999 8），平均回收率為100.9%，RSD為1.7%（ n=6）。冰糖草莖葉總黃酮對亞硝酸鹽具有較好的清除作用，且總黃酮對亞硝酸鹽的清除率與用量呈正相關性，當總黃酮用量從0.5 mg增加至7 mg時，清除率從（9.83±2.49）%逐漸增加至（88.43±0.47）%，且5.0 mg的總黃酮與0.5 mg的Vc對亞硝酸鹽的清除效果相當。

關? 鍵? 詞：冰糖草;總黃酮;含量測定;清除亞硝酸鹽

中圖分類號：R 284? ? ? ?文獻標識碼： A? ? ? ?文章編號： 1671-0460（2019）10-2202-04

Abstract： A method for determining the content of total flavonoids in Scoparia dulcis L.stems and leaves was established， and its nitrite scavenging ability was studied. The content of total flavonoids in Scoparia dulcis L.stems and leaves was determined by spectrophotometry and sodium nitrite-aluminum nitrate-sodium hydroxide colorimetry using rutin as comparison sample，and p-aminobenzenesulfonic acid-naphthylamine hydrochloride spectrophotometry was employed to evaluate its nitrite scavenging ability with vitamin C as the control. The results were in accordance with the quantitative requirements by the methodological study. There was a good linear relationship （ r =0.999 8） in the range of 4.9～78.7μg/mL of rutin，and the average recovery ratio was 100.9% with RSD less than 1.7% （n=6）. The method is simple，rapid，accurate and credible. The total flavonoids in Scoparia dulcis L.stems and leaves had good scavenging effect on nitrite.The clearance rate to nitrite from total flavonoids was positively correlated with its concentration. The clearance rate increased from （9.83±2.49）% to （88.43±0.47）% when the average of flavonoids was from 0.5mg to 7.0 mg.The nitrite scavenging effect of 5.0 mg total flavonoids was equivalent to that of 0.5 mg vitamin C.

Key words： Scoparia dulcis L; Total flavonoids; Determination of content; Scavenging nitrite

冰糖草為玄參科野甘草屬植物野甘草Scoparia dulcis L.的全草，廣泛生長于我國海南各地，及廣西、廣東、福建、云南等熱帶與亞熱帶地區。冰糖草味甘，性涼，是一味常用民族藥;其具有清熱解毒、健胃鎮咳、利尿消腫、祛風止癢等功效，常用于肺熱咳嗽、小便不利、濕熱黃疸、熱痱濕疹、胃病腸炎和高血壓等癥[1，2]。海南黎族民間常用其配方入藥治療疾病[3]。冰糖草的研究主要有在質量控制[3]、化學成分[4，5]、藥理活性[6，7]等方面，也表明其含有黃酮類、二萜類、生物堿等化學成分[2]。總黃酮是植物次級代謝產物，存在于高等植物的所有部分，尤其是葉和花中，具有清除氧自由基抗氧化、防治心血管疾病、抗菌抗病毒、抗腫瘤抗癌、抗損傷保肝、調節免疫等多種生理與藥理活性[8]，在醫藥、食品保健等方面有廣泛應用。目前有少量文獻報道冰糖草中總黃酮的提取工藝含量測定方面的研究[9-11]，但關于冰糖草莖葉總黃酮含量及其清除亞硝酸鹽的研究尚未見報道。且考慮到測定總黃酮含量的方法的簡便快捷與可行性，多采用分光光度法測定黃酮類化合物含量[9，10]。鑒于此，通過提取冰糖草莖葉總黃酮，建立其含量測定方法，并考察其亞硝酸鹽清除能力，旨在為冰糖草的有效成分的進一步開發利用提供科學的參考依據。

1? 實驗部分

1.1? 材料與試劑

冰糖草采自海南省萬寧市龍滾鎮，經海南醫學院藥學院曾念開教授鑒定為玄參科植物野甘草Scoparia dulcis L.的全草，分取莖葉部分，烘干粉粹，過80目篩，密封低溫保存備用。蘆丁對照品（上海源葉，純度≥98%），乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸鹽酸萘乙二胺等均為分析純;實驗用水為雙蒸水。

1.2? 儀器

DFY-1000D封閉式粉碎機（林大機械），DHG-9075A電熱干燥箱（上海一恒），SK3210HP超聲波清洗器（上海科導），SHZ-D循環水式真空泵（鞏義予華），RE-2000B型旋轉蒸發器（上海亞榮），AE100電子分析天平（上海梅特勒-托利多），UV-1600紫外可見分光光度計（北京瑞利）。

1.3? 方法

1.3.1? 對照品溶液的制備

精密稱取在105 ℃下干燥至恒重的蘆丁對照品12.3 mg，置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇適量，超聲5 min使溶解，冷卻后定容，混勻得質量濃度為0.246 0 mg/mL蘆丁對照品溶液。

1.3.2? 供試品溶液的制備[11]

稱取冰糖草莖葉粉末4.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，按料液比1 g∶30 mL加入80%乙醇充分浸泡;在50 ℃、250 W超聲功率下超聲提取80 min，抽濾，提取2次，合并濾液，定容于容量瓶即得供試品溶液。

1.3.3? 含量測定方法[9，10]

準確吸取供試品溶液2 mL加入25 mL容量瓶內，分別加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻暗置6 min;加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻暗置6 min;最后加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，加蒸餾水定容，搖勻靜置15 min;以試劑空白作參比，在510 nm波長處測定吸光度;按（1）式計算：

總黃酮含量：w =（c×v×d）/m? ? ? ? （1）

式中：w—冰糖草莖葉總黃酮含量，mg/g;

c—根據標準曲線計算的總黃酮濃度，mg/mL;

v—提取液（即供試品溶液）總體積，mL;

d—稀釋倍數;

m—冰糖草莖葉粉末質量，g。

1.3.4? 方法學考察[12]

（1）線性關系考察

準確吸取蘆丁對照品溶液0.5、1、2、4、6、8 mL，分別置于25 mL容量瓶內，按“1.3.3”項下方法處理后測定吸光度，并以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

（2）精密度試驗

準確吸取供試品溶液2 mL，按“1.3.3”項下方法處理后測定吸光度，連續測定6次，計算RSD值，考查方法的儀器精密度。

（3）穩定性試驗

準確吸取同一供試品溶液2 mL，按“1.3.3”項下方法處理，在室溫和室內光照條件下密閉放置，在0～120 min內每隔20 min重復測定其吸光度，計算RSD值，考查供試品溶液在相同條件下放置3 h的穩定性。

（4）加樣回收率試驗

精密稱取已知總黃酮含量為25.13 mg/g的冰糖草莖葉粉末2.0 g，6份，加入一定量的蘆丁對照品，按“1.3.2”項下方法制備供試品溶液;準確吸取供試品溶液各2 mL，按“1.3.3”項下方法處理后測定吸光度，計算回收率和RSD值，考查方法的可行性和準確度。

1.3.5? 樣品測定

精密稱取冰糖草莖葉粉末4.0 g，6份，按“1.3.2”項下方法處理后制備樣品溶液;準確量取樣品溶液各2 mL，按“1.3.3”項下方法處理后測定吸光度，計算總黃酮含量和RSD值。

1.3.6? 冰糖草莖葉總黃酮對亞硝酸鹽的清除作用

將冰糖草莖葉總黃酮提取液合并減壓濃縮即得濃縮液;準確吸取提取液的濃縮液，以蘆丁為對照品測定其總黃酮含量，再將該濃縮液用70%乙醇稀釋到1 mg/mL待測樣液，用于實驗。采用對氨基苯磺酸-鹽酸奈乙二胺分光光度法及參照李容等方法略作修改[13-14]。在比色管中分別加入一定量的冰糖草莖葉總黃酮溶液、2 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉溶液，勻后加入2 mL 0.4%對氨基苯磺酸，混勻后靜置5 min，再加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，加蒸餾水定容至25 mL，混勻后靜置15 min，在確定的最大吸收波長538 nm下測定吸光值A樣品，以80%乙醇代替總黃酮溶液的空白對照試驗測定吸光度A對照。總黃酮粗提物對亞硝酸鹽的清除率按（2）式計算：

亞硝酸鹽清除率=（A對照-A樣品）/A對照×100%? （2）

2? 結果與分析

2.1? 方法學考察結果

2.1.1? 蘆丁標準曲線

以蘆丁質量濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，采用Excel繪制了蘆丁標準曲線，分析得線性回歸方程為：A = 11.186 C - 0.008 8，r = 0.999 8。結果表明蘆丁質量濃度在4.9～78.7 μg/mL范圍內呈良好線性關系，符合定量分析要求。

2.1.2? 精密度試驗

由試驗結果可知，供試品溶液的6次測試的吸光度RSD值為1.08%（n=6），小于2 %，表明該方法具有良好的精密度，符合測定要求。

2.1.3? 穩定性試驗

由試驗結果可知，室溫條件下在0～120 min內供試品溶液的吸光度RSD值為1.03%（n=7），小于2%。表明在測定時間內供試品溶液是穩定的，經時穩定性符合一般分析時間要求。

2.1.4? 加樣回收率試驗

試驗結果見表1，可知回收率值在98.6%～103.1%之間波動，回收率平均值為100.9%，RSD值為1.7% （n=6），小于2%。表明該方法準確度良好，符合測定要求。

2.2? 冰糖草莖葉總黃酮含量測定

測定結果見表2，平均含量為25.13 mg/g，RSD 值為1.14% （n=6），小于2%。

2.3? 冰糖草莖葉總黃酮對亞硝酸鹽的清除作用

冰糖草莖葉總黃酮和Vc對亞硝酸鹽的清除效率結果見表3，由表中數據繪制了總黃酮和Vc用量對清除率的關系曲線見圖1。

由圖1（a）可知Vc的用量與清除率基本上呈正相關性。當Vc的用量為0.1 mg時，其對亞硝酸鹽的清除率達到48.29%，隨用量增大，清除率明顯增強，且當增大到2.0 mg時，清除率可達到100%。表明Vc具有很好的清除亞硝酸鹽作用。

由圖1（b）可知總黃酮的用量與清除率基本上呈正相關性。當總黃酮的用量較小為0.5 mg時，對亞硝酸鹽的清除作用較弱為9.83%，隨用量增加至4.0 mg時，對亞硝酸鹽的清除率明顯提高到60.54%，繼續增加用量從4.0 mg到7.0 mg，清除率繼續由82.35%增強到88.43%;隨后再增加用量，清除率不再增加，基本達到一個平衡。表明冰糖草莖葉總黃酮具有較強的清除亞硝酸鹽的能力，且5.0 mg的總黃酮與0.5 mg的Vc對亞硝酸鹽的清除效果相當。

3? 結 論

黃酮類化合物是指母核具有C6-C3-C6基本骨架，且常有羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等取代基的一類化合物，其常與糖結合成苷類，小部分以游離態苷元的形式存在[8]。采用超聲波輔助乙醇提取法提取冰糖草莖葉總黃酮，應用分光光度法建立了測定總黃酮含量的方法，即以蘆丁為對照品，經亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法顯色后測得冰糖草莖葉總黃酮含量為25.13 mg/g，高于譚小玉[3]采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色反應體系所測得的海南冰糖草中總黃酮的含量16.948 mg/g，這可能是由生長環境、氣候變化等因素導致總黃酮含量有所差異，更有待進一步的深入研究。該測定方法精密度好、穩定，加樣回收率值在98.6%～103.1%之間，達到了定量分析的要求;操作簡便快速，準確可靠，為冰糖草總黃酮的深入研究和開發利用提供參考。

亞硝酸鹽是具有致癌作用N-亞硝基化合物生成的前體物質[13]，研究表明胃癌、食道癌、肝癌等癌癥發病率與人體對亞硝酸鹽的攝入量密切相關[15]，所以尋找有效的清除亞硝酸鹽或其前體的物質是防癌的途徑之一。冰糖草莖葉總黃酮對亞硝酸鹽消除實驗表明，隨總黃酮用量的增加，其清除亞硝酸鹽的能力明顯增強，清除率可達到88.43%，且5.0 mg的總黃酮與0.5 mg的Vc對亞硝酸鹽的清除效果相當，說明冰糖草莖葉總黃酮有較強的清除亞硝酸鹽作用，這可能與抗氧化活性有關，可為冰糖草的進一步開發利用提供理論依據與新的思路。

參考文獻：

[1] 陳煥庸. 海南植物志[M]. 北京：科學出版社，1974：497.

[2] 萬文婷，馬運運， 許利嘉，等. 野甘草的現代研究概述和應用前景分析[J]. 中草藥，2015，46（16）：2492-2498.

[3] 譚小玉.海南黎藥冰糖草藥材質量標準研究[J]. 中國民族民間醫藥，2016，25（21）：20-22

[4] 陳麗珍，艾朝暉，蔡藍潔，等. 冰糖草中總酚酸的含量測定[J]. 中國民族民間醫藥，2015，24（10）：10-12.

[5] 姚亮，黃健軍.冰糖草揮發油化學成分的 GC-MS 分析[J]. 中國實驗方劑學雜志，2012，18（5）：101-103.

[6] 劉波，陸明，劉凡.野甘草乙醇提取物治療大鼠胃潰瘍作用的研究[J]. 現代中西醫結合雜志，2007，16（19）：2654.

[7] Latha M，Pari L，Ramkumar K M，et al. Antidiabetic effects of scoparic acid D isolated from Scoparia dulcis in rats with streptozotocin- induced diabetes[J]. Nat Prod Res，2009，23（16）：1528-1540.

[8] 任珊珊，包保全，毛婷，等.中藥中總黃酮的含量測定方法研究進展[J]. 北方藥學，2015，12（3）：112-115.

[9] 馬雯芳，鄧慧連，蔡毅，等. 冰糖草總黃酮含量測定及顯色方法優化[J]. 中國實驗方劑學雜志，2013，19（3）：112-115.

[10]曾祥燕，鄧慧連，顏萍花，等.冰糖草總黃酮提取工藝優選及含量測定[J]. 廣西中醫藥，2015，38（6）：66-70.

[11]魚清雅，郭從嘉，畢進，等. 正交試驗法優選海南黎藥冰糖草莖葉中總黃酮成分的提取工藝[J]. 陜西中醫，2019，40（1）：131-134.

[12]李修偉，劉美璇，紀明山，等.紫穗槐果實中總黃酮提取與含量測定[J]. 河北農業大學學報，2018，41（4）：77-80.

[13] 郭金全，李富蘭.亞硝酸鹽檢測方法研究進展[J]. 當代化工，2009，38（5）：546-549.

[14]李容，梁榕珊，方婕穎，等.廣金錢草多糖的超聲波提取及其對亞硝酸鹽的清除作用研究[J]. 中國食品添加劑，2017，66（5）：75-79.

[15]李飛陽，姚文紅，孫立梅，等.關山櫻花總黃酮含量測定及其亞硝酸鹽清除作用[J]. 山東農業科學，2016，48（10）：140-144.