β-欖香烯與姬松茸萃取物的抗腫瘤作用和藥理學研究*

薛天樂，王 慶，孫守國，劉耀武**

（1.安徽省中醫藥科學院亳州中醫藥研究所，安徽 亳州 236800；2.安徽九洲方圓制藥有限公司，安徽 亳州236800）

伴隨著現代藥理學研究的不斷深入，越來越多具有抗腫瘤作用的有效成分開始被應用于臨床腫瘤治療中[1-2]。β-欖香烯是一種分離自莪術中的有效成分，這種成分的動物試驗證實，其對某些惡性腫瘤具有一定的抗腫瘤作用[3-5]。而食用菌中的功能性生物活性成分使得其逐漸成為藥理學研究的熱點[6]。為了驗證β-欖香烯與食用菌萃取物的作用，本研究以動物試驗形式進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

取60只純系小鼠作為研究對象，隨機分為肝癌對照組（n=15）、肝癌用藥組（n=15）、艾氏腹水癌對照組（n=15）、艾氏腹水癌（n=15） 共4個組別。4組小鼠均包含雌鼠、雄鼠，體重19 g～23 g，性別及體重差異均不顯著。

1.1.2 藥物

β-欖香烯：取莪術（產地：浙江溫州瑞安縣）根莖揮發油，提取β-欖香烯成分。助溶劑選用5%濃度吐溫-80。食用菌萃取物：將姬松茸（福州華盛食品有限公司）經粉碎、預處理、熱水浸提以及濾渣復提等流程，制備萃取物。

1.2 方法

1.2.1 抗腫瘤試驗

嚴格按照抗癌藥物會議制定標準，針對各組純系小鼠開展抗腫瘤試驗。其中，肝癌對照組小鼠的處理方法為，于合并肝癌條件下，按照0.2 g·kg-1劑量給予肝癌對照組小鼠試劑吐溫-80，經腹腔給藥8次；肝癌用藥組小鼠的處理方法：于合并肝癌條件下，按50 mg·kg-1劑量，經腹腔連續給予純系小鼠注射適量β-欖香烯，并按照10 mg·kg-1劑量，給予肝癌用藥組純系小鼠連續注射8次姬松茸萃取物。艾氏腹水癌對照組小鼠的處理方法為，按照0.2 g·kg-1劑量，經腹腔給予純系小鼠注射適量吐溫-80，注射次數為7次。艾氏腹水癌用藥組小鼠的處理方法：按照50 mg·kg-1劑量，經腹腔給予純系小鼠注射適量β-欖香烯，注射次數為連續注射7次；同時按照10 mg·kg-1劑量，給予艾氏腹水癌純系小鼠注射適量姬松茸萃取物。

1.2.2 免疫試驗

經小鼠延緩型超敏反應評估β-欖香烯與食用菌萃取物對小鼠免疫機制的影響。試驗流程為經各組純系小鼠左側腳墊皮下注入濃度2%，即2×108個/mL的綿羊紅細胞，等待4 d后，再次經小鼠右側腳墊相同位置注入等劑量綿羊紅細胞。分別于攻擊前后，精確測定各組小鼠右側腳墊的厚度變化狀況。

1.2.3 癌細胞分離指數試驗

取第7天艾氏腹水癌純系小鼠，按照50 mg·kg-1劑量經腹腔注射β-欖香烯，以10 mg·kg-1劑量經腹腔注入姬松茸萃取物，分別于用藥后0和8 h，取冰乙酸-甲醇（混合比例為1∶3） 固定標本，固定處理結束后，以Giemsa染色法染色。將小鼠標本置于40×10倍顯微鏡下，觀察其癌細胞分裂指數（計算標準：計數1 000個癌細胞中的分裂細胞數）。

1.2.4 肝癌細胞影響試驗

取人體肝癌標本培養的03上皮細胞肝癌株以1640培養液進行傳代培養，培養方法為：向培養液中混入20%濃度的小牛血清。最終獲得15萬/mL肝癌細胞。分別向培養液中混入吐溫-80、β-欖香烯與姬松茸萃取物。混合后按照每日1次的頻率，定期取樣，觀察培養液中的肝癌細胞形態是否出現改變，并統計肝癌細胞的臺盼蘭著色狀況。

1.2.5 癌細胞核酸測定

給予純系小鼠接種艾氏腹水癌細胞后第5天，經腹腔給予純系小鼠注入50 mg·kg-1β-欖香烯、10 mg·kg-1姬松茸萃取物，連續注射3次（每日1次），于第7天抽吸純系小鼠腹水，經腹水標本測定癌細胞RNA、DNA含量水平。

1.3 觀察指標

分析β-欖香烯與食用菌萃取物的抗腫瘤作用；評估β-欖香烯與食用菌萃取物對小鼠免疫反應的影響；判斷β-欖香烯與食用菌萃取物對癌細胞分離指數的影響；評價β-欖香烯與食用菌萃取物對肝癌細胞的殺傷作用；統計β-欖香烯與食用菌萃取物對癌細胞RNA合成及DNA合成的影響。

1.4 統計學方法

以 SPSS 17.0 軟件統計。P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果

2.1 抗腫瘤作用

抗腫瘤作用見表1。

由表1可知，肝癌對照組生命延長率6.67%，低于肝癌用藥組（P＜0.05）；艾氏腹水癌對照組生命延長率 13.33%，低于艾氏腹水癌用藥組 （P＜0.05）。

2.2 對小鼠免疫反應的影響

對小鼠免疫反應的影響見表2。

表1 抗腫瘤作用Tab.1 Anti-tamor effect

表2 對小鼠免疫反應的影響Tab.2 Effect on immune response in mice

由表2可知，吐溫-80對照組24 h腳墊增加厚度 （7.26±3.13） mm、48 h 增加厚度 （3.96 ± 1.24）mm，均高于β-欖香烯與姬松茸萃取物聯合用藥組（P＜0.05）。

2.3 對癌細胞分離指數的影響

對癌細胞分離指數的影響見表3。

表3 對癌細胞分離指數的影響Tab.3 Effect on cancer cell separation index

由表3可知，吐溫-80對照組用藥后立即癌細胞分裂指數 （37.1 ± 5.2）‰、用藥后 8 h（34.2 ±4.2）‰，均高于β-欖香烯與姬松茸萃取物聯合用藥組，差異不顯著。

2.4 對肝癌細胞的殺傷作用

采取體外培養法培養肝癌細胞。吐溫-80對比試驗結果顯示，24 h時，肝癌細胞形態無明顯改變，臺盼蘭著色率水平為9.5%；48 h時，少部分肝癌細胞外部形態改變，臺盼蘭著色率水平升高至18.9%。而向肝癌細胞培養液中混入 1 mg·mL-1～2 mg·mL-1β-欖香烯及0.5 mg·mL-1姬松茸萃取物，持續作用24 h時的影響作用顯示：肝癌細胞核伴明顯固縮，癌細胞邊緣不規則，臺盼蘭著色率水平為46.2%；持續作用48 h時，β-欖香烯與姬松茸萃取物的殺傷作用顯示，大部分肝癌細胞的外部形態改變，且伴有細胞碎裂，臺盼蘭著色率水平為65.9%。

2.5 對癌細胞RNA合成及DNA合成的影響

對癌細胞RNA合成及DNA合成的影響見表4。

表4 對癌細胞RNA合成及DNA合成的影響Tab.4 Effect on RNA synthesis and DNA synthesis of cancer cells

由表4可知，吐溫-80對照組RNA壓積細胞含量 （590.32 ± 142.81） μg·50-1μL-1、DNA 含量（228.34±40.61） μg·50-1μL-1，均高于 β-欖香烯與姬松茸萃取物聯合用藥組 （P＜0.05）。

3 討論

近年來，肝癌、腹水癌等惡性腫瘤的發病率持續升高[7]。伴隨著惡性腫瘤患者規模的不斷擴大，人們對惡性腫瘤治療的關注度逐漸升高[8]。從目前惡性腫瘤的治療體系來看，其治療方法以手術治療、藥物治療為主[9]。其中，手術治療雖然具備一定的價值，但其適用范圍有限，且部分惡性腫瘤患者經手術治療后，還會面臨術后復發的問題[9-10]；而在藥物治療方面，可用于惡性腫瘤治療的藥物類型較多，但其效果整體欠佳。事實上，惡性腫瘤患者及家屬更傾向于選擇一種更加安全、有效、無創的治療方案[11-12]。在這一背景下，越來越多的新型抗腫瘤藥物或具備抗腫瘤作用的成分，開始被應用于臨床腫瘤干預中。

β-欖香烯是一種分離自莪術的二類非細胞毒性抗腫瘤藥物。相對于其他抗腫瘤藥物而言，這種來源于溫郁金的抗腫瘤藥物具有明顯的高效性、廣譜抗腫瘤及低毒性等優勢[13]。β-欖香烯的抗腫瘤作用早有文獻報道，但這種藥物的抗腫瘤作用機制、藥理學特征尚未完全明確[14]。

食用菌萃取物也是一種被明確證實具有抗腫瘤作用的成分[15]。事實上，多種食用菌萃取物均具有一定的抗腫瘤作用。其中，姬松茸的動物實驗結果顯示，這種食用菌中的有效成分同時具備殺菌、抗腫瘤、抗突變以及增強免疫力等多種作用[16]。

從理論角度來講，將β-欖香烯與食用菌萃取物聯用，可發揮出更加顯著的抗腫瘤作用。為了驗證二者聯用的價值，本研究中主要采取動物試驗形式，評估聯合用藥的抗腫瘤作用，結果提示，肝癌用藥組生命延長率80.00%、艾氏腹水癌用藥組生命延長率 93.33%，均高于對照組 （P＜0.05），表明 β-欖香烯與姬松茸萃取物可對肝癌、艾氏腹水癌產生一定的抗腫瘤作用。

綜上所述，β-欖香烯與姬松茸萃取物的抗腫瘤作用主要與對癌細胞RNA、DNA合成的抑制機制有關。