土壤環(huán)境對(duì)傳統(tǒng)豆醬制醬過程中細(xì)菌群落演替的影響

安飛宇，武俊瑞，劉一鳴，孫雪婷，祝新媛，魏麗麗，烏日娜,*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)外語教學(xué)部，遼寧 沈陽 110866）

我國醬的起源非常早，最早甚至可以追溯到商周時(shí)期，而關(guān)于豆醬的起源，最初的記載始見于西漢[1]。傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬是以大豆為主要原料，經(jīng)自然發(fā)酵而成的半流動(dòng)狀態(tài)的發(fā)酵食品[2]。自然發(fā)酵豆醬作為日常的調(diào)味品，因其獨(dú)特的風(fēng)味，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。豆醬不僅具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，還具有抗氧化性、抑制血清膽固醇上升、抗癌、抗誘變性、降血壓等保健功能[3-5]，因此近年來自然發(fā)酵豆醬引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。

目前，工業(yè)上大多通過添加菌種來制作豆醬。但是菌種的單一性使得工業(yè)豆醬的風(fēng)味及適口性遠(yuǎn)不如自然發(fā)酵豆醬[6]。傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬所具有的獨(dú)特色、香、味、體是在復(fù)雜的微生物的共同作用下，通過許多的生化反應(yīng)形成的，其中有蛋白質(zhì)的水解、乙醇的發(fā)酵、淀粉的糖化、有機(jī)酸的形成、脂肪的水解等[7]。民間素來就有“百家醬來百家味”的說法，這說明傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬的風(fēng)味多變。其原因是由于豆醬的生產(chǎn)原料、生產(chǎn)工藝及環(huán)境等因素不同，造成了自然發(fā)酵豆醬的菌群結(jié)構(gòu)具有多樣性，從而導(dǎo)致其風(fēng)味的不同。

傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬的制作主要分為兩個(gè)階段，醬醅階段和制醬階段[8]。與醬醅階段不同，在制醬階段的發(fā)酵過程處于室外開放式環(huán)境中。由于傳統(tǒng)農(nóng)家自然發(fā)酵豆醬的醬缸都要放置在陽光充足、能保證其發(fā)酵溫度的田地上，因此推斷醬缸周圍的土壤環(huán)境可能會(huì)對(duì)發(fā)酵豆醬的菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響。近年來，雖然國內(nèi)外對(duì)自然發(fā)酵豆醬的群落組成做了大量的研究工作[2,9-11]，但鮮見關(guān)于土壤環(huán)境對(duì)自然發(fā)酵豆醬微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響。目前，有關(guān)于土壤環(huán)境對(duì)發(fā)酵食品菌群結(jié)構(gòu)影響的報(bào)道大多都集中于白酒窖泥及酒廠土壤的研究，已有報(bào)道稱土壤環(huán)境會(huì)對(duì)白酒發(fā)酵過程中的微生物的數(shù)量和優(yōu)勢(shì)菌群產(chǎn)生影響，從而影響酒質(zhì)的優(yōu)劣[12-13]。因此，探究土壤環(huán)境對(duì)自然發(fā)酵豆醬細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)影響具有重要意義。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來越多的科研人員利用該技術(shù)對(duì)復(fù)雜環(huán)境微生物進(jìn)行分析。孫衛(wèi)寧等[14]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同季節(jié)釀造的濃香型白酒的細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究。沈馨等[15]利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序系統(tǒng)對(duì)辣椒醬中核心菌群的群落特征進(jìn)行了研究，為辣椒醬中細(xì)菌的研究提供了更準(zhǔn)確、更科學(xué)的數(shù)據(jù)資源。本實(shí)驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了在發(fā)酵過程中傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的變化，及其周圍土壤環(huán)境和醬醅的細(xì)菌群落組成。揭示土壤環(huán)境對(duì)自然發(fā)酵豆醬細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)影響，為提高豆醬風(fēng)味及品質(zhì)研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品：采集自兩家東北地區(qū)農(nóng)家（遼寧四平S家、遼中L家）采用東北傳統(tǒng)方法制作的成熟期醬醅（編號(hào)為SK、LK），發(fā)酵醬缸周圍土壤樣品（編號(hào)為ST、LT），以及各不同發(fā)酵階段的豆醬樣品各6 份，分別在發(fā)酵0、7、14、21、28、35 d（成熟）進(jìn)行取樣（分別編號(hào)為S1～S6、L1～L6），樣品采集方式為3 個(gè)不同位點(diǎn)混合采樣。樣品采集后，放置于冰盒中，并迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱低溫凍藏。

E.Z.N.A.? Soil試劑盒 美國Omega公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物 上海美吉公司；AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒 美國Axygen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI GeneAmp? 9700型PCR儀 美國ABI公司；QuantiFluorTM-ST 美國Promega公司；Illumina MiSeq PE300測(cè)序平臺(tái) 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA的提取

根據(jù)Sun等[11]的方法提取各樣品的總DNA，利用NanoDrop 2000對(duì)DNA濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性。將濃度和純度均合格的DNA在-20 ℃條件下保存，用于PCR擴(kuò)增。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：在95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.3.3 Illumina MiSeq測(cè)序及數(shù)據(jù)處理

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用凝膠提取試劑盒進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。利用QuantiFluor?-ST進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2*300文庫[16]。最后利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序[17]。運(yùn)用MiSeq工具中的MiSeq Control Software（MCS）進(jìn)行堿基識(shí)別和圖像分析，數(shù)據(jù)下機(jī)后在Illumina basespace云端計(jì)算平臺(tái)進(jìn)行初始分類分析。基于分類學(xué)信息，在各分類學(xué)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)等深入的統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋曲線

稀釋曲線主要利用各樣本的測(cè)序量在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，可用來說明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理。如圖1所示，當(dāng)測(cè)序深度＜10 000時(shí)，多樣性指數(shù)隨著測(cè)序深度的增加而迅速增加；當(dāng)測(cè)序深度在10 000～30 000之間時(shí)，多樣性指數(shù)隨著測(cè)序深度的增加而緩慢增加；測(cè)序深度＞30 000時(shí)，稀釋度曲線趨于平臺(tái)期，表明測(cè)序準(zhǔn)確有效，可以充分反映樣品的多樣性。

圖1 樣品稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves for samples

2.2 樣品復(fù)雜度分析

樣品的復(fù)雜度即α多樣性反映微生物的多樣性和群落的物種豐富度，包括OTUs數(shù)、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)等結(jié)果[8]。ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)都是用來計(jì)算菌群豐度，ACE指數(shù)或Chao1指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高。如表1、2所示，與醬醅和豆醬樣品相比，土壤樣品的物種最為豐富，菌群結(jié)構(gòu)明顯復(fù)雜。兩家醬醅的群落豐富度比較相似，進(jìn)入液態(tài)醬階段后，物種豐度都有所上升，隨著發(fā)酵的進(jìn)行有所下降，隨后豐度上下波動(dòng)。特別是，兩家豆醬的細(xì)菌豐度指數(shù)都在第4個(gè)發(fā)酵階段（S4、L4）出現(xiàn)峰值，說明該階段可能為傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬發(fā)酵最為活躍的時(shí)期。

通過Shannon指數(shù)對(duì)樣品多樣性的比較，發(fā)現(xiàn)兩家醬醅中菌群的多樣性指數(shù)均低于下醬當(dāng)天的樣品，可能的原因?yàn)椋涸谙箩u的過程中，醬缸周圍土壤環(huán)境中的微生物擴(kuò)散進(jìn)入醬缸，從而影響了豆醬發(fā)酵初期的細(xì)菌多樣性。同時(shí)，與下醬當(dāng)天的樣品相比，各發(fā)酵階段豆醬的菌群多樣性整體呈下降趨勢(shì)。此前，雖有學(xué)者研究表明窖泥和糟醅具有較高相似度的細(xì)菌區(qū)系，其間存在較大規(guī)模的細(xì)菌相互擴(kuò)散[18-19]，但鮮有有關(guān)環(huán)境土壤對(duì)發(fā)酵豆醬菌群結(jié)構(gòu)影響的報(bào)道。另外，所有土壤，醬醅及豆醬樣品的Coverage值都接近于1，說明覆蓋率較高，測(cè)序結(jié)果體現(xiàn)了樣本中微生物的真實(shí)情況。

表1 四平樣品α多樣性分析Table 1 α Diversity in samples collected from Siping

表2 遼中樣品α多樣性分析Table 2 α Diversity in samples collected from Liaozhong

2.3 物種組成比較分析

2.3.1 物種Venn圖分析

Venn圖可用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的物種（如OTU）數(shù)目，可以比較直觀地表現(xiàn)樣本的物種組成相似性及重疊情況[20]。圖2A為四平發(fā)酵前3 個(gè)階段的豆醬與醬醅及土壤的Venn圖，樣品S1、S2、S3與土壤單獨(dú)共有（排除與醬醅共有）的OTU數(shù)分別為27（36.49%）、15（26.79%）、7（16.67%）。到了發(fā)酵后3 個(gè)階段，如圖2B所示，單獨(dú)共有OTU數(shù)減少為24（34.78%）、7（19.44%）、10（23.26%）。圖3A為遼中豆醬發(fā)酵前3 個(gè)階段與醬醅及土壤的Venn圖，樣品L1、L2、L3與土壤單獨(dú)共有的OTU數(shù)分別為47（40.51%）、9（21.95%）、13（25%）。到了發(fā)酵后3 個(gè)階段，如圖3B所示，單獨(dú)共有的OTU數(shù)減少為11（23.40%）、5（11.90%）、18（28.13%），變化趨勢(shì)與四平樣品結(jié)果相似。

結(jié)果表明，兩家豆醬在發(fā)酵的第1個(gè)階段（S1、T1），豆醬與土壤單獨(dú)共有OTU數(shù)目及占比均達(dá)到峰值，說明此階段土壤環(huán)境對(duì)發(fā)酵豆醬的OTU影響最大。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，這種影響逐漸減弱并上下波動(dòng)，且與多樣性指數(shù)分析結(jié)果一致。可能的原因?yàn)椋涸诎l(fā)酵的第1個(gè)階段，也就是下醬時(shí)期，土壤環(huán)境與豆醬直接接觸的機(jī)會(huì)最多，存在較大規(guī)模的細(xì)菌相互擴(kuò)散，從而對(duì)豆醬初期的菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定影響。后期隨著發(fā)酵的進(jìn)行，菌群結(jié)構(gòu)會(huì)趨于相對(duì)穩(wěn)定[6,21]，同時(shí)土壤環(huán)境與豆醬接觸的機(jī)會(huì)減少，因此土壤環(huán)境對(duì)后期豆醬菌群結(jié)構(gòu)影響較小。

圖2 四平樣品Venn圖Fig. 2 Venn diagrams for Siping samples

圖3 遼中樣品Venn圖Fig. 3 Venn diagrams for Liaozhong samples

2.3.2 門水平下樣品菌群結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，可以得知不同樣本在各分類水平上的群落結(jié)構(gòu)組成情況。四平樣品在門水平上的群落組分如圖4所示，土壤中微生物菌群結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，其主要的細(xì)菌門包括：厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）。發(fā)酵醬醅和豆醬的菌群結(jié)構(gòu)在門水平上較為相似，其主要的細(xì)菌門包括：厚壁菌門、變形菌門、放線菌門。發(fā)酵不同階段的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門均為厚壁菌門（占總數(shù)86.72%～99.50%），同時(shí)在醬醅階段及發(fā)酵前期，變形菌門（占總數(shù)10.84%～12.87%）也被大量檢出。值得一提的是，在豆醬發(fā)酵的各個(gè)階段均檢測(cè)到一定數(shù)量的放線菌門（0.35%～12.87%），并在發(fā)酵前兩個(gè)階段最為豐富，且放線菌門并未在醬醅樣品中大量發(fā)現(xiàn)。

圖4 門水平下四平樣品群落組分圖Fig. 4 Microbial community composition at the phylum level in Siping samples

遼中樣品也出現(xiàn)了相似結(jié)果，如圖5所示，遼中樣品主要的細(xì)菌門包括：厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門，其中放線菌門的相對(duì)豐度低于四平樣品。發(fā)酵醬醅和豆醬的菌群結(jié)構(gòu)在門水平上也較為相似，其主要的細(xì)菌門包括：厚壁菌門、變形菌門、放線菌門。發(fā)酵不同階段的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門均為厚壁菌門（占總數(shù)84.46%～99.86%），同時(shí)在發(fā)酵的首個(gè)階段，變形菌門（14.10%）和放線菌門（1.40%）也被大量檢出，但在醬醅樣品中放線菌門并未大量出現(xiàn)。因此，推測(cè)土壤環(huán)境的確會(huì)對(duì)豆醬菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，且主要的擴(kuò)散菌門為放線菌門。但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，這種影響會(huì)逐漸減弱，并維持在一定水平，該結(jié)果與之前的Venn圖分析結(jié)果一致。另外由圖4、5可知，遼中土壤對(duì)其豆醬的菌群結(jié)構(gòu)影響較小，可能是由于遼中土壤樣品中的放線菌門的相對(duì)豐度（23.90%）要低于四平樣品（33.91%）導(dǎo)致。

圖5 門水平下遼中樣品群落組分圖Fig. 5 Microbial community composition at the phylum level in Liaozhong samples

2.3.3 屬水平下樣品菌群結(jié)構(gòu)分析

進(jìn)一步分析了屬水平下各樣品的菌群結(jié)構(gòu)，動(dòng)態(tài)跟蹤了整個(gè)豆醬發(fā)酵過程中細(xì)菌變化過程。如圖6所示，四平樣品主要的細(xì)菌菌屬為：芽孢桿菌屬（Bacillus）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳桿菌屬（Lactobaillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、考克氏菌屬（Kocuria）等。

在醬醅階段，優(yōu)勢(shì)菌屬為：芽孢桿菌屬（87.08%）和假單胞菌屬（12.86%）。加入鹽水后，進(jìn)入豆醬階段，其優(yōu)勢(shì)菌屬為：芽孢桿菌屬（12.56%～68.62%）、四聯(lián)球菌屬（0.0 4%～8 1.4 3%）、明串珠菌屬（0.89%～10.40%）、魏斯氏菌屬（0.09%～7.26%）、乳桿菌屬（0.65%～5.94%）。醬塊加入鹽水后，前3 個(gè)階段芽孢桿菌逐漸減少，由S1階段的68.62%減少到S3的12.56%。在豆醬中，具有代表性的芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[22]，減少的原因可能是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵體系內(nèi)的乳酸菌產(chǎn)乳酸使總酸升高，pH值下降，由于較低的pH值對(duì)地衣芽孢桿菌的生長產(chǎn)生抑制作用[23]，所以芽孢桿菌的含量逐漸減少。原本在醬醅中大量存在的假單胞菌屬在豆醬發(fā)酵階段逐漸減少，在S3階段僅占0.06%，假單胞菌屬為導(dǎo)致食品腐敗的重要腐敗細(xì)菌，由于其為嚴(yán)格需氧型細(xì)菌[24]，豆醬發(fā)酵過程中的無氧環(huán)境不利于假單胞菌屬的生長。四聯(lián)球菌在S2階段迅速增加，到S3階段成為豆醬中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌。四聯(lián)球菌屬是促進(jìn)健康的益生菌，它廣泛存在于豆醬、醬油、魚醬等發(fā)酵食品中。酵母菌參加代謝反應(yīng)的產(chǎn)物主要為醇類和醛類，而四聯(lián)球菌屬代謝的產(chǎn)物則主要是以乳酸為主要酸的多種有機(jī)酸類，兩者結(jié)合，可以顯著提高產(chǎn)品中酯類物質(zhì)含量，所以四聯(lián)球菌屬在改善豆醬風(fēng)味方面具有重要作用[25]。

相較于發(fā)酵豆醬而言，土壤中的細(xì)菌菌屬過于復(fù)雜，單從群落組分圖上無法準(zhǔn)確得知其對(duì)豆醬菌群的具體影響。因此運(yùn)用Heatmap圖進(jìn)行深入分析，Heatmap圖是以顏色梯度表征二維矩陣或表格中的數(shù)據(jù)大小，并呈現(xiàn)群落物種組成信息。可使高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色變化與相似程度反映不同樣本在各分類水平上群落組成的相似性和差異性[26]，如圖7所示，放線菌門中的考克氏菌屬[27]（0.28%～1.57%）僅在土壤及豆醬樣品中（尤其是發(fā)酵前期）有較高豐度，而在醬醅樣品中并未大量發(fā)現(xiàn)。有報(bào)道稱，考克氏菌屬是自然發(fā)酵腐乳中的優(yōu)勢(shì)菌屬之一，其菌株胞外蛋白酶可以水解大豆蛋白產(chǎn)生氨基酸等風(fēng)味物質(zhì)[28-29]。同時(shí)這也再次印證了，土壤環(huán)境的確會(huì)對(duì)豆醬菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，且主要的擴(kuò)散菌門為放菌門的這一觀點(diǎn)。

圖6 屬水平下四平樣品群落組分圖Fig. 6 Microbial community composition at the genus level in Siping samples

如圖8所示，遼中樣品主要的細(xì)菌菌屬為四聯(lián)球菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬、腸球菌屬（Enterococcus）、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、魏斯氏菌屬等。在醬醅階段，優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌屬（88.16%），明串珠菌屬（8.59%）。加入鹽水后，進(jìn)入豆醬階段，其優(yōu)勢(shì)菌屬為四聯(lián)球菌屬（0.29%～96.58%）、乳桿菌屬（1.96%～51.85%）、腸球菌屬（0.26%～12.63%）、明串珠菌屬（0.5 5%～1 1.0 6%）、假單胞菌屬（0.04%～7.90%）。兩家豆醬中都存在乳桿菌屬和明串珠菌屬，豆醬中的乳桿菌主要是植物乳桿菌[30]，其不僅有利于食品的發(fā)酵，還可以改善食物的風(fēng)味，還具有一定益生特性，包括維持腸道內(nèi)菌群平衡、抑制腫瘤細(xì)胞的形成、降低血清膽固醇等[31-32]。明串珠菌是革蘭氏陽性、耐氧的一種乳酸菌，腸膜明串珠菌產(chǎn)乳酸，可以在高鹽和高糖環(huán)境中生長，因此在豆醬中廣泛存在[33]。此外，腸球菌屬僅為遼中豆醬的優(yōu)勢(shì)菌屬，而在四平豆醬中并未檢出，其可能的原因?yàn)椋篔eong等[34]發(fā)現(xiàn)在醬塊發(fā)酵過程中，隨著芽孢桿菌數(shù)量增多腸球菌數(shù)量降低，兩種菌種可能存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，而四平豆醬中芽孢桿菌為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，因此導(dǎo)致其腸球菌屬豐度降低。

圖7 屬水平下四平樣品Heatmap圖Fig. 7 Heatmap diagram at the genus level for Siping samples

圖8 屬水平下遼中樣品群落組分圖Fig. 8 Microbial community composition at the genus level in Liaozhong samples

圖9 為遼中樣品Heatmap圖，在豐度前20的菌屬中并未找到土壤與豆醬有明顯相關(guān)性的菌屬，其原因可能為：1）下醬過程中操作手法的不同，使土壤環(huán)境與豆醬接觸少；2）遼中土壤樣品中的放線菌門的相對(duì)豐度較低，無法深入影響發(fā)酵豆醬菌群結(jié)構(gòu)或是所影響的菌屬豐度較低，無法在圖中體現(xiàn)。該結(jié)果也與之前門水平的研究結(jié)果一致。兩家豆醬細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有較大差異，表明傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)組成與原料、制作手法、地區(qū)差異均有密切聯(lián)系，因此還需要進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)積累，并結(jié)合如轉(zhuǎn)錄組、代謝組等其他組學(xué)共同研究，以期進(jìn)一步了解傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬風(fēng)味和微生物組成差異的原因。

圖9 屬水平下遼中樣品Heatmap圖Fig. 9 Heatmap diagram at the genus level for Liaozhong samples

3 結(jié) 論

利用高通量測(cè)序技術(shù)，分別鑒定了采集自四平，遼中兩家傳統(tǒng)自然發(fā)酵的成熟醬醅、豆醬以及醬缸周圍土壤環(huán)境的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，四平樣品醬醅階段優(yōu)勢(shì)菌屬及相對(duì)豐度為芽孢桿菌屬（87.08%）和假單胞菌屬（12.86%）。豆醬階段優(yōu)勢(shì)菌屬及相對(duì)豐度為芽孢桿菌屬（12.56%～68.62%）、四聯(lián)球菌屬（0.0 4%～8 1.4 3%）、明串珠菌屬（0.89%～10.40%）、魏斯氏菌屬（0.09%～7.26%）、乳桿菌屬（0.65%～5.94%）。遼中樣品醬醅階段優(yōu)勢(shì)菌屬及相對(duì)豐度為乳桿菌屬（88.16%），明串珠菌屬（8.59%）。豆醬階段優(yōu)勢(shì)菌屬及相對(duì)豐度為四聯(lián)球菌屬（0.29%～96.58%）、乳桿菌屬（1.96%～51.85%）、腸球菌屬（0.2 6%～1 2.6 3%）、明串珠菌屬（0.55%～11.06%）、假單胞菌屬（0.04%～7.90%）。在揭示自然發(fā)酵豆醬細(xì)菌菌群的動(dòng)態(tài)變化的同時(shí)，比較分析土壤環(huán)境對(duì)自然發(fā)酵豆醬細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響，本研究發(fā)現(xiàn)：土壤環(huán)境會(huì)對(duì)豆醬菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，且主要的擴(kuò)散細(xì)菌為放線菌門中的考克氏菌屬，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，這種影響會(huì)逐漸減弱，并維持在一定水平。

4 討 論

高通量測(cè)序結(jié)果表明，兩家豆醬細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定差異，其可能是除原料及釀造工藝外造成豆醬風(fēng)味不同的另一主要原因。土壤環(huán)境對(duì)豆醬細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，豆醬菌群結(jié)構(gòu)會(huì)趨于相對(duì)穩(wěn)定，土壤環(huán)境與豆醬接觸的機(jī)會(huì)減少，從而使得土壤環(huán)境對(duì)豆醬細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)影響減小。同時(shí)，下醬過程中的操作手法，土壤樣品中的放線菌門的相對(duì)豐度也可能對(duì)菌群結(jié)構(gòu)變化造成影響。此外，土壤環(huán)境中的霉菌對(duì)豆醬菌群結(jié)構(gòu)是否存在影響還有待探討，同時(shí)還需結(jié)合如轉(zhuǎn)錄組、代謝組等其他組學(xué)共同研究，以期進(jìn)一步了解傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬風(fēng)味和微生物組成差異的原因及其代謝機(jī)理。