新疆冷水魚腸道肉桿菌遺傳差異及抑菌特性分析

魏小晶，趙志霞，羅寶龍，張瑞蕊，張 艷，倪永清,*，周 紅,*

（1.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832003；2.石河子大學生命科學學院，新疆 石河子 832003）

動物腸道是一個開放的生態系統，其中棲息著大量的微生物[1]。腸道微生物作為宿主消化系統的重要組成部分，在促進宿主的食物消化、維持微生態平衡及調節免疫等方面起著不可替代的作用[2-3]。研究發現，腸道微生物與宿主之間形成了復雜而又相對穩定的動態關系，確保宿主的健康和腸道微生物的平衡。此外，不同物種間或者同一物種不同群體之間，甚至是同一群體不同個體之間的腸道微生物結構都有差異[4-5]。Cummings等[6]發現單胃動物的腸道微生物與其生理代謝功能緊密相關。魚類作為一種獨特的脊椎單胃動物，屬于變溫動物，體溫隨水溫的變化而變化，其微生態系統的構成主要取決于食性和生存的水體環境[7]，也使得魚類腸道微生物明顯不同于陸生脊椎動物。

近年來，有關魚類消化道微生物的研究開始備受關注[8]，大部分集中于魚類食性、生存環境和腸道微生物的相關性研究。相對于人類和陸生高等脊椎動物，由于魚類屬于變溫動物，其生存的大部分水體環境溫度較低，為篩選到耐低溫的益生乳酸菌提供了良好的來源，尤其是產細菌素的耐低溫乳酸菌在食品的生物保鮮技術方面具有廣闊的市場前景。研究發現，部分乳酸菌除能代謝產生有機酸及過氧化氫等物質外，還能產生細菌素類活性物質[9]，能有效地抑制食品中病原菌及腐敗菌的生長繁殖[10-11]，這些具有抑菌特性的低溫乳酸菌在飼料行業及食品冷藏保鮮中極具應用潛力[12]。有研究報道，魚類腸道不僅能分離得到Lactobacillus和Enterococcus，同時還分離出多種Canobacterium菌株[13]。Sugita等[14]從魚腸道分離出Aeromonas caviae、A. hydrophila、Pseudomonas spp.及Clostridium spp.等細菌對部分氣單胞菌屬及人源病原菌顯示不同程度的抗菌效果。目前，國內外從水產品中分離篩選具有抑菌效果肉桿菌的研究也有報道，Ring等[15]從大西洋鮭魚、嘉魚等4 種魚腸道中篩選到7 株棲魚肉桿菌（C. piscicola）和3 株廣布肉桿菌（C. divergens），分析了它們對水產品致病菌的抗菌特性，研究表明這些肉桿菌能夠產生有效拮抗水產品中腐敗菌和致病菌的抗菌肽。然而，肉桿菌在帶給人們益處的同時也出現了一些亟待解決的問題，如有些肉桿菌產生了抗生素耐藥性或自身存在天然耐藥性，肉桿菌耐藥性與食品安全性相關問題逐步引起了人們的關注，益生肉桿菌的安全性評估已十分必要。

新疆額爾齊斯河是我國唯一注入北冰洋水系的外流河，常年水溫在20 ℃以下，其中多產冷水魚類，為研究冷水魚腸道低溫肉桿菌提供了可靠來源。本實驗從新疆冷水魚腸道中分離篩選低溫肉桿菌，對其遺傳結構差異進行分析，篩選明顯具有抑菌活性的肉桿菌，對該菌株發酵上清液中組分進行分析和該菌株對部分藥物的敏感性進行實驗，以期為低溫肉桿菌作為益生素在魚類飼料添加劑方面的應用提供科學依據，為食品的低溫貯藏保鮮及肉桿菌的安全性評估提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采自新疆額爾齊斯河流域的冷水魚包括河鱸（Perca fluviatilus）、紅尾魚（Rasbora borapetensis）、銀鯽（Carassius auratus gibelio）、鱖魚（Siniperca chuatsi）、黑斑狗魚（Esox reicherti）、叉尾斗魚（Macropodus opercuiaris）及高體雅羅魚（Leuciscus baicalensis）。每種魚按年齡、體質量標記后置于4 ℃冰箱保藏，12 h內運回實驗室。

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增引物 上海捷瑞生物有限公司；Marker 天根生化科技（北京）有限公司；PCR Master Mix、ddH2O生工生物工程（上海）股份有限公司；0.22 μm微孔濾膜上海興亞凈化材料廠；培養基（Elliker、MRS、LB）、抗生素 北京博奧拓達科技有限公司。

單核細胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes CGMCC 1.9136）、大腸桿菌（Escherichia coli EPEC O127:K63 CICC 10411）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus CICC 21600） 中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器與設備

5810R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；TC-512 PCR儀 德國Biometra公司；PowerPac Universal水平電泳儀、Gel DOC XR凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；UVmini-1240紫外分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離純化

將處理好的冷水魚腸道樣品依次按10 倍梯度稀釋，分別選取10-2、10-3、10-4和10-5梯度的菌懸液均勻涂布于MRS和Elliker培養基上，每個稀釋度涂布3 個平板，分別置于無氧和有氧的條件下，16 ℃培養3～5 d。發現菌懸液稀釋度為10-3時平板上菌落均勻明顯，且菌落數在30～300 CFU/皿之間。挑取平板表面單一菌落進行劃線分離，傳代劃線培養3～4 次直至純化，對每個菌株進行鏡檢，革蘭氏染色以及接觸酶實驗，從而達到對疑似乳酸菌的初步分離篩選，-20 ℃保存備用。

1.3.2 菌株生理生化鑒定

按照Dong Xiuzhu等[16]方法進行糖發酵實驗，實驗重復3 次并做空白對照。

1.3.3 最適生長溫度的測定

將篩選得到的菌株活化后按2%的接種量接種于MRS液體培養基中，分別設4、15、18、24、30、37 ℃ 6 個溫度梯度，培養箱中培養24 h，采用紫外分光光度計于420 nm波長處測定OD值。

1.3.4 16S rRNA基因PCR擴增及系統發育分析

DNA的提取根據Justé等[17]改良后的十六烷基三甲基溴化銨方法進行。采用16S rRNA通用引物27f（5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492r（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）進行PCR擴增，擴增條件為95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環。PCR產物在1.5 g/100 mL瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往上海美吉公司進行測序。測序結果被提交至GenBank數據庫中進行序列同源性比對（BLAST），采用CLUSTAL X1.83軟件排列對齊序列[18]并采用MEAG v.5.0[19]軟件建立系統發育樹。

1.3.5 多重聚合酶鏈式反應（repetitive polymerase chain reaction，rep-PCR）指紋圖譜分析

指紋圖譜采用兩種rep-PCR引物BOXAIR和（GTG）5（表1）。PCR擴增產物在2%瓊脂糖凝膠、1×TAE電泳緩沖液、80 V電壓下電泳3 h，置于凝膠成像儀下拍照，將得到的指紋圖譜使用Gel ComparII（Applied Maths, sint-Martens-Latem，Belgium）凝膠分析軟件依據UPGMA進行聚類分析。

表1 rep-PCR引物和PCR條件Table 1 Primer sequences and reaction conditions used in rep-PCR

1.3.6 菌株無細胞發酵上清液的制備及抑菌活性菌株的初篩

將分離到的菌株活化后，按2%的接種量接種于MRS液體培養基中，16 ℃振蕩培養48 h后，取2 mL發酵液離心（12 000×g，10 min，4 ℃）獲得上清液，并用0.22 μm微孔濾膜過濾得到無細胞發酵上清液，4 ℃保存備用。

采用牛津杯法[20]對乳酸菌進行抑菌活性的初篩。將指示菌株大腸桿菌、單核細胞性李斯特菌和金黃色葡萄球菌接種于LB液體培養基中，37 ℃培養18～24 h，取1 mL指示菌培養液于無菌生理鹽水中連續梯度稀釋，得到濃度約為106～107CFU/mL的稀釋液。取100 μL菌懸液均勻涂布于LB培養基表面，將牛津杯輕輕按壓于其上，再向杯中加入200 μL無細胞發酵上清液，以不加菌的MRS培養基為空白對照，4 ℃預擴散3 h后，37 ℃恒溫培養18 h，測定抑菌圈直徑，每個實驗做3 個平行，求平均值以確定抑菌能力。

1.3.7 對無細胞發酵上清液的處理

以單核細胞性李斯特菌作為指示菌，對乳酸菌無細胞發酵上清液進行以下處理：調節發酵上清液pH 6.5后加入過氧化氫酶（質量濃度為5 μg/mL），37 ℃水浴2 h；為明確無細胞發酵上清液中抑菌物質的蛋白質性質，向上清液中分別加入蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶（質量濃度為1 mg/mL），37 ℃水浴2 h。以未經任何處理的無細胞發酵上清液為空白對照進行抑菌實驗，結果平行測定3 次取平均值。

1.3.8 藥敏實驗

根據美國臨床實驗室標準化委員會標準CLSI（2012）[21]，采用藥敏紙片瓊脂擴散法（K-B法）對肉桿菌進行15 種抗生素藥敏實驗。吸取150 μL濃度為107～108CFU/mL的肉桿菌菌懸液，使用無菌棉簽將其均勻涂布于MRS瓊脂平板表面，待培養基表面干燥以后將藥片貼于其上，37 ℃倒置培養36 h，觀察抑菌結果，檢測抑菌圈直徑，每種抗生素藥片3 個平行。

1.4 數據處理

每個實驗重復3 次，采用SPSS 17.0軟件對糖發酵代謝情況進行系統聚類分析；采用Gel Compar II凝膠分析軟件進行指紋圖譜聚類分析，熱圖的繪制采用Heml 1.0軟件。

2 結果與分析

2.1 菌株分離與鑒定

從7 種冷水魚腸道樣品中共分離出48 株純培養物，通過肉眼觀察菌落大小、顏色，鏡檢菌落形態以及革蘭氏染色和接觸酶實驗確定疑似乳酸菌，進一步對其進行16S rRNA序列分析，最終確定有15 株為肉桿菌，其中麥芽香肉桿菌（C. maltaromaticum）4 株，廣布肉桿菌（C. d i v e r g e n s）1 0 株，未鑒定的肉桿菌屬（Carnobacteriumsp.） 1 株。

2.2 菌株生理生化鑒定

根據Dong Xiuzhu等[16]的方法對15 株肉桿菌進行糖發酵實驗，糖發酵代謝結果使用SPSS軟件進行系統聚類，根據糖發酵代謝情況（表2）可以將肉桿菌菌株聚為7 類，其中菌株E-BYC-2、E-BYC-1和E-BYC-4聚在一起，碳源代謝情況相似，且僅能利用4 種糖類作為碳源，碳源利用率較低；菌株M17-HWYC-3和E-HBGC-4聚為一類，可以利用6 種糖類作為碳源，BS-JYC-3和E-HLM-6也聚在一起，可以利用7 種糖類，碳源利用率較高，而菌株E-BYC-3獨自成一分支，可以利用所有的糖、醇為碳源，菌株對碳源的不同利用情況可能與魚的不同種類及生活習性有關。將15 株肉桿菌分別置于不同溫度梯度下培養，最終結果表明菌株的最適生長溫度為24～30 ℃，生長溫度范圍為4～37 ℃，屬于耐冷菌范疇[22]，故從冷水魚腸道分離到15 株肉桿菌屬于低溫乳酸菌。

表2 肉桿菌糖發酵代謝譜Table 2 Sugar metabolism spectra of 15 Carnobacterium strains

2.3 基于rep-PCR指紋圖譜分析

圖1 基于rep-PCR擴增的15 株肉桿菌的聚類圖Fig. 1 Dendrogram of 15 Carnobacterium strains according to their genetic profile obtained by rep-PCR

對15 株肉桿菌進行rep-PCR指紋圖譜分析，采用Gel Compar II軟件將兩種不同引物對應的指紋圖譜進行聚類，由BOX-PCR和（GTG）5-PCR指紋聚類圖（圖1）可以清晰看出，15 株肉桿菌的指紋圖譜帶型較豐富，能夠反映菌株在種水平上的遺傳差異。其中BOX-PCR指紋圖譜的條帶主要集中在400～5 000 bp范圍內，包括3～10 個明顯的亮帶，大多數產物的條帶數多于5 條，并有一些弱帶；（GTG）5-PCR指紋圖譜在350～5 000 bp范圍內并有1～12 個相對明顯的條帶。比較由2 種不同引物產生的指紋圖譜可知，大多數PCR產物條帶在350～5 000 bp之間。

由圖1可知，在45%的相似性水平上，所有的菌株被聚類成4 簇，Cluster I由4 株C. maltaromaticum組成，其中菌株M17-GYM-3、M17-GYM-2和EB2-4的帶型相似，而菌株M17-HWYC-4的帶型與它們相差較大，尤其是（GTG）5-PCR擴增的指紋圖譜條帶更為明顯。Cluster II和Cluster III都由C. divergens組成，在60%的相似性水平上均可被進一步劃分為2 個小組，且每一小組指紋圖譜帶型相近。Cluster IV僅由1 株肉桿菌屬Carnobacteriumspp.組成，菌株E-BYC-3與其他菌株的帶型相差最大，獨自成一組。帶型統計顯示，4 株C. maltaromaticum有2 種帶型，10 株C. divergens有4 種帶型，Carnobacteriumspp.僅有1 種帶型。本實驗中15 株肉桿菌遺傳多樣性豐富，這些肉桿菌種間具有明顯的差異，種內帶型多樣，存在極高的遺傳多態性。

2.4 抑菌活性菌株的篩選

采用牛津杯法對15 株肉桿菌進行抑菌活性的初篩，其中8 株肉桿菌對大腸桿菌、單核細胞性李斯特菌和金黃色葡萄球菌均有較好的抑制作用（表3）。

表3 具有抑菌活性肉桿菌的初篩結果Table 3 Primary screening of Carnobacterium for antibacterial activity

2.5 肉桿菌無細胞發酵上清液的抑菌物質分析

表4 肉桿菌菌株的無細胞發酵上清液不同處理后對單核細胞性李斯特菌抑菌活性的影響Table 4 Effect of exclusion of organic acids and hydrogen peroxide on the antibacterial activity of cell-free fermentation supernatants ofCarnobacterium strains against L. monocytogenes

乳酸菌在發酵過程中會產生大量的有機酸、過氧化氫、抗菌肽和細菌素等抑菌物質，為明確肉桿菌發酵上清液中的抑菌物質組成，以單核細胞性李斯特菌為指示菌，初篩得到8 株肉桿菌對其均有較好的抑制作用。經酸排除后，如表4所示，菌株M17-GYM-3的抑菌能力明顯下降，而其余菌株的發酵上清液均具有明顯的抑菌能力，表明有機酸可能對菌株M17-GYM-3抑菌能力的影響較大；肉桿菌發酵上清液經排除酸和過氧化氫后，仍具有明顯的抑菌能力，表明過氧化氫對菌株發酵上清液中抑菌活性的影響較小，其中菌株M17-HWYC-4和E-HBGC-4對單核細胞性李斯特菌的抑菌效果最為明顯。

對8 株肉桿菌發酵上清液進行蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶處理。如表5所示，除菌株BS-JYC-3經胰蛋白酶處理抑菌活性未喪失外，其余菌株通過3 種酶的酶解實驗后抑菌能力完全喪失，即肉桿菌發酵上清液中的抑菌物質對蛋白酶敏感，具有蛋白質的性質[23]，抑菌物質組分中可能存在類細菌素。

表5 3 種蛋白酶處理肉桿菌菌株發酵上清液后對單核細胞性李斯特菌抑菌活性的影響Table 5 Effect of digestion with three proteases on the antibacterial activity of cell-free fermentation supernatants of Carnobacterium strains against L. monocytogenes

2.6 抑菌活性肉桿菌菌株系統發育分析

圖2 基于16S rRNA序列肉桿菌的系統發育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of Carnobacterium based on 16S rRNA gene sequence

將8 株具有抑菌活性肉桿菌的16S rRNA部分基因序列與GenBank數據庫中已知的16S rRNA基因序列進行同源性比對，選取序列相似性高的菌株構建系統發育樹見圖2，該8 株乳酸菌菌株均屬于肉桿菌屬。其中菌株E-HLM-6、E-BYC-2、BS-JYC-3和E-BYC-1與C. divergens的序列相似性達99%，M-TZM-3、M17-HWYC-3、E-HBGC-4在同一分枝，與C. divergens親緣關系較近，菌株M17-GYM-3與已知種C. maltaromaticum的序列相似性達99%以上。

2.7 抗生素耐藥性分析

如圖3所示，8 個菌株對氨芐西林、米諾環素和氯霉素表現敏感，對慶大霉素、四環素、利福平、替考拉寧表現中度敏感，而所有的菌株對阿米卡星、氨曲南、苯唑西林、萬古霉素和左氧氟沙星等幾種抗生素表現耐藥。

圖4 可以直觀反映8 株肉桿菌產生的抗生素抑菌圈直徑大小，宏觀反映乳酸菌的抗生素耐藥情況。顏色從藍色向綠色、黃色和紅色的漸變過程代表了抗生素抑菌圈直徑從小到大的遞增過程。從熱圖整體分析，藍色區域主要集中在苯唑西林、阿米卡星、萬古霉素、替考拉寧、左氧氟沙星和氨曲南6 種抗生素中，表明這些抗生素對幾乎所有的菌株無抑菌圈產生，即表現耐藥；而圖中多數顏色主要集中分布在綠色到紅色的漸變過程中，表明大部分菌株的抑菌圈直徑呈依次增大的趨勢，即抗生素耐藥情況呈中度敏感或敏感。從熱圖橫向分析，其中菌株M-TZM-3中紅色區域出現最多，表明有多種抗生素產生的抑菌圈直徑最大；菌株E-BYC-2和E-BYC-1的顏色區域分布相似，即它們的耐藥表型相近。從縱向分析，同種類型的抗生素耐藥性也可能不同，如青霉素類中苯唑西林所占的藍色區域遠多于青霉素和氨芐西林，即苯唑西林耐藥性遠大于青霉素和氨芐西林。

3 討 論

研究發現大部分乳酸菌代謝產生有機酸、過氧化氫及細菌素等抑菌物質，能有效抑制食品中腐敗菌及致病菌的生長，在開發低溫微生物源生物保鮮劑方面極具應用潛力[24]。分子生物學方法被越來越多地應用于乳酸菌的分離與鑒定，本實驗結合乳酸菌的傳統分離鑒定方法，最終確定有15 株乳酸菌為肉桿菌。根據Morita[22]對耐冷菌的定義，15 株肉桿菌的最適生長溫度為24～30 ℃，屬于耐冷菌的范疇。本實驗分離到的15 株肉桿菌，其中C. maltaromaticum 4 株，C. divergens 10 株，Carnobacterium spp. 1 株。rep-PCR指紋技術是一種快速、易于操作和可重復性的工具，具備高的分辨能力，可用于區分在種、亞種及菌株水平上的多種與食品相關的乳酸菌[25]。Gevers[25]和?vec[26]等采用該指紋圖譜技術研究了乳酸菌的遺傳分化，（GTG）5-PCR被發現是最適合乳酸菌高分辨率的鑒定方法，為更準確地反映15 株肉桿菌菌株間的遺傳多樣性，本研究采用BOXAIR和（GTG）5兩種不同引物的rep-PCR指紋圖譜技術對篩選到的肉桿菌進行遺傳差異性分析，發現15 株低溫肉桿菌種間具有明顯的差異，種內帶型多樣，存在極高的遺傳多態性，與Bello等[27]的研究結果一致。

Martin-Visscher等[28]研究表明C. maltaromaticum UAL307發酵液的有效成分為IIa類細菌素，陳琳等[29]從植物乳桿菌KLDS1.0391的發酵液中截留出了細菌素，Tulini等[30]從魚中篩選出的C. maltaromaticum C2所產抗菌肽等物質能有效抑制腐敗菌和致病菌的生長。本實驗對從新疆冷水魚腸道中分離得到的每株肉桿菌進行抑菌活性檢測，初篩得到8 株肉桿菌對病原菌有明顯的抑菌活性，從系統發育來看，7 株屬于C. divergens、1 株屬于C. maltaromaticum。以單核細胞性李斯特菌為指示菌，通過酸排除、過氧化氫酶實驗及蛋白酶消化實驗最終確定肉桿菌的抑菌物質成分中可能存在類細菌素。因此，對新疆冷水魚腸道中低溫肉桿菌產細菌素的進一步深入研究是非常關鍵的。

盡管致病性乳酸菌并不多見，但耐藥性問題是乳酸菌在應用安全方面的首要問題[31]，菌株對抗生素的敏感性也是最主要的安全特性[32]。Liu Chang等[33]對46 株乳桿菌研究耐藥性發現這些菌株對氯霉素、紅霉素、四環素敏感，對萬古霉素、鏈霉素、慶大霉素耐藥。Temmerman等[34]對187 株乳酸菌檢測耐藥性，發現有30 株嗜熱鏈球菌對四環素、紅霉素、青霉素和氯霉素敏感，對卡那霉素、萬古霉素耐藥。本研究采用紙片擴散法對8 株具有抑菌活性的肉桿菌進行15 種抗生素敏感性測定，結果表明，所有菌株對氨芐西林、米諾環素和氯霉素表現敏感，而對阿米卡星、氨曲南、苯唑西林、萬古霉素和左氧氟沙星等幾種抗生素表現耐藥，這可能與魚類的生活習性、食物鏈及魚類生活的水體環境被污染等原因有關，也可能是部分菌株本身存在天然耐藥性[35]。后續將會對更多低溫肉桿菌的產細菌素特性及耐藥基因進行更深入研究，以期為低溫肉桿菌作為益生素在魚類飼料添加劑方面的應用提供科學依據，為食品防腐保鮮技術及肉桿菌的安全性評估提供一定的參考依據。