熱脅迫和培養溫度對大腸桿菌抗熱性的影響

張愛靜，李琳瓊，朱 蕾，王鵬杰，高瑀瓏*

（南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

大腸桿菌（Escherichia coli）是一種在自然界和動物腸道內廣泛存在，極易造成食品污染的革蘭氏陰性菌[1-3]。其在自然界中常常要面臨一系列的高溫、低溫、酸、堿、滲透壓等不適環境的脅迫，由于被不適條件脅迫，誘發大腸桿菌啟動自我保護機制，多數微生物通過對不斷變化的外界環境的適應進行生長繁殖。事實上，在食品生產加工過程中食品原料中的許多微生物經常處在脅迫環境中，面對不適宜其生長繁殖的環境條件，其生理代謝會作出應激反應，這種對不良環境的適應能夠使其生存[4-7]。當微生物經歷一些不適的脅迫環境，之后再遇到同樣類型的不適環境時，其存活能力明顯提高，這種作用稱為同源性保護作用；而微生物經一些不適環境脅迫，隨后在遇到不同類型的不適環境時，其存活能力明顯提高，這種作用稱之為交叉保護作用[8]。

高溫殺菌是目前食品工業中最常使用的一種滅菌加工手段[9]。微生物的耐熱性不僅受遺傳因素的影響，還受環境因素的影響[10]。微生物會對不利環境因素產生抗性或適應性反應，近年來引起了研究者的廣泛關注[11-13]。有研究報道，將乳酸桿菌脅迫于亞致死溫度50 ℃條件下30 min，隨后置于65 ℃，存活量較無脅迫原菌株增加10～100 倍[14]。Mackey等[15]研究發現，鼠傷寒沙門氏菌和李斯特菌在亞致死溫度48 ℃條件下脅迫處理一定時間后，其耐熱性比原菌株明顯提高。Juneja等[16]將產氣莢膜梭菌置于亞致死75 ℃熱脅迫后發現，與未經處理的菌株相比，100 ℃條件下殺死某細菌數量90%所需要的時間明顯增加，說明經過亞致死熱脅迫后的菌體對熱致死環境產生了抗熱性。研究認為，微生物面對環境溫度的突然變化，其生理也會發生變化。如當溫度突然上升，金黃色葡萄球菌會迅速作出熱激應答，如誘導相關基因的表達，合成熱休克蛋白[17-18]。對于大腸桿菌經不同熱脅迫和培養溫度處理，是否可誘導其對熱抗性的變化，即是否產生同源保護作用目前尚不清楚，國內外鮮見相關報道。因此，對大腸桿菌ATCC 43889經不同熱脅迫和培養溫度誘導后的抗熱性進行研究，探明微生物的耐熱性是優化食品熱加工殺菌條件的關鍵因素，以期為高溫殺菌技術在食品工業中的應用奠定理論基礎，對于保障食品加工貯藏安全、建立食品質量安全控制體系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889，購自于江蘇省疾病預防控制中心，采用胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）培養[19]。供試菌經活化后，接入TSB液體培養基，36 ℃、140 r/min搖床振蕩培養18 h。

TSB、胰蛋白胨大豆瓊脂（trypticase soy agar，TSA）培養基、NaCl 南京丁貝生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；HZQ-F160全溫振蕩培養箱 太倉市實驗設備廠；GNP-9160隔水式恒溫培養箱、SF-CF-2A超凈工作臺 上海三發科學儀器有限公司；601超級恒溫水浴鍋 金壇市醫療儀器廠；精密電子天平 北京塞多斯天平有限公司；上海三發科學儀器有限公司；A1正置熒光顯微鏡 德國蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 熱脅迫處理大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889

將1.1節活化后的大腸桿菌ATCC 43889以體積分數1%轉接至150 mL新鮮的TSB培養基中，36 ℃搖床振蕩培養18 h至穩定期，分別取10 mL培養液加入無菌的中號試管（20 mm×200 mm），置于50、60 ℃和70 ℃進行熱脅迫處理，各處理15 min，取體積分數為1.5%～2%的各個溫度熱脅迫后的ATCC 43889菌種分別接種于新鮮的100 mL TSB培養基中，36 ℃振蕩培養18 h至穩定期后，再分別取10 mL培養液加入無菌的中號試管，置于50、60 ℃和70 ℃進行熱脅迫處理，各處理15 min；以此類推，重復上述搖床振蕩培養和熱脅迫處理10 次，以備后續80 ℃熱處理。ATCC 43889的穩定期是通過平板菌落計數方法結合比濁法測得的生長曲線獲得[20]。

1.3.2 大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889抗熱性參數D值的測定

微生物耐熱參數D值表示在一定的熱力致死溫度條件下殺死某細菌數量的90%所需要的時間。D值越大，表明細菌的耐熱性越強，該菌的死亡速率越慢；D值大小和抗熱性的強度呈正比[21]。

1.3.1 節對大腸桿菌ATCC 43889采用50、60 ℃和70 ℃三種熱脅迫溫度經15 min各處理10 次，每種溫度每次熱處理時分別測定在3、6、9、12、15 min ATCC 43889存活量（3 個平行），共5 個時間點，以熱處理時間為橫坐標，存活量為縱坐標，對此5 個時間點進行線性回歸分析，所得線性回歸方程斜率的負倒數即為D值，分別測得ATCC 43889在50、60 ℃和70 ℃的D值，用線性回歸方程的決定系數R2評價此D值擬合度優劣。不同溫度下D值的計算如式（1）所示：

式中：N0、Nt分別為熱處理前0時刻初始菌體的數量和熱處理t時刻之后菌體的數量。

1.3.3 不同溫度下培養大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889取1.1節活化的大腸桿菌ATCC 438895按體積分數1%接種至新鮮的TSB中，置于10、28、36 ℃和45 ℃，搖床振蕩培養，分別培養120、24、18 h和20 h，達到穩定期，以備后續80 ℃熱致死處理。不同培養溫度下ATCC 43889的穩定期通過平板菌落計數方法結合比濁法測得的生長曲線獲得[20]。

1.3.4 大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889抗熱性模型的建立Weibull分布模型最初用于工程金屬零件的壽命和材料的疲勞測試，目前已被應用于微生物的非線性致死動力學模型的擬合[22-23]。該模型能較好地模擬外界條件對細菌失活的影響，適用于熱力和非熱力細菌失活模型的擬合，Weibull模型按照式（2）表示：

式中：N0為0時刻初始菌體數量；Nt為熱處理t時刻后存活的菌體數量；t為熱處理時間/min；δ和ρ分別為Weibull模型的規模參數和形態參數，其中，δ表示菌體數量第1次減少10 倍所用的時間/min；ρ表示熱致死曲線的形狀，當ρ=1時，曲線為直線；當ρ＞1時，曲線向下彎曲，為凸形曲線；當ρ＜1時，曲線向上彎曲，為凹形曲線[24-25]。

將1.1節活化的大腸桿菌ATCC 43889與1.3.1節經50、60 ℃和70 ℃反復熱脅迫處理10 次傳代培養獲得的抗熱性的4 種ATCC 43889菌株，接種于新鮮的TSB中，36 ℃、140 r/min搖床振蕩培養至穩定期。按1.3.3節在10、28、36 ℃和45 ℃條件下140 r/min搖床振蕩培養ATCC 43889菌株至穩定期。分別將這8 種培養至穩定期的大腸桿菌ATCC 43889的培養液10 mL加入無菌的中號試管，置于80 ℃進行熱處理，每隔2 min取樣，以滅菌生理鹽水適度稀釋，取適量菌懸液在TSA平板上涂布36 ℃培養72 h后，對培養液80 ℃處理前后進行平板菌落計數[20]。80 ℃ATCC 43889的存活量表達式為lg（Nt/N0），N0、Nt分別表示熱處理前初始菌體的數量和熱處理t時刻之后菌體的數量。以熱處理時間為橫坐標，ATCC 43889存活量為縱坐標，利用Weibull模型對80 ℃ ATCC 43889致死曲線進行非線性擬合，以此對比評價不同條件下的大腸桿菌ATCC 43889菌株對80 ℃抗熱性的強弱。

1.3.5 大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889熱脅迫前后菌落形態和個體形態的觀察

對未經熱脅迫和1.3.1節經過50、60 ℃和70 ℃熱脅迫處理10 次后獲得的ATCC 43889菌株在TSA平板上培養72 h后，用肉眼直接觀察ATCC 43889的菌落形態；用結晶紫與碘液單染色，通過光學顯微鏡分別觀察ATCC 43889個體形態。

1.4 數據統計分析

本研究數據通過JMP（10.0）軟件處理，采用Duncan新復極差法進行多重比較，結果以表示，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同熱脅迫處理對大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889 D值的影響

表1 大腸桿菌ATCC 43889經不同熱脅迫處理后D值的變化Table 1 Changes in D values of E. coli ATCC 43889 after heat stress treatment at different temperatures

從表1可知，所有處理組D值的擬合度均較高（R2＞0.93）；在50、60 ℃和70 ℃熱脅迫溫度作用下，隨著熱脅迫處理次數的增加，D值逐漸增大，表明ATCC 43889經過反復熱脅迫后，對熱的抗性增加。在50 ℃脅迫條件下，ATCC 43889第1次熱處理后的D值為3.70 min，到第10次熱處理后，D值增加到6.96 min（P＜0.05），是第1次熱脅迫處理后的1.88 倍；在60 ℃脅迫條件下，ATCC 43889第1次熱處理后D值為3.92 min，到第10次熱脅迫后，D值增加到9.33 min（P＜0.05），是第1次熱脅迫時D值的2.38 倍；在70 ℃脅迫條件下，ATCC 43889第1次熱脅迫后D值為3.35 min，到第10次熱脅迫后，D值增加到27.40 min（P＜0.05），是第1次熱脅迫處理后的8.18 倍。熱脅迫溫度越高，D值越大，說明ATCC 43889抗熱性越強。ATCC 43889經熱70 ℃反復脅迫作用后抗熱性增加的最快，顯著大于50 ℃和60 ℃脅迫后產生的抗熱性（P＜0.05），熱脅迫溫度為60 ℃時，ATCC 43889的抗熱性略高于50 ℃的抗熱性。

2.2 不同熱脅迫處理對大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889在80 ℃致死的影響

經50、60 ℃和70 ℃熱脅迫處理10 次傳代培養獲得的大腸桿菌ATCC 43889的3 種耐熱性菌株與未經熱脅迫的對照組，在80 ℃的熱致死曲線見圖1。利用Weibull模型對ATCC 43889三種耐熱性菌株與未經脅迫對照組在80 ℃致死實驗數據進行回歸擬合，以抗性參數δ評價ATCC 43889的抗熱性，通過JMP軟件內部自動運行計算得出的抗熱性參數δ和ρ見表2。

圖1 不同熱脅迫處理大腸桿菌ATCC 43889在80 ℃的致死曲線Fig. 1 Death curve at 80 ℃ of E. coli ATCC 43889 undergoing different heat stresses

表2 不同熱脅迫大腸桿菌ATCC 43889在80 ℃的熱致死模型的擬合度及參數Table 2 Goodness of fit and parameters of thermal death models at 80 ℃ of E. coli ATCC 43889 subjected to different heat stresses

抗性大小與δ呈正比，δ值越大表示其抗熱性越強。由圖1可知，采用Weibull模型能較好地擬合ATCC 43889在50、60 ℃和70 ℃的熱脅迫后獲得的抗熱菌株在80 ℃作用下的失活曲線，擬合程度較高（R2＞0.953 8）。從表2也可看出，隨著脅迫溫度的升高，ATCC 43889抗熱性呈上升趨勢，無熱脅迫處理對照組、50、60 ℃和70 ℃，其抗熱性參數δ分別為0.64、0.80、1.13 min和1.92 min，其抗熱性存在顯著性差異（P＜0.05），表明隨著脅迫溫度的升高，其抗熱性顯著增加。熱脅迫溫度70 ℃時，抗熱性參數δ是原菌株的3 倍。經過熱適應的ATCC 43889比原菌株更加耐熱，80 ℃處理16 min后，未經脅迫的對照組ATCC 43889數量下降了7.72 個對數，接近于全部死亡，而經70 ℃熱脅迫的ATCC 43889，80 ℃處理16 min后，數量僅下降了3.36 個對數，ATCC 43889存活量明顯提高。ρ參數代表熱致死曲線的形狀，本研究ρ＜1，對于ATCC 43889，Weibull曲線向上彎曲，為凹形曲線，表明模型曲線隨著時間的延長下降趨勢減緩，ATCC 43889失活率降低。此研究結果表明，提高ATCC 43889的熱脅迫溫度可誘導其對抗熱性的增加。

2.3 不同溫度培養大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889在80 ℃的抗熱性

經10、28、36 ℃和45 ℃培養后ATCC 43889在80 ℃其熱致死曲線見圖2。利用Weibull模型對不同的生長溫度下培養的ATCC 43889在80 ℃致死實驗數據進行回歸擬合，用JMP軟件進行計算，獲得的抗性參數δ和ρ見表3。

圖2 不同溫度培養大腸桿菌ATCC 43889在80 ℃熱處理的致死曲線Fig. 2 Death curves at 80 ℃ of E. coli ATCC 43889 grown at different temperatures

表3 不同溫度培養大腸桿菌ATCC 43889在80 ℃熱處理抗熱性模型的擬合度和參數Table 3 Goodness of fit and parameters of heat resistance models at 80 ℃ of E. coli ATCC 43889 grown at different temperatures

由圖2可知，采用Weibull模型也能較好地擬合ATCC 43889經4 種不同溫度培養后在80 ℃的失活曲線，擬合程度較高（R2＞0.993 6）。由表3可知，ATCC 43889培養溫度為10、28、36 ℃和45 ℃，其在80 ℃的抗熱性參數δ分別為2.16、2.24、3.29 min和5.69 min，隨著培養溫度的升高，其抗熱性顯著增大（P＜0.05）。與最適生長溫度36 ℃相比，生長溫度為45 ℃時，ATCC 43889抗熱性顯著增大（P＜0.05）；而生長溫度為10 ℃時，其對80 ℃較為敏感，抗熱性顯著降低（P＜0.05），生長溫度為45 ℃時抗熱性參數δ是10 ℃的2.63 倍。由表3可以看出，生長溫度為10 ℃和45 ℃時熱致死曲線的參數ρ＞1，曲線向下彎曲，為凸形曲線，表明抗性模型曲線隨著時間的延長下降趨勢變快，ATCC 43889隨著時間的延長死亡加快，失活率在增大；而生長溫度為28 ℃和36 ℃時熱致死曲線的參數ρ＜1，曲線向上彎曲，為凹形曲線，表明抗性模型曲線隨著時間的延長下降趨勢變慢，ATCC 43889隨著時間的延長，失活率在減小。上述研究結果表明，培養溫度升高也可脅迫誘導ATCC 43889抗熱性的增加。

2.4 熱脅迫前后大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889菌落形態和個體形態

圖3 大腸桿菌ATCC 43889菌落形態Fig. 3 Colonial morphology of E. coli ATCC 43889

由圖3可以看出，未經熱脅迫處理的對照組ATCC 43889培養72 h后，在TSA上菌落呈乳白色，邊緣整齊，表面有光澤，濕潤，光滑，正面和反面色澤一致；經過50 ℃熱脅迫后的ATCC 43889，菌落形態與對照組無明顯差異；經過60 ℃和70 ℃熱脅迫后，菌落發生明顯的變化，其表面呈褶皺狀、干燥，邊緣不整齊，呈鋸齒狀。

圖4 大腸桿菌ATCC 43889個體形態Fig. 4 Cellular morphology of E. coli ATCC 43889

由圖4可以看出，未經熱脅迫處理的對照組ATCC 43889培養72 h后，在顯微鏡下個體呈短桿狀或球狀；經過50 ℃熱脅迫后，個體形態略有變化，有極少數個體變長；而經過60 ℃和70 ℃熱脅迫后，個體形態發生變化，幾乎均變為長桿狀，脅迫溫度越高，變化越明顯。

3 討 論

細菌的抗熱性受菌株種類、細胞狀態和環境因素的影響，熱脅迫一直是微生物學研究的熱點。每種細菌均有其最適生長溫度，當溫度太高時會引起蛋白質、酶失活，細胞膜破壞，核糖體、DNA、RNA等生物大分子降解[26]。

在食品生產加工過程中，微生物常常要遭受各種不適環境條件的脅迫，誘導出一系列自我保護機制，導致其對致死因素抗性增加。溫度是引起細菌細胞組成和生理變化的一個重要因素[27-29]。Heredia等[30]研究發現，產氣莢膜梭菌在55 ℃脅迫30 min，細胞的耐熱性增加了2～3 倍。本研究發現，大腸桿菌ATCC 43889經熱脅迫與升高培養溫度，其抗熱性均增加，經50、60 ℃和70 ℃反復熱脅迫處理后，D值不斷增大，且脅迫溫度越高，D值越大，抗熱性越強；ATCC 43889在不同的培養溫度下，超過最適溫度能誘導其抗熱性升高，而低于最適溫度的培養，其抗熱性降低。ATCC 43889經過50 ℃熱脅迫后，菌落形態與對照組無明顯差別；經過60 ℃和70 ℃熱脅迫后，其菌落邊緣變得不整齊，表面粗糙且干燥，個體形態變長，呈長桿狀，熱脅迫溫度越高，這種變化越明顯，這種形態的變化可能有助于其避免高溫環境產生熱損傷。王麗平等[31]研究發現，某些抗生素作用大腸桿菌后能使其喪失原有的形態，變成細長的桿狀，這種形態的變化有助于其抵抗外界不利環境。本研究發現，ATCC 43889經熱脅迫后，可使其細胞形態也變成長桿狀。高溫使ATCC 43889形態變成長桿狀與其抗熱性的增強可能有一定的關系，對于高溫脅迫導致其抗熱性升高的作用機制正在研究。本研究發現熱脅迫對大腸桿菌ATCC 43889產生的同源性保護作用，熱脅迫是否能引起交叉保護作用的相關工作也正在研究。

4 結 論

大腸桿菌ATCC 43889經50、60 ℃和70 ℃反復多次熱脅迫處理后，D值顯著增加，熱脅迫溫度越高，D值越大，說明其抗熱性越強。經過熱脅迫后的ATCC 43889，菌落形態和個體形態發生了變化，熱脅迫溫度越高，形態變化越明顯。經50、60 ℃和70 ℃熱脅迫處理10 次傳代培養的ATCC 43889在80 ℃的熱致死曲線表明，脅迫溫度越高，其耐熱性越強。在10～45 ℃培養，采用Weibull模型能較好地擬合ATCC 43889在80 ℃作用下的抗熱性曲線，隨著培養溫度的升高，ATCC 43889的抗熱性顯著增加。綜上，一定熱脅迫溫度和培養溫度的升高均有助于保護大腸桿菌ATCC 43889對熱處理的失活作用。