鯽魚魚鱗抗菌多肽的制備純化及其抑菌活性

顧晨濤，黃 灑，王雪燕，李明巖，施永清*

（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018）

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是一種天然低分子質量多肽，在機體免疫系統中起著重要的作用[1-2]，廣泛存在于細菌、植物、軟體動物、兩棲類動物、魚類、鳥類和哺乳動物等體內，其具有活性強、功能廣泛、廣譜殺菌等特點[3]。由于其天然的抗菌性能和較弱的細菌耐藥性，是化學防腐劑、抗生素等防腐抗菌藥物很好的替代品[4-5]，正如乳酸鏈球菌素Nisin已成功作為天然食品防腐劑應用于魚類等食品防腐保鮮領域中[6-7]。

魚類是水生動物群的主要組成部分，其中也存在著多種抗菌肽。關于魚類抗菌肽的相關報道很多，如Lin Weiju等[8]從石斑魚（Epinephelus coioides）中得到抗菌肽Epinecidin-1。研究表明魚類抗菌肽還具有獨特特性，如在極高鹽濃度下也能發揮作用[9]，所以魚類抗菌肽表現出良好的發展和應用前景[10-12]。

我國是魚類養殖大國，而魚鱗作為魚的副產物，常被當作廢棄物而丟棄，這不僅會導致環境污染，還會造成資源的大量浪費，因此提高魚鱗綜合利用率就顯得尤為重要[13-14]。本研究以鯽魚魚鱗為原料，通過酶解法并分離純化得到鯽魚魚鱗抗菌多肽，這既充分利用了廢棄魚鱗資源，使低值的魚鱗高值化，也為以后進一步開展此類研究或以此為基礎應用于食品或醫藥行業提供理論依據和數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鯽魚魚鱗 杭州市海天農貿市場；LB培養基、PDA培養基 杭州微生物試劑有限公司；胃蛋白酶（1∶3 000）美國Amresco公司；透析袋 上海源葉生物科技有限公司；Sephadex G-15、Sephadex G-50 上海寶曼生物科技有限公司；纖維素DEAE-52 英國Whatman公司；寬分子質量標準蛋白Marker 日本TaKaRa公司；其他試劑均為國產分析純。

菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella choleraesuis）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、黑曲霉（Aspergillus niger）、產黃青霉（Penicillium chrysogenum）、毛霉（Mucor wutungkiao），由浙江工商大學食品與生物工程學院微生物實驗室提供。

1.2 儀器與設備

ZX98-1旋轉蒸發儀 上海豫康科教儀器設備有限公司；YXQ-LS-18SI自控型手提式滅菌器 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；SW-CJ-1D單人凈化工作臺 浙江蘇凈凈化設備有限公司；普通玻璃層析柱（1.6 cm×20 cm、2.6 cm×20 cm、1.6 cm×60 cm）上海滬西分析儀器廠有限公司；BT100-2J精密蠕動泵保定蘭格恒流泵有限公司；HD-5電腦紫外檢測儀、SBS-100數控計滴自動部分收集器 上海青浦滬西儀器廠；FD-1A-50冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；Mini電泳儀、電泳槽、Gel Doc XR＋凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；Spectra Max 190酶標儀美國Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液的提取

將收集的新鮮鯽魚魚鱗用清水反復清洗，洗去魚鱗表面的黏液和銀屑等雜質，于40 ℃鼓風干燥箱中烘干后冷藏備用。

取5 g干燥鯽魚魚鱗，用剪刀將其剪碎，然后加入0.5 mol/L NaOH溶液，液料比10∶1（mL/g），磁力攪拌3 h，每1.5 h換液一次，以除去魚鱗中的雜蛋白并使魚鱗結構酥松，用蒸餾水清洗至中性。然后加入0.2 mol/L EDTA-2Na[15]，液料比15∶1（mL/g），超聲輔助脫鈣2 h，以除去魚鱗中的鈣鹽等礦物質，使膠原蛋白較易溶出，用蒸餾水清洗至中性[16-17]。

取預處理后的鯽魚魚鱗，加入10%檸檬酸溶液[18]，液料比14∶1（mL/g），然后置于50 ℃恒溫水浴鍋中提取12 h。將提取的魚鱗膠原蛋白溶液調節至pH 1.5左右，然后加入質量分數0.8%的胃蛋白酶，在37 ℃恒溫水浴振蕩2 h完成酶解[19]。酶解后將樣品置于80 ℃恒溫水浴鍋中10 min進行滅酶處理[20]。滅酶后的樣品溶液在4 ℃、4 000 r/min離心20 min，得到的上清液即為澄清魚鱗抗菌多肽粗酶液。繼續將澄清粗酶液在40 ℃旋蒸濃縮至20 mL，即4 mL/g魚鱗，最終得到濃縮后的鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液，測得其pH值約為1.5，-40 ℃凍藏備用。

1.3.2 抑菌活性測定

采用雙層牛津杯抑菌圈法[21]。在無菌條件下，取無菌培養皿，倒入約10 mL滅菌LB培養基，靜置待其凝固后，將滅菌牛津杯用無菌鑷子夾出，在酒精燈外焰迅速過火，垂直放置于培養基表面。另用移液槍吸取1 mL受試菌菌懸液（1×106CFU/mL），加入到100 mL冷卻至50 ℃左右的滅菌LB培養基中搖勻，制成混有受試菌的LB培養基，并取約20 mL倒入到培養皿中。靜置待其凝固后，用鑷子取出牛津杯，用移液槍吸取100 μL魚鱗抗菌多肽試樣加入到孔中。并添加生理鹽水、等pH值的鹽酸和50 μg/mL氯霉素溶液分別作為空白對照、陰性對照和陽性對照。將培養皿放入37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，用游標卡尺十字交叉法測量抑菌圈直徑大小，以此評價鯽魚魚鱗抗菌多肽的抑菌活性。霉菌為PDA培養基，以0.1%山梨酸鉀溶液作為陽性對照，培養條件為28 ℃培養48 h，其他操作過程同細菌。實驗重復3 次，測量取平均值。

1.3.3 鯽魚魚鱗抗菌多肽的分離純化

1.3.3.1 透析

將濃縮后的鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液裝于截留分子質量為3 000 Da的透析袋中，以蒸餾水為透析液，置于4 ℃冰箱中透析12 h，每4 h更換一次透析液。將透析后的抗菌多肽粗酶液冷凍干燥后備用。

1.3.3.2 Sephadex G-15凝膠過濾層析

將透析后的抗菌多肽粗酶液樣品經Sephadex G-15凝膠過濾層析柱對樣品進行粗分離[22]。樣品適當濃度溶解后取4 mL，經0.45 μm濾膜過濾，上樣于經超純水平衡后的Sephadex G-15凝膠過濾柱（1.6 cm×20 cm），用超純水進行洗脫，流速為0.5 mL/min，自動部分收集器收集5 mL/管，用電腦紫外檢測儀檢測280 nm波長處吸光度并繪制洗脫曲線。收集各峰對應組分，測定其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性，將有抑菌性的組分冷凍干燥后進行下一步分離。

1.3.3.3 Sephadex G-50凝膠過濾層析

取Sephadex G-15凝膠過濾層析后的凍干樣品，經超純水溶解成質量濃度為20 mg/mL的蛋白溶液后用0.45 μm濾膜過濾，取5 mL上樣于經超純水平衡后的Sephadex G-50凝膠過濾柱（1.6 cm×60 cm），以超純水為流動相，控制流速0.5 mL/min。自動部分收集器每3 mL收集1 管，調整電腦紫外檢測儀靈敏度，在280 nm波長處檢測吸光度信號并繪制洗脫曲線。收集各洗脫峰對應組分，裝入透析袋后用PEG20000濃縮[23]，分別測定各峰組分對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性。收集具有較好抑菌活性的峰組分，冷凍干燥后備用。

1.3.3.4 DEAE-52陰離子交換層析

取Sephadex G-50凝膠過濾層析后的凍干蛋白樣品，用0.02 mol/L、pH 6.8磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）溶解，配制成蛋白質量濃度為10 mg/mL的上樣液。0.22 μm濾膜過濾后，取10 mL蛋白液加樣于經0.02 mol/L、pH 6.8的PBS平衡后的DEAE-52陰離子交換柱（2.6 cm×20 cm），先用PBS充分洗脫掉未被吸附的蛋白，然后用含0.1～0.5 mol/L NaCl的PBS分段梯度洗脫，流速為1 mL/min，自動部分收集器收集5 mL/管，調整紫外檢測儀靈敏度，檢測280 nm波長處吸光度信號，并繪制出相應洗脫曲線[24]。收集各洗脫峰對應的蛋白液，裝入透析袋后用PEG20000濃縮，分別測定各組分對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性，將有抑菌活性的峰組分冷凍干燥后置于干燥器中保存。

1.3.4 鯽魚魚鱗抗菌多肽SDS-PAGE分析

將純化后鯽魚魚鱗抗菌多肽和標準蛋白質Marker利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析[25]。采用分離膠15%，濃縮膠5%。標準蛋白質Marker上樣量5 μL，純化后的蛋白樣品上樣量10 μL。加入電泳緩沖液后，調節初始電壓80 V開始電泳，當溴酚藍染料指示前沿到達分離膠時，電壓升至130 V，跑至分離膠底部時電泳結束。電泳后于水平搖床，先將凝膠置于固定液中固定30 min，然后在考馬斯亮藍R-250染色液中染色2 h，再用脫色液進行脫色處理，中間更換兩次脫色液直至條帶清晰可見。利用凝膠成像系統進行拍照和分子質量分析。

1.3.5 鯽魚魚鱗抗菌多肽廣譜抑菌活性測定

將分離純化后的鯽魚魚鱗抗菌多肽進行廣譜抑菌活性測定分析[26]。采用雙層牛津杯抑菌圈法，分別測試其對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌，對大腸桿菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、假單胞菌、希瓦氏菌等革蘭氏陰性菌，以及對黑曲霉、產黃青霉、毛霉等真菌的抑菌性能。

1.3.6 鯽魚魚鱗抗菌多肽MIC測定

采用二倍稀釋法[27-28]測定鯽魚魚鱗抗菌多肽對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色葡萄球菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌、 假單胞菌、希瓦氏菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

取新鮮活化的各細菌菌懸液，用LB液體培養基稀釋至1×106CFU/mL，然后依次加入96 孔板的第1～12孔，每孔100 μL。配制質量濃度為1 024、512、256、128、64、32、16、8、4、2 μg/mL的抗菌多肽溶液，然后取各質量濃度的抗菌多肽溶液100 μL分別加入到第2～11孔中，各孔抗菌多肽質量濃度即降為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL。其中第1孔添加等量空白LB液體培養基，第12孔添加等量50 μg/mL氯霉素溶液，分別作為陰性對照和陽性對照。37 ℃培養20 h后，用酶標儀測定各孔600 nm波長處OD值，并根據下式計算抑菌率：

式中：Y為抑菌率；X樣為待測樣品；X陰為陰性對照；X陽為陽性對照。將抑菌率Y大于95%的最小質量濃度定義為該菌的MIC[29]。

1.4 數據分析

采用Excel 2010和Origin 8.0軟件進行數據處理和繪圖，采用Image Lab 5.2.1進行電泳凝膠成像和分析。

2 結果與分析

2.1 鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液抑菌活性測定

以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為受試菌，測定鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液的抑菌活性，結果如表1所示。

表1 鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液抑菌活性Table 1 Antimicrobial activity of enzymatic hydrolysate of crucian carp scales

由表1可知，鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液具有很好的抑菌活性，抑菌效果也顯著好于陽性對照組。可能是由于濃縮后的鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液較黏稠，濃度較高，并且濃縮后的粗酶液呈輕微黃色，故需對鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液進一步分離純化。

2.2 Sephadex G-15凝膠過濾層析結果分析

由圖1a可知，透析后的鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液經Sephadex G-15分離后出現兩個吸收峰，分別對兩個峰按順序標號為A和B，并以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為受試菌進行抑菌活性測定，如圖1b所示，其中0為空白對照，結果顯示僅A組分有明顯抑菌活性，所以取A組分進行下一步分離純化。

2.3 Sephadex G-50凝膠過濾層析

從圖2a可知，粗分離后的A樣品溶液經過Sephadex G-50凝膠柱后，產生4 個紫外吸收峰，分別對其標號為Aa、Ab、Ac、Ad。再分別對4 個峰組分濃縮后進行抑菌活性測定，如圖2b所示，其中0為空白對照，Aa與Ab并未出現抑菌圈，說明該蛋白組分無抑菌活性，Ac與Ad均有抑菌圈出現，但考慮Ad抑菌圈較小抑菌效果不明顯，故選擇抑菌活性更強的Ac組分進行下一步分離純化。

圖2 Sephadex G-50凝膠過濾層析洗脫圖譜（a）及各洗脫峰組分抑菌活性（b）Fig. 2 Elution curve from Sephadex G-50 gel filtration chromatography (a)and antimicrobial activity of all elution peaks (b)

2.4 DEAE-52陰離子交換層析

圖3 DEAE-52陰離子交換層析洗脫圖譜（a）及各洗脫峰組分抑菌活性（b）Fig. 3 Elution curve from DEAE-52 anion-exchange chromatography (a)and antimicrobial activity of all elution peaks (b)

由圖3a可知，將Sephadex G-50分離后的Ac組分上樣于纖維素DEAE-52陰離子交換柱，先用PBS洗脫未被吸附的蛋白。然后分別用含0.1、0.3 mol/L和0.5 mol/L NaCl的PBS階段洗脫，共出現3 個洗脫峰，分別標注為AcI、AcII和AcIII，濃縮后分別測定各抑菌活性。如圖3b所示，0為空白對照，僅AcIII有抑菌圈表現出其抑菌活性，故將AcIII確定為分離純化后的鯽魚魚鱗抗菌多肽并凍干保存。

2.5 SDS-PAGE結果

將經過透析，Sephadex G-15、Sephadex G-50和DEAE-52層析柱分離純化后得到的鯽魚魚鱗抗菌多肽AcIII組分樣品進行SDS-PAGE分析，結果見圖4。

圖4 鯽魚魚鱗抗菌多肽SDS-PAGE圖Fig. 4 SDS-PAGE pattern of purified antimicrobial peptide

由圖4可知，分離純化后的鯽魚魚鱗抗菌多肽AcIII只顯示出單一條帶，說明鯽魚魚鱗抗菌多肽AcIII已達到電泳級純。利用凝膠成像系統軟件分析得出其分子質量約為20.1 kDa。

2.6 鯽魚魚鱗抗菌多肽廣譜抑菌活性效果

圖5 鯽魚魚鱗抗菌多肽對革蘭氏陽性菌、陰性菌和霉菌的抑菌活性Fig. 5 Antibacterial activities of antimicrobial peptide AcIII against G+ bacteria, G- bacteria and molds

由圖5可知，鯽魚魚鱗抗菌多肽對所有受試細菌與霉菌均有較好的抑菌作用，與各陽性對照間均存在顯著性差異（P＜0.05）。其對細菌的抑菌圈直徑都能達到20 mm以上，其中對革蘭氏陽性菌中的金黃色葡萄球菌有最大抑菌圈，直徑為24.31 mm，顯著大于Li Tao等[30]從非洲鯰魚（Clarias gariepinus）副產物中得到的抗菌肽對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑（8.34 mm和6.13 mm）。對霉菌的抑菌效果相對細菌較弱，但抑菌圈直徑也均能達到15 mm以上，其中對毛霉有最大抑菌圈，直徑為19.98 mm。由此可得，鯽魚魚鱗抗菌多肽具有很好的廣譜抑菌活性。

2.7 鯽魚魚鱗抗菌多肽MIC測定結果

表2 鯽魚魚鱗抗菌多肽對各細菌的MICTable 2 MICs of antimicrobial peptide AcIII against bacteria

由表2可知，鯽魚魚鱗抗菌多肽對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色葡萄球菌、副溶血性弧菌、假單胞菌和希瓦氏菌的MIC為16 μg/mL，對大腸桿菌和沙門氏菌的MIC為32 μg/mL，相較于Li Chunlei等[31]發現的AI-hemocidin 2抗菌多肽對革蘭氏陽性和陰性菌的MIC為37.5～300 μg/mL，其具有更高的抑菌活性。

3 結 論

本研究利用鯽魚魚鱗為基礎原料，通過預處理后酸提酶解等過程獲得鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液，并經過透析，Sephadex G-15、Sephadex G-50凝膠過濾柱層析和纖維素DEAE-52陰離子交換柱層析對其進行分離純化，最后得到一個具有較強抑菌活性的蛋白組分AcIII。該組分SDS-PAGE顯示為單一條帶，表明其已達到電泳純級，分析得其分子質量約為20.1 kDa。同時通過測定分離純化后的鯽魚魚鱗抗菌多肽對多種細菌和霉菌的抑菌活性和MIC，證明其具有很好的廣譜抑菌活性，且對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色葡萄球菌、副溶血性弧菌、假單胞菌和希瓦氏菌的MIC為16 μg/mL，對大腸桿菌和沙門氏菌的MIC為32 μg/mL。這為進一步利用鯽魚魚鱗抗菌多肽在醫藥或食品方面開發天然抗菌藥物、防腐保鮮劑等提供了一定的科研基礎和數據支持。