冷藏草魚源氣單胞菌的群體感應現象及其對生物膜形成的影響

張彩麗，王辰晨，朱菲菲，劉海梅，劉巖龍*

（魯東大學食品工程學院，山東 煙臺 264025）

草魚（Ctenopharyngodon idellus）肉質鮮嫩、營養豐富，深受消費者的喜愛，是我國淡水養殖產量最高的魚類，2017年產量高達534.56萬 t[1]。水產品在貯藏、運輸以及銷售過程中，常常由于幾種微生物的活動而導致腐敗變質，這些微生物被稱為特定腐敗菌，是引起水產品腐敗的關鍵因素[2]。已有研究顯示氣單胞菌是冷藏草魚的特定腐敗菌，草魚在4 ℃貯藏8 d時，氣單胞菌數量達到8.49（lg（CFU/g）），占細菌比例的48.76%[3]。氣單胞菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陰性菌，最低生長溫度為0～5 ℃，可以在低溫條件下與其他嗜冷菌競爭，因此在冷藏水產品中常常檢出，魚類水產品中氣單胞菌的污染率達31.9%[4]。

細菌在生長繁殖過程中會產生一類被稱為自誘導物的信號分子。隨著細菌密度的增加，信號分子濃度也隨之增加，當達到一定閾值時，便會啟動某些基因的表達調控細菌的生理活動，從而表現出一定的群體行為，這種現象稱為群體感應[5]。很多研究顯示群體感應調控細菌的生理性狀，如胞外酶的分泌、毒力因子的表達等[6]。N-酰基高絲氨酸內酯（N-acyl-homoserine lactones，AHLs）是革蘭氏陰性菌中廣泛存在的最典型群體感應信號分子，其分子結構由一個高絲氨酸內酯環和酰基側鏈組成，因酰基側鏈取代基（—H、—OH、＝O等）不同、碳鏈長度或不飽和度的不同而存在差異[7]。

生物膜是微生物聚集在一起形成的特殊細菌群落，它增強了細菌抵抗外界環境的能力。生物膜一旦形成，便很難清除，這為食品的貯運和保藏帶來很大的風險，也是影響食品工業衛生安全的一個重要指標[8]。研究顯示細菌的群體感應現象可以影響生物膜的形成[9]，群體感應抑制劑可以有效地抑制細菌的生物膜形成[10]。

本研究以冷藏草魚的優勢腐敗菌氣單胞菌為對象，探究其群體感應現象以及生物膜的形成情況，評價群體感應對氣單胞菌生物膜形成的影響，旨在為冷藏草魚的保鮮貯運提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）、Luria-Bertani（LB）肉湯、LB瓊脂、生理生化實驗試劑盒青島海博生物技術有限公司；結晶紫、乙醇 國藥集團化學試劑有限公司；N-丁酰基高絲氨酸內酯（N-butanoyl-L-homoserinelactone，C4-HSL）、N-己酰基高絲氨酸內酯（N-hexanoyl-L-homoserinelactone，C6-HSL） 上海甄準生物科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、2×EasyTaq PCR Supermix 全式金生物技術有限公司；RP-18 F254S反相C18-薄層色譜板 德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

SHP-250生化培養箱 上海培因實驗儀器有限公司；HY-60振蕩搖床 武漢匯誠生物科技有限公司；LDZX-40II型高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械公司；SWCJ-2FD 超凈工作臺 上海博迅實業有限公司；UV-1300型紫外-可見分光光度計 上海美析儀器有限公司；Tanon-5200凝膠成像系統 上海天能科技有限公司；KH19A高速離心機 湖南凱達科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌的分離

冷藏草魚貯藏8 d（貨架期終點），隨機取出2 尾，無菌條件下取腹部魚肉25 g，參照Wang Guangyu等[11]的方法分離氣單胞菌。挑取菌落數在30～300 CFU的平板，對單菌落進行純化并保存。純化的菌株以W1、W2、W3……進行命名。

1.3.2 細菌的鑒定

利用全式金細菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，然后擴增細菌的16S rRNA序列[12]，將聚合酶鏈式反應產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果利用NCBI數據庫進行比對。

將分離的氣單胞菌屬細菌進行氧化酶、氨基酸、糖類利用、七葉苷等生理生化實驗，在細菌種水平上進一步鑒定。

1.3.3 AHLs活性檢測

平板劃線法：將待檢測菌株與報告菌株CV026在LB平板上平行劃線，28 ℃培養18～24 h，觀察顏色變化[13]。

報告平板法：利用報告平板法檢測細菌生長過程中的AHLs活性變化。過夜活化的菌株W41和W69接種于LB肉湯，每隔4 h取10 mL菌液，12 000 r/min離心10 min后，獲得細菌上清液，將細菌上清液經0.22 μm微膜過濾除菌后，于-20 ℃保存備用。取過夜培養至對數期的紫色桿菌CV026 2～3 mL，加入冷卻至40 ℃的含1.5%瓊脂的LB中，混勻后傾倒平板。待平板凝固后，用無菌打孔器在瓊脂中央打孔，加入50 μL不同培養時間的細菌上清，于28 ℃培養24～48 h，用游標卡尺量取紫色區域直徑，直徑越大表明AHLs濃度越高[14]。

1.3.4 AHLs提取

參考文獻[15]的方法，取培養至對數期的菌液100 mL，于10 000 r/min離心10 min，收集上清液，取50 mL細菌上清液用等體積乙酸乙酯（0.5%甲酸酸化）萃取3 次，合并有機相，旋蒸、溶解，保存至-20 ℃。

1.3.5 AHLs鑒定

反相薄層層析法[16]：利用C18-反相薄層層板，將標準品AHLs與乙酸乙酯提取物2～5 μL點樣于反相薄層層析板，利用甲醇-水（60∶40，V/V）充分展開，取出后在常溫下揮干溶劑，按制備報告平板方法制備含CV026菌液的LB瓊脂，傾到于薄層層析板上，凝固后，28 ℃培養18～24 h，根據遷移值比對信號分子類型。

氣相色譜-質譜法[17]：將乙酸乙酯提取的AHLs利用氣相色譜-質譜進一步鑒定，使用6890 N氣相色譜結合5973質譜儀，HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），升溫程序：初始溫度150 ℃保持3 min，以25 ℃/min升至280 ℃；氦氣作為載氣，流速0.8 mL/min；進樣量1 μL；不分流模式。質譜條件：電子電離源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，激活電壓1.5 V，選擇性掃描模式m/z143。

1.3.6 生長曲線測定

將待測細菌分別在LB瓊脂活化后，挑取單菌落接種在LB肉湯中，過夜培養后，按1%比例接種在100 mL新鮮LB肉湯中，120 r/min、30 ℃振蕩培養，0、4、8、12、16、20 h和24 h后在無菌環境下取出菌液10 mL，于600 nm波長處測定OD值，每個實驗重復3 次。

1.3.7 生物膜形成測定

參考Peeters等[18]的方法利用結晶紫染色法測定細菌的生物膜形成量。將過夜培養的細菌按1%比例接種在48 孔細胞培養板中（裝液量1 mL TSB），30 ℃靜置培養36 h。小心吸除菌懸液，用蒸餾水清洗每個孔3 次，然后用0.1 g/100 mL的結晶紫染色15 min，再用蒸餾水清洗每個孔3 次后，加入95%乙醇溶液脫色5 min，混勻后于590 nm波長處測定吸光度，以無菌的TSB肉湯作為空白組。每個實驗重復3 次。

不同溫度生物膜測定：將過夜培養的細菌按1%比例接種于LB肉湯中，然后加入48 孔細胞培養板中，分別置于8、30 ℃和37 ℃培養36 h，參考上述結晶紫方法測定生物膜形成量。每個實驗重復3 次。

外源C4-HSL、C6-HSL對生物膜影響：將過夜培養的細菌按1%比例接種于LB肉湯中，然后加入48 孔細胞培養板中，分別加入終濃度為2、5、10、20、50 μmol/L的外源C4-HSL或C6-HSL（C4-HSL和C6-HSL溶解于二甲基亞砜），以添加二甲基亞砜組作為對照，30 ℃靜置培養36 h，參考上述結晶紫方法測定細菌的生物膜形成量。每個實驗重復3 次。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 細菌的鑒定

利用分子生物學方法，對20 株細菌進行16S rRNA擴增，獲得的序列經NCBI數據庫進行BLAST比對，結果顯示均為氣單胞菌屬（Aeromonas）。生理生化實驗結果（表1）顯示，本研究分離的氣單胞菌氧化酶反應均為陽性，均不能利用鳥氨酸和阿拉伯糖，而均具有利用葡萄糖產酸的能力，但是相同種水平的細菌在精氨酸、賴氨酸、七葉苷、水楊苷等的利用上存在差異。Abbott等[19]的研究也顯示氣單胞菌屬在種水平的鑒定比較困難，傳統的生理生化反應多有重疊，很難明確區分，而且鑒定的實驗方法也不一致。結合16S rRNA結果，本研究分離的氣單胞菌屬包括殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida，7 株）、嗜水氣單胞菌（A. hydrophila，5 株）、中間氣單胞菌（A. media，3 株）、A. rivuli（3 株）和A. molluscorum（2 株），其中嗜水氣單胞菌包含多個亞種。

表1 氣單胞菌鑒定結果Table 1 Identification of the isolated Aeromonas spp.

2.2 AHLs檢測結果

報告菌株平板劃線法是定性檢測細菌產AHLs能力的最直接最快速的方法，Chromobacterium violaceumCV026是常用的報告菌株之一。C. violaceum CV026本身不產AHLs，但具有感受AHLs的蛋白CivR，當感受到外界AHLs，可產生肉眼可見的紫色。如圖1所示，冷藏草魚中分離的20 株菌中，有18 株氣單胞菌可誘導CV026發生顏色反應，只有菌株W72、W85不產生AHLs。

圖1 利用報告菌株C. violaceum CV026平行劃線檢測細菌AHLs活性Fig. 1 Detection of AHLs production in Aeromonas spp. strain suspensions cross fed with biosensor C. violaceum CV026

2.3 生物膜檢測結果

利用結晶紫染色法半定量檢測氣單胞菌的生物膜形成情況，因為葡萄糖促進細菌生物膜的形成，所以在初步檢測細菌的生物膜形成能力時，采用含有葡萄糖的TSB肉湯進行培養。參考Stepanovic等[20]的方法，將空白孔A590nm值的3 倍標準差作為臨界cut-off值，根據A590nm值將細菌分為以下幾類：A590nm≤0.20，弱生物膜形成能力；0.20＜A590nm≤0.80，中等生物膜形成能力；A590nm＞0.80，強生物膜形成能力。如圖2所示，20 株氣單胞菌屬中，有13 株為弱生物膜形成能力，5 株為中等生物膜形成能力（W51、W56、W65、W69、W70），2 株為強生物膜形成能力（W41、W77）。其中菌株W41的生物膜形成能力最強，A590nm達3.049±0.07。本研究將選取2 株產AHLs的細菌為代表，進一步研究AHLs對氣單胞菌生物膜形成能力的影響。為減少細菌的種間差異，選取相同種水平的生物膜形成能力不同的2 株細菌，因此選取A. salmonicida W41和A. salmonicida W69作后續研究。

圖2 20 株氣單胞菌生物膜形成能力的定量檢測結果Fig. 2 Biofilm formation ability of 20 isolates determined using the quantitative adhesion test

2.4 細菌生長曲線及AHLs產生規律

將細菌W41和W69接種在LB肉湯中，測定其生長曲線和AHLs產生規律。如圖3A所示，2 株菌在最適生長溫度（30 ℃）下適應環境能力和生長繁殖速度很快，培養4 h后即進入對數期，24 h時細菌W41和W69的密度（OD600nm）分別達2.12±0.06和1.80±0.01，菌株W41的生長速率始終顯著快于W69（P＜0.05）。2 株菌產AHLs規律分別如圖3B、C所示，紫色圓圈直徑越大表示AHLs活性越高，從4 h開始菌株W41（OD600nm為0.31±0.02）和W69（OD600nm為0.08±0.01）便有可檢測的AHLs產生，且隨著細菌密度的增加AHLs活性增加。W41的AHLs活性從4 h開始維持較高水平，在20 h活性有所下降；菌株W69的AHLs活性在8 h達到最高，從12 h稍有下降后便維持在穩定水平。在細菌培養過程中，AHLs活性一般都呈現先上升后下降的趨勢，對蝦源不動桿菌Acinetobacter spp. M1的AHLs分泌也有相似的現象，Acinetobacter spp. M1中AHLs活性在0～24 h隨細菌密度的增加呈現逐漸增長的趨勢，在24 h對數末期達到最大值，然后開始下降，其主要原因是細菌生長到達穩定期時，細菌產生的次級代謝產物導致呈堿性環境，而AHLs在堿性環境中不穩定[21]。該現象在Vibrio anguillarum、Hafnia alvei等細菌的AHLs活性規律檢測中都有發現[22-23]。

圖3 菌株生長曲線（A）及 W41（B）、W69（C）的AHLs分泌規律Fig. 3 Growth curves (A) and AHLs activity of strains W41 (B) and W69 (C) during incubation

2.5 AHLs類型鑒定

利用薄層色譜法檢測氣單胞菌W41和W69產生的AHLs類型，結果如圖4所示，2 株氣單胞菌均可產生C4-HSL和C6-HSL，且C4-HSL活性高于C6-HSL。氣相色譜-質譜進一步鑒定如圖5所示，氣單胞菌A. salmonicida W41和A. salmonicida W69主要產生C4-HSL和C6-HSL類型信號分子。Gui Meng等[24]從真空包裝冷藏鱘魚的特定腐敗菌A. veronii LP-11中檢測到C6-SHL、C8-HSL、3-oxo-C8-HSL和3-OH-C8-HSL四種AHLs。Nagar等[25]檢測了22 株不同食品源氣單胞菌產生的AHLs類型，其中18 株可以產生C4-HSL，18 株可以產生C6-HSL，另外某些氣單胞菌還可以產生奇數鏈的AHLs（如C5-HSL、C7-HSL），由此可以看出，C4-HSL和C6-HSL是氣單胞菌屬產生的典型AHLs。細菌AHLs產生差異可能與細菌的種水平以及生存環境有關。

圖4 薄層色譜法檢測氣單胞菌W41和W69的AHLs活性Fig. 4 AHL profile of strains W41 and W69 detected by thin-layer chromatography with C. violaceum CV026

圖5 氣相色譜-質譜檢測菌株W41和W69提取液中的AHLs類型Fig. 5 Gas chromatography-mass spectrometry analysis of AHLs extracted from culture supernatants of strains W41 and W69

2.6 溫度對氣單胞菌生物膜形成影響

將2 株菌W41和W69接種在LB肉湯中，測定不同溫度下培養36 h的生物膜形成量，選取的3 個溫度為8、30、37 ℃分別為食品冷鏈溫度、細菌最適生長溫度和最高生長溫度。如圖6所示，2 株菌在8 ℃的生物膜形成量沒有顯著差異，而在30 ℃時W41的生物膜形成量顯著高于W69（P＜0.05）。細菌W41的生物膜形成量從高到低分別為30 ℃＞8 ℃＞37 ℃；細菌W69的生物膜形成量從高到低分別為8 ℃＞30 ℃＞37 ℃。由此看出，細菌生物膜的形成受多種因素的影響，細菌個體間也存在較大差距，溫度因素也是影響生物膜形成的重要因素。海洋源弧菌V. alginolyticus的生物膜形成能力為16 ℃＞28 ℃＞40 ℃，且不同個體間鰻弧菌的生物膜形成能力也存在較大差異[26]。

圖6 不同溫度下菌株W41和W69的生物膜形成量Fig. 6 Biofilm formation of strains W41 and W69 at different temperatures

2.7 AHLs對氣單胞菌生物膜形成的影響

圖7 C4-HSL（A）和C6-HSL（B）濃度對菌株W41和W69生物膜形成能力的影響Fig. 7 Biofilm formation of strains W41 and W69 upon supplementation with exogenous C4-HSL (A) and C6-HSL (B) at 30 ℃

許多研究顯示細菌的生物膜形成受群體感應的調控，通過外源添加不同濃度的C4-HSL和C6-HSL，探究外源AHLs對氣單胞菌生物膜的影響。如圖7所示，C4-HSL對菌株W41的生物膜形成沒有影響，50 μmol/L C6-HSL顯著促進了菌株W41生物膜的形成（P＜0.05）。而對于菌株W69，低濃度的AHLs促進W69生物膜的形成，高濃度的AHLs抑制其生物膜的形成；1～10 μmol/L C4-HSL促進了W69生物膜的形成，50 μmol/L C4-HSL抑制了W69生物膜的形成；類似地，10 μmol/L C6-HSL顯著促進W69生物膜的形成（P＜0.05），20 μmol/L濃度C6-HSL對菌株W69生物膜的形成顯示抑制作用。該現象在蜂房哈夫尼菌（H. alvei）中也有體現，Hou Hongman等[23]的研究顯示低濃度（5、10 μmol/L）的C6-HSL促進H. alvei生物膜形成，而高濃度的（20、40 μmol/L）的C6-HSL抑制H. alvei生物膜形成，而C4-HSL和3-oxo-C8-HSL的作用效果則與C6-HSL相反。Zhao Dandan等[27]的研究結果表明0.5 mmol/L C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL和C8-HSL對魚糜中的A. veronii均顯示促進效果。Li Tingting等[28]的研究結果顯示外源添加的C4-HSL、C6-HSL和C10-HSL不同程度地促進了冷藏大菱鲆源假單胞菌屬P. fluorescens生物膜的形成，其中以C6-HSL的促進效果最為顯著。由此可以看出，細菌對群體感應信號分子的感受能力存在較大的個體差異，細菌對AHLs類型以及濃度具有一定依賴性。

3 結 論

本研究檢測了冷藏草魚源分離獲得的20 株氣單胞菌Aeromonas spp.的群體感應現象和生物膜形成情況，有18 株氣單胞菌可以產生AHLs信號分子，20 株菌均顯示有不同強弱程度的生物膜形成能力。以生物膜形成能力較強的2 株菌A. salmonia W41和A. salmonia W69為主要對象，結果表明2 株菌的AHLs活性具有菌體密度依賴性，該2 株菌主要產生C4-HSL和C6-HSL信號分子，AHLs對細菌的生物膜形成能力影響不同，其中高濃度C6-HSL促進A. salmonia W41生物膜的形成；而高濃度AHLs降低了A. salmonia W69的生物膜形成，低濃度AHLs促進A. salmonia W69生物膜的形成。本研究顯示大多數草魚源氣單胞菌可以產生群體感應信號分子，并且AHLs可以影響氣單胞菌生物膜的形成情況，為水產品保鮮劑的開發提供一定的理論支持。