抗青霉芽孢桿菌的篩選及抑菌物質(zhì)分析

邱博書，烏日娜，史海粟，張 妍，張鶴男，陳玉婷，武俊瑞*

（沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

自然發(fā)酵豆醬是一種以大豆為原料利用微生物發(fā)酵而成的半流態(tài)傳統(tǒng)調(diào)味品[1]。豆醬因其獨特的風味，濃郁的香氣和豐富的營養(yǎng)價值，一直廣受百姓喜愛，成為餐桌上必備的佐餐食品。豆醬中復雜龐大的微生物體系是一個寶庫，具有極大的開發(fā)價值。

青霉菌是引起水果蔬菜、谷物、飼料等在貯藏運輸過程中發(fā)生腐敗變質(zhì)的主要真菌[2]。青霉菌污染嚴重影響了產(chǎn)品的外觀，不僅降低產(chǎn)品自身的營養(yǎng)價值還會產(chǎn)生展青霉素、黃綠青霉素、青霉酸、橘青霉素[3-4]等真菌毒素，從而引發(fā)食用者急性中毒或慢性毒害，造成巨大的危害和經(jīng)濟損失。

目前防止食品發(fā)生由真菌引起的腐敗變質(zhì)主要依靠化學防腐劑，但存在毒性風險，過于頻繁的使用還會導致耐藥性的菌群出現(xiàn)。而使用生物防腐劑不但能減少對產(chǎn)品本身的影響還可以減少化學殘留，降低對人體的危害。

芽孢桿菌是自然發(fā)酵豆醬中的優(yōu)勢細菌[5]，對豆醬品質(zhì)的形成起到至關重要的作用。芽孢桿菌能代謝產(chǎn)生大量酶類及抗菌物質(zhì)，而且菌體本身抗逆性強，對培養(yǎng)條件的需求較低，有利于生物抗菌劑的生產(chǎn)加工[6]。目前，國內(nèi)外大量研究顯示芽孢桿菌可產(chǎn)生脂肽類、蛋白類等代謝產(chǎn)物對黃曲霉、青霉、灰霉等真菌具有良好的抑菌效果[7-8]，但用于食品的防腐保鮮劑的生產(chǎn)還需對其安全性進行進一步的探究。所以，尋找來源安全、抑菌效果顯著的芽孢桿菌是亟待解決的問題。本實驗采用對峙培養(yǎng)法和瓊脂柱法從自然發(fā)酵豆醬中分離出對青霉菌具有顯著抑制作用的芽孢桿菌，并對抑菌物質(zhì)的性質(zhì)進行研究，對減少青霉菌污染引起的危害具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自然發(fā)酵農(nóng)家豆醬采自黑龍江的齊齊哈爾、大慶、佳木斯以及遼寧的康平、沈陽、遼陽、朝陽和本溪8 個地區(qū)。

細菌培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.2～7.4）。真菌培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L，自然pH值），固體培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂粉，121 ℃，20 min滅菌備用。

青霉菌（Penicillium polonicum）為實驗室鑒定保藏；菌株DNA提取試劑盒及聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）所用試劑 北京艾德萊生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

GMSX280手提式壓力蒸汽滅菌器 北京中科路達試驗儀器有限公司；QYC-200恒溫培養(yǎng)搖床 上海?，攲嶒炘O備有限公司；Mastercycler nexus SX1 PCR儀Eppendorf中國有限公司；UVP GDS-8000凝膠成像系統(tǒng)美國UVP公司；Regulus 8100場發(fā)射掃描電子顯微鏡、HT 7700透射電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢桿菌的分離

取1 g豆醬樣品，加入到9 mL的無菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，80 ℃水浴20 min，用無菌生理鹽水進行10 倍梯度稀釋后取0.1 mL，涂布在LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落進行劃線純化，對純化得到的菌株進行革蘭氏染色和芽孢染色，選擇有芽孢產(chǎn)生的革蘭氏陽性菌株進行下一步實驗。

1.3.2 抗青霉芽孢桿菌的篩選

采用平板對峙法[9]初步篩選對青霉菌生長有抑制作用的芽孢桿菌，然后采用瓊脂柱法[10]進行復篩并計算其抑菌率。瓊脂柱法：將芽孢桿菌的發(fā)酵上清液按照1∶10（V/V）的比例添加到PDA培養(yǎng)基中，用6 mm的打孔器取青霉菌菌塊放置在PDA培養(yǎng)基中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)，每24 h采用十字交叉法測量菌體直徑，至空白對照培養(yǎng)皿中的菌體長滿為止，抑菌率計算公式如下：

1.3.3 抗青霉芽孢桿菌的鑒定

采用試劑盒法[11-12]提取芽孢桿菌基因組DNA，利用微量紫外分光光度計檢測菌株的DNA質(zhì)量濃度和純度。以芽孢桿菌菌株基因組DNA為模板，16S rDNA擴增引物選擇細菌通用引物：正向引物為27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）；反向引物為1495r（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）。PCR擴增反應體系（50 μL）：上下游引物各2 μL（10 pmol/μL），10×PCR Buffer（含Mg2＋）2 μL，Taq DNA polymerase 0.6 μL，dNTP MIX 4 μL?；蚪MDNA模板在反應體系內(nèi)最終質(zhì)量濃度為200 ng/μL，剩余的體系體積用ddH2O補齊。PCR擴增反應條件[13]：94 ℃ 、5 min預變性；94 ℃、30 s變性，58 ℃、30 s退火（復性），72 ℃、1 min延伸，30 個循環(huán)；72 ℃、10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物送至上海派森諾生物醫(yī)藥科技有限公司測序。將測序得到的16S rRNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中標準菌株序列進行BLAST同源性進行比對。

1.3.4 掃描電鏡觀測青霉菌菌絲狀態(tài)

將青霉菌菌絲用體積分數(shù)3.5%的戊二醛固定液固定24 h，用pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液每20 min沖洗1 次，共沖洗5 次，后用丙酮進行梯度脫水（體積分數(shù)分別為30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），每次間隔15 min，其中100%丙酮重復3 次，純醋酸異戊酯置換2 次，每次30 min。CO2臨界點干燥、粘樣、鍍膜后在掃描電鏡下觀察、拍照。

1.3.5 芽孢桿菌抑制青霉菌有效成分分析

1.3.5.1 pH值對發(fā)酵上清液抑制青霉菌活性的影響

用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)芽孢桿菌發(fā)酵上清液pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，處理12 h后再調(diào)節(jié)pH值至中性。用瓊脂柱法測定經(jīng)過不同pH值處理的發(fā)酵上清液的抑菌活性，以未經(jīng)處理的上清液為對照，每個處理重復3 次。

1.3.5.2 溫度對發(fā)酵上清液抑制青霉菌活性的影響

將芽孢桿菌的發(fā)酵上清液分別在10、20、30、40、50、60、70、80 ℃條件下處理30 min，用瓊脂柱法測定經(jīng)過不同溫度處理的發(fā)酵上清液的抑菌活性，以未處理的上清液為空白對照，每個處理重復3 次。

1.3.5.3 蛋白酶對發(fā)酵上清液抑制青霉菌活性的影響

向芽孢桿菌發(fā)酵上清液中加入胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K使其最終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，37 ℃水浴處理2 h，用瓊脂柱法測定處理后發(fā)酵上清液的抑菌活性，以未處理的上清液為對照，每個處理重復3 次。

1.3.6 SDS-PAGE測定抑菌物質(zhì)提取物分子質(zhì)量

前期實驗證明80%飽和度的硫酸銨為最佳提取濃度，因此以80%飽和度的硫酸銨提取抑菌物質(zhì)，并對提取物抑菌作用進行驗證。然后利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrymyl gel electrophoresis，SDS-PAGE）測定抑菌提取物的分子質(zhì)量大小。分離膠15%，濃縮膠5%，濃縮膠電壓恒定80 V，分離膠電壓恒定120 V，考馬斯亮藍染色30 min，脫色液脫色至背景色消失條帶清晰[14]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 抗青霉芽孢桿菌的分離及篩選

從采自8 個地區(qū)的10 份自然發(fā)酵豆醬樣品中共分離出40 株菌落純芽孢桿菌，如表1所示。將篩選出的芽孢桿菌進行穿刺保藏，以備后續(xù)實驗使用。

表1 芽孢桿菌的來源及分布Table 1 Sources and distribution of Bacillus strains

將分離出的芽孢桿菌與青霉菌進行對峙實驗，28 ℃培養(yǎng)24 h后每12 h觀察一次，至培養(yǎng)72 h后停止，共篩選出2 株對青霉菌具有生長抑制的芽孢桿菌菌株QQHE-2和DQ1-3，如圖1所示。通過觀察發(fā)現(xiàn)對峙實驗過程中QQHE-2菌株周圍無青霉菌生長，而空白對照組的青霉菌孢子分散至整個培養(yǎng)皿，形成多個青霉菌菌落。DQ1-3菌株實驗組青霉菌雖然形成了多個菌落，但在芽孢桿菌菌落周圍并無青霉菌生長，可以判斷出芽孢桿菌QQHE-2和DQ1-3菌株對青霉菌產(chǎn)生了生長抑制。由于對峙實驗是兩菌共生體系，所以產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因可能是青霉菌和芽孢桿菌2種微生物之間存在生長競爭關系，也可能是芽孢桿菌分泌的代謝產(chǎn)物對青霉菌的生長存在抑制效果。因此進行瓊脂柱法實驗，將青霉菌接種在添加了芽孢桿菌的無菌發(fā)酵上清液的PDA培養(yǎng)基中，觀察生長狀態(tài)進行進一步的探究。

圖1 QQHE-2菌株和DQ1-3菌株對峙實驗圖Fig. 1 Confrontation of QQHE-2 and DQ1-3 against Penicillium

如圖2所示，在培養(yǎng)72 h后，對照組青霉菌菌絲已長滿整個培養(yǎng)皿，而含有QQHE-2菌株發(fā)酵上清液的培養(yǎng)皿中青霉菌的生長受到強烈抑制，經(jīng)計算抑菌率高達83.42%。觀察菌落發(fā)現(xiàn)實驗組僅在接種的青霉菌菌塊邊緣有少量擴散，培養(yǎng)皿其他部位有少量菌絲生長，但顏色呈淡黃色，較對照組正常生長的菌絲相比在形態(tài)上存在很大差異。在添加DQ1-3菌株無菌發(fā)酵上清液的培養(yǎng)皿中有少量青霉菌生長，經(jīng)計算抑菌率為46.83%。觀察菌落形態(tài)發(fā)現(xiàn)，實驗組生長的青霉菌菌落更大，菌絲更為疏松，邊界不明顯。而對照組的菌落較小，菌絲致密，邊界清晰?？偨Y2組實驗可以推斷出芽孢桿菌的發(fā)酵上清液中含有能夠抑制青霉菌生長發(fā)育的物質(zhì)，能夠抑制孢子的萌發(fā)和菌體的生長，能夠改變菌絲體的正常形態(tài)，而且3 次重復實驗結果波動不大。因此QQHE-2和DQ1-3菌株為能夠抑制青霉菌生長的目標菌株。

圖2 QQHE-2菌株和DQ1-3菌株瓊脂柱法抑菌圖Fig. 2 Antimicrobial activity of QQHE-2 and DQ1-3 tested by agar column method

2.2 芽孢桿菌菌株的16S rRNA鑒定

利用微量紫外-可見分光光度計測定菌株QQHE-2和DQ1-3的DNA質(zhì)量濃度和純度，結果顯示DNA質(zhì)量濃度均達到200 ng/μL，且OD260nm/OD280nm值處于1.6～1.8之間，符合PCR擴增實驗標準，可以進行下一步實驗。用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測后發(fā)現(xiàn)，菌株的擴增產(chǎn)物在1 500 bp處有單一明亮的條帶，符合測序工作的要求。將得到的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中標準菌株序列進行BLAST同源性比對，結果顯示QQHE-2和DQ1-3菌株皆為枯草芽孢桿菌，同源性均達到99%。利用MEGA.10.4進行序列相似性計算和系統(tǒng)發(fā)育分析，結果見圖3。

圖3 菌株QQHE-2和DQ1-3菌株的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of QQHE-2 and DQ1-3 based on 16S rRNA gene sequences

2.3 掃描電鏡觀察菌絲形態(tài)

圖4 菌株QQHE-2對青霉菌菌絲的影響Fig. 4 Effect of QQHE-2 on mycelial morphology of P. polonicum observed by SEM

圖5 菌株QQHE-2對青霉菌孢子梗的影響Fig. 5 Effect of QQHE-2 on spore of P. polonicum observed by SEM

通過掃描電鏡對青霉菌的菌絲進行觀察，結果如圖4所示。對照組菌絲飽滿粗細均勻，表面光滑，形態(tài)較為規(guī)整，伸展良好。而實驗組菌絲量與對照組有明顯差距，而且菌絲干癟細小，較為彎曲。圖5為對孢子梗的觀察結果，對照組孢子梗粗壯均勻，孢子分布密集，而且孢子飽滿圓滑，產(chǎn)量豐富。而實驗組孢子梗干癟細小，而且孢子量少，孢子顆粒細小且不飽滿。綜上所述，芽孢桿菌QQHE-2的發(fā)酵上清液對青霉菌的生長產(chǎn)生了很大的影響，改變了青霉菌菌絲的生長狀態(tài)，降低了孢子的產(chǎn)量，抑制了青霉菌的正常生長。

2.4 芽孢桿菌抑制青霉菌有效成分分析

本實驗通過pH值調(diào)節(jié)、溫度調(diào)節(jié)和蛋白酶處理分別對菌株QQHE-2和DQ1-3的發(fā)酵液中抑制青霉菌生長的有效成分進行了分析。已知芽孢桿菌QQHE-2和DQ1-3發(fā)酵上清液的原始pH值為7.42和7.26。如圖6所示，pH值為7時兩株菌發(fā)酵上清液的抑菌效果最好，隨著pH值的降低，兩株菌對青霉菌的抑制能力也在降低，當pH值為3時QQHE-2和DQ1-3菌株的抑菌率與pH值為7時相比分別降低了50%和60%。菌株QQHE-2的抑菌穩(wěn)定性在堿性條件下稍有下降，而菌株DQ1-3在pH值高于8后抑菌率大幅下降。可見，兩株菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的酸耐受性都很低，但菌株QQHE-2抑菌能力在堿性條件下比菌株DQ1-3更穩(wěn)定。

圖6 pH值對芽孢桿菌發(fā)酵上清液抑制青霉菌活性的影響Fig. 6 Effect of pH on the antimicrobial activity of Bacillus culture supernatant against Penicillium

如圖7所示，低溫使抑菌率略有降低但并不顯著，兩菌株相比QQHE-2菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在低溫條件下抑菌能力更為穩(wěn)定。當溫度高于40 ℃后抑菌率大幅降低，當溫度為80 ℃時，抑菌率下降至20%以下，可見兩株芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性較差。其中DQ1-3菌株當溫度高于40 ℃后，抑菌效果顯著下降，溫度高于50 ℃后抑菌率低于20%，而QQHE-2菌株仍可保持40%左右的抑菌率，可見菌株DQ1-3產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在高溫條件下更不穩(wěn)定。

圖7 溫度對芽孢桿菌發(fā)酵上清液抑制青霉菌活性的影響Fig. 7 Effect of temperature on the antimicrobial activity of Bacillus culture supernatant against Penicillium

如表2所示，QQHE-2菌株經(jīng)胃蛋白酶和蛋白酶K處理后對青霉菌的抑菌率明顯下降，而胰蛋白酶處理對其抑菌效果影響較小。而菌株DQ1-3經(jīng)這3 種蛋白酶處理后抑菌活力都呈現(xiàn)明顯下降的趨勢。蛋白酶K相比胃蛋白酶和胰蛋白酶作用位點和切割范圍更為廣泛，結合pH值和溫度的實驗結果推測菌株QQHE-2和DQ1-3菌株產(chǎn)生的抑制青霉菌生長的有效物質(zhì)為蛋白質(zhì)或者肽類物質(zhì)。

表2 蛋白酶對芽孢桿菌發(fā)酵上清液抑制青霉菌活性的影響Table 2 Effect of protease on the antimicrobial activity of Bacillus culture supernatant against Penicillium

2.5 SDS-PAGE測定抑菌物質(zhì)提取物分子質(zhì)量

以飽和度為80%的硫酸銨提取QQHE-2抑菌物質(zhì)，提取物的抑菌率達75.04%，如圖8所示，證明抑菌物質(zhì)為蛋白類或肽類物質(zhì)。將提取物進行SDS-PAGE，由圖9可以看出，抑菌蛋白的分子質(zhì)量約為35 kDa。

圖8 提取物抑菌效果Fig. 8 Antimicrobial effect of the supernatant extract

圖9 抑菌提取液SDS-PAGE結果Fig. 9 SDS-PAGE of the supernatant extract

3 討 論

隨著生物抑菌劑研究的深入，芽孢桿菌屬作為抗菌劑的生產(chǎn)菌已得到廣泛認可，正成為生物控制病原真菌生長和霉菌毒素生產(chǎn)的有競爭力的候選者[15-16]。芽孢桿菌能夠產(chǎn)生不同的抑制真菌的代謝物，其中枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌是最知名的生物拮抗劑[17-18]，一些菌株已經(jīng)作為田間和飼料生產(chǎn)中的商業(yè)生物防治劑[19]。

目前研究表明枯草芽孢桿菌可以分泌多種高效多功能的抑菌物質(zhì)，多為環(huán)脂肽類的抗菌物質(zhì)，包括表面活性素、伊枯草素、芬枯草素[20-22]等，還有一部分為抗真菌蛋白類物質(zhì)，如幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶[23-24]等。但一些芽孢桿菌屬菌株的代謝產(chǎn)物具有細胞毒活性，尤其是蠟樣芽孢桿菌屬[25]。目前主要的益生芽孢桿菌來自于枯草芽孢桿菌屬[26-27]，但是有少量枯草芽孢桿菌屬的菌株含有致病基因，并且大多數(shù)安全性問題是由菌株的代謝毒性引起的[28]。因此在芽孢桿菌作為生物抑菌劑應用于實際生產(chǎn)時不僅要進行常規(guī)的體外和動物安全性評價，還需要特別對它代謝物相關的毒性因子進行安全性評價[29]。芽孢桿菌的安全性問題對其廣泛應用于食品醫(yī)藥行業(yè)產(chǎn)生了很大的限制[30]。雖然本實驗是從食品級自然發(fā)酵豆醬中分離出的芽孢桿菌，來源具有一定的安全性，但還需要進行更細致的安全性評價。

本實驗從自然發(fā)酵豆醬中篩選出兩株對青霉菌具有良好抑菌效果的枯草芽孢桿菌，并對抑菌物質(zhì)進行了初步的分析，判定抑菌有效成分為蛋白類物質(zhì)，其中QQHE-2分子質(zhì)量約為35 kDa，具有一定的研究價值。篩選出的QQHE-2和DQ1-3菌株在中性及堿性條件下較為穩(wěn)定，作用溫度低于50 ℃時抑菌效果顯著。菌株代謝產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)適用范圍較廣，可以廣泛應用于抑制由青霉菌引起的腐敗變質(zhì)。

4 結 論

本實驗從采自8 個地區(qū)的10 份自然發(fā)酵豆醬樣品中分離出40 株芽孢桿菌，篩選出兩株枯草芽孢桿菌QQHE-2和DQ1-3對青霉菌具有顯著的抑菌效果。本實驗判定篩選得到菌株的抑菌成分為蛋白類物質(zhì)，其中以QQHE-2抑菌效果更為顯著，抑菌率可達83.42%，經(jīng)SDS-PAGE測定其分子質(zhì)量約為35 kDa。菌株具有廣泛的應用前景，但對其作用機制還沒有深入的研究，而且抑菌物質(zhì)的提取純化比較復雜，達到工業(yè)化生產(chǎn)有很大的難度，還需要更深入的研究。