東北傳統發酵食品中降膽固醇乳酸菌的篩選及其降解機制

任大勇，曲天銘，楊 柳，安 彬，王國超，馮時蓉

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

世界衛生組織預測，2030年心血管疾病仍然是人類的主要死亡原因之一[1]。流行病學研究表明，血清中高于正常水平的膽固醇含量與心血管疾病的發生有著密切的關系[2]。高膽固醇血癥是冠心病以及動脈粥樣硬化等心血管疾病的主要影響因素。臨床研究表明，正常人體中血清膽固醇水平每升高1 mmol，患冠心病的風險將增加35%，而如果其含量每降低1%，患病的概率將會減少2%～3%[3]。目前，對高膽固醇血癥的患者主要使用藥物進行治療，如他汀類藥物等，但是藥物治療仍存在高成本以及副作用等風險[4]。因此，研發安全、高效降膽固醇的功能性食品成為目前研究熱點，這對于預防和輔助治療高膽固醇血癥具有重要的現實意義。

近年來，有研究表明乳酸菌具有較好的降膽固醇作用[5-6]，涉及到多種復雜的降解機制。一般認為，乳酸菌能夠產生膽汁鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH），該酶能夠將膽汁鹽（膽汁酸與甘氨酸或牛磺酸的結合物）在人體肝腸循環中解偶聯[7]成游離的膽酸和氨基酸殘基[8-9]，而游離的膽酸會與膽固醇產生共沉淀從而去除膽固醇。其次，一些熱殺死的益生菌也能夠通過膜吸附的方式從培養基中去除一定量的膽固醇[10-12]。另外，部分益生菌還可以通過抑制腸膽固醇膠束的形成，破碎的膠束不能將脂肪酸運輸到腸黏膜表面進行吸收，從而導致膽固醇含量降低[13]。

東北傳統發酵食品黏面子、辣醬、辣白菜等作為我國東北地區常見的食物同時也是乳酸菌的良好來源[14-15]，近年來對于這些食品菌種資源與功能的研究甚少。本實驗旨在分離出具有高效降解膽固醇能力的乳酸菌，并綜合分析其存在的主要降解機制，為特定功能益生菌的開發與利用提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黏面子、辣醬、辣白菜為黑龍江地區農家自制發酵食品，并保存于吉林農業大學食品科學與工程學院食品毒理與安全實驗室。

MRS瓊脂培養基、MRS肉湯培養基 青島海博生物技術有限公司；巰基乙酸鈉、牛膽鹽、膽固醇 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；氫氧化鉀、正己烷、冰醋酸、濃硫酸、茚三酮試劑（0.5 mL體積分數1%茚三酮在0.5 mol/L pH 5.5檸檬酸鹽緩沖液中，1.2 mL體積分數30%甘油，0.2 mL 0.5 mol/L pH 5.5檸檬酸鹽緩沖液）北京化工廠；甘胺膽酸鈉、牛磺膽酸鈉 上海源葉生物技術有限公司；蛋黃卵磷脂、胰蛋白酶、胃蛋白酶北京索萊寶科技有限公司；RNAiso Plus 寶生物工程（大連）有限公司；FastKing RT Kit（With gDNase）、SYBR Green I熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒、Taq Mix天根生化科技（北京）有限公司；實驗所用引物由庫美公司（中國長春）合成。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD型凈化工作臺 上海新苗醫療器械制造有限公司；WMW-02型電熱恒溫培養箱 湖北省黃石市醫療器械廠；Red-96G型梯度PCR儀 上海山富科學儀器有限公司；OHG-914358-III型島津紫外-可見分光光度計 島津國際貿易（上海）有限公司；DYCZ-24DN電泳儀 北京六一儀器廠；JYP2-II超聲波細胞粉碎機寧波新芝生物科技股份有限公司；Stratagene Mx300p qPCR儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種制備

實驗前，將菌株活化2 次，然后按1∶50（V/V）接種到含100 μg/mL膽固醇的MRS培養基中，37 ℃厭氧培養24 h，用于后續實驗。

1.3.2 降膽固醇乳酸菌的體外篩選

取0.5 mL上述培養液，加入3 mL體積分數95%乙醇溶液和2 mL 0.5 mg/mL氫氧化鉀溶液，振蕩混勻。于60 ℃恒溫水浴10 min，冷卻后加入5 mL正己烷，旋渦振蕩1 min，加入2 mL蒸餾水，振蕩均勻，靜置分層。取上層正己烷，60 ℃氮氣吹干，加入4 mL 0.5 mg/mL鄰苯二甲醛溶液（用冰醋酸定容）和2 mL濃硫酸，顯色反應20 min,于553 nm波長處測定吸光度[16-17]。所有實驗重復5 次。

1.3.3 乳酸菌解離膽汁鹽與膽固醇的共沉淀

新鮮制備的無菌MRS肉湯中補充6 mmol/L甘氨膽酸鈉、6 mmol/L牛磺膽酸鈉或二者的混合物（2.8 mmol/L甘氨膽酸鈉和1.2 mmol/L牛磺膽酸鈉）。膽固醇溶液過濾除菌，并添加到培養基中使其質量濃度為100 μg/mL。以每種菌株1%的水平接種，并在37 ℃厭氧培養24 h。之后，將細胞離心（10 000×g、4 ℃、10 min）。膽固醇含量測定同1.3.2節。共沉淀結果通過培養后與對照組（無膽汁的MRS肉湯）中膽固醇的質量濃度差異確定[18]。所有實驗重復3 次。

1.3.4 乳酸菌BSH的定性測定

將乳酸菌在含有5 mg/L牛磺脫氧膽酸鈉鹽或甘氨膽酸鈉和0.37 g/L氯化鈣的MRS瓊脂平板上生長。平板在厭氧條件下37 ℃培養72 h[18-19]。以菌落產生的不透明暈圈或不透明顆粒狀白色菌落特征表示膽鹽水解酶活性。

1.3.5 乳酸菌BSH的定量測定

通過測定由乳酸菌菌株從膽汁鹽釋放的氨基酸的量測量BSH活性[20]。菌株在MRS肉湯中培養24 h，在4 ℃、10 000×g離心10 min。將細胞沉淀物洗滌2 次，然后懸浮于10 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中。在600 nm波長處將細胞濃度調節至1 個單位的OD值。將5 mL細胞懸液冰浴超聲處理3 min，然后在4 ℃、10 000×g離心10 min。向獲得的0.1 mL適當稀釋的上清液中加入1.8 mL 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 6.0）和0.1 mL結合的膽汁鹽。使用的共軛膽汁是6 mmol/L甘氨膽酸鈉、6 mmol/L牛磺膽酸鈉或6 mmol/L結合膽汁鹽混合物（甘氨膽酸鈉、牛磺膽酸鈉）。混合物在37 ℃溫育2 h。向0.5 mL樣品中加入0.5 mL質量濃度為0.15 mg/mL的三氯乙酸溶液終止酶促反應。將混合物離心分離，將0.2 mL上清液加入到1 mL蒸餾水中，加入1 mL茚三酮試劑（0.5 mL體積分數為1%茚三酮在0.5 mol/L pH 5.5檸檬酸鹽緩沖液中，1.2 mL體積分數為30%甘油，0.2 mL 0.5 mol/L pH 5.5檸檬酸鹽緩沖液）。將制備物渦旋并煮沸45 min。冷卻后，使用甘氨酸或牛磺酸作為標準測定570 nm波長處的吸光度。一個單位的BSH活性定義為每分鐘從底物釋放1 μmol氨基酸的酶量。并通過蛋白定量試劑盒測定蛋白質質量濃度。所有實驗重復3 次。

1.3.6 BSH基因的PCR檢測

BSH具有4 個基因編碼序列[21]，并分別將其命名為bsh1～bsh4。通過參照NCBI數據庫比對，設計了4 對引物進行BSH的基因擴增（表1）。PCR體系為：上下游引物各0.5 μL、模板1 μL、dNTP Mix 2 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、ddH2O 18.2 μL。PCR條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s（bsh2基因退火溫度為53 ℃），72 ℃延伸60 s，35 個循環。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequences of PCR primers used in this study

1.3.7 RT-qPCR檢測4 種bsh基因的表達情況

表2 RT-qPCR引物Table 2 Primer sequences used for RT-qPCR

表3 RT-qPCR體系Table 3 Composition of fluorescent quantitative RT-qPCR system

以植物乳桿菌16S rRNA為內參基因[22-23]，根據NCBI數據庫提供的基因序列分別設計bsh1、bsh2、bsh3、bsh4以及內參基因的引物（表2）。利用Trizol法提取乳酸菌的總RNA。將培養24 h的菌株離心（8 000×g、4 min、4 ℃），去除上清液并用無RNA酶磷酸鹽緩沖溶液洗滌2 次。取沉淀加入250 μL溶菌酶，37 ℃水浴30 min。加入1 mL Trizol裂解液，體積比1∶5的氯仿，12 000×g、4 ℃離心15 min。取上清加入等體積異丙醇混勻靜止后于12 000×g、4 ℃離心10 min獲得RNA沉淀，用體積分數75%乙醇漂洗，晾干。利用FastQuant RT Kit（with gDNase）試劑盒反轉錄合成第1鏈cDNA。利用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒進行實時熒光定量PCR分析，反應體系見表3。反應程序：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循環40 次。熒光定量的結果采用內參基因的ΔCt方法對目的基因的表達量進行分析（n＝3）。目的基因的相對表達量公式為2-ΔCt。

1.3.8 細胞超聲處理對去除膽固醇的影響

通過測定不同培養基條件下菌株對超聲波的耐受性確定膽固醇在細胞膜上的吸附情況。將活化菌株按1∶50（V/V）分別接種至MRS液體培養基、僅含100 μg/mL膽固醇膠束溶液的MRS培養基以及含質量分數0.2%膽鹽和100 μg/mL膽固醇的MRS液體培養基中。培養24 h后，取1 mL菌懸液于冰浴下，130 W、20 kHz、40%超聲破碎10 個循環（15 s/次），采用平板計數法對超聲處理和未經超聲處理的乳酸菌進行計數，計算3 種培養基下菌體經超聲波破碎后的存活率。

1.3.9 細胞熱處理對去除膽固醇的影響

將菌株的過夜培養物接種到10 mL的MRS肉湯中，并在37 ℃孵育24 h，1 800×g離心15 min，收集細胞，用蒸餾水洗滌2 次，再懸浮于10 mL蒸餾水中于121 ℃高壓滅菌15 min以制備熱滅活細胞，以未經熱處理的細胞作為對照。將加熱滅活的細胞懸浮于含有牛磺膽酸鈉的膽固醇MRS肉湯中（pH 6.8）。靜息細胞處理是將它們懸浮于含有0.05 mmol/L牛磺膽酸鈉和膽固醇的磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）。在相同的溫育和離心條件下測定MRS肉湯中膽固醇含量。

1.3.10 抑制膽固醇膠束的形成

將活化后的菌株在4 ℃、12 000×g離心15 min，將細胞沉淀用磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）洗滌2 次，最后再懸浮于緩沖液中，并用緩沖液調節菌株OD600nm值為1。然后將懸浮液離心（3 500×g，15 min），將沉淀重懸于2 mL含有3 mmol/L膽固醇、30 mmol/L牛膽鹽和20 mmol/L卵磷脂的溶液中。補充胰蛋白酶0.1 mg/L并調節pH值至8.0。對照不含乳酸菌。將混合物置于冰浴中超聲處理15 min。將超聲處理的混合物在37 ℃孵育24 h。將混合物以12 000×g離心15 min。收集上清液，在450 nm波長處以磷酸鹽緩沖液作為空白對照測量溶液的透光率[13]。

1.4 統計分析

2 結果與分析

2.1 降膽固醇菌株的體外篩選

前期從發酵食品中分離出120 株乳酸菌，經過16s rRNA鑒定，這些菌株主要分為乳桿菌、明串珠菌和鏈球菌。其中植物乳桿菌82 株，腸膜明串珠菌亞種8 株，清酒乳桿菌5 株，副干酪乳桿菌7 株，還有乳酸鏈球菌、德氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌等。圖1顯示了膽固醇的清除率大于40%的菌株（共57 株，均為植物乳桿菌），其中6 株菌（C1、C2、H6、H9、L22、L30）的清除率高于85%。因此選取這6 株菌進行下一步降解機制的研究，并選取實驗中降解能力最低的菌株T19（清除率為20.7%）作為陰性對照菌株。

圖1 部分菌株對培養基中膽固醇的清除作用（n＝5）Fig. 1 Assimilation of cholesterol in culture medium by selected strains (n = 5)

2.2 膽固醇與解離膽汁鹽共沉淀

表4 膽固醇與解離的甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉共沉淀（n＝3）Table 4 Cholesterol co-precipitation with bile acid derived from sodium glycocholate and sodium taurocholate by Lactobacillus plantarum(n= 3)

表4顯示了在不同的植物乳桿菌環境中，膽固醇與甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉的解離產生膽酸的共沉淀作用。所有菌株均顯示出了對這兩種膽酸鹽及其混合物不同程度的膽固醇共沉淀作用。菌株C2可使膽固醇與甘氨膽酸鈉解離的膽酸產生最高的共沉淀（5.53±0.20）μg/mL，同時C2也在混合膽汁鹽存在的條件下具有最高的膽固醇沉淀能力。但幾乎所有菌株沉淀（除了H9）牛磺膽酸的能力都較低。對照菌株T19沉淀膽酸的能力顯著低于其他菌株（P＜0.05）。

2.3 BSH活性測定結果

圖2 BSH活性檢測Fig. 2 Assay of BSH activity

如圖2所示，在加入膽汁鹽的培養基中明顯觀察到了濾紙片周圍產生了白色不透明的沉淀，表明7 株植物乳桿菌均具有BSH活性。根據產生沉淀圈的大小可粗略的估測出菌株H6具有較高的BSH活性，而陰性對照菌株T19表現出了最小的沉淀圈，說明菌株T19的BSH活性最低。

7 株植物乳桿菌細胞提取物的BSH活性見表5。所有菌株在牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉以及混合膽汁鹽存在的條件下均顯示出了不同程度的BSH活性（0.31～1.73 U/mg）。與牛磺膽酸鈉相比，所有的菌株（除了H9）均顯示出了對甘氨膽酸鈉更高的底物特異性。在甘氨膽酸鈉以及混合膽汁鹽為底物的條件下，菌株H6均具有最高的BSH活性，這與平板法粗測BSH活性實驗結果相符。陰性對照菌株T19的BSH活性顯著低于其他6 株菌（P＜0.05），與2.2節共沉淀效應結果一致，因此推斷菌株間BSH活性的差異可能是造成其膽固醇降解率差異的主要原因之一。

表5 菌株在以甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉為底物時的BSH活性（n＝ 3）Table 5 BSH activity of strains with sodium glycocholate and sodium taurocholate as substrates (n= 3)

2.4 4 種bsh基因PCR檢測結果

使用bsh基因引物通過PCR方法從7 株植物乳桿菌DNA中擴增了4 種基因，命名為bsh1、bsh2、bsh3、bsh4。基因測序及同源性分析表明，4 種基因均屬于植物乳桿菌BSH基因。其中bsh1基因長度為1 048 bp，bsh2基因長度為1 000 bp，bsh3基因長度為956 bp，bsh4基因長度為918 bp。說明包括對照菌株T19在內的7 株植物乳桿菌均存在BSH基因。

圖3 4 種BSH基因的PCR電泳結果Fig. 3 Electrophoresis of PCR amplified products of four bile salt hydrolase genes

2.5 BSH基因的相對表達量

qPCR結果顯示，所有菌株的bsh1基因相對表達量最高（P＜0.05），其次是bsh3和bsh2，而bsh4最低（圖4）。因此，受試菌株的BSH活性可能受bsh1基因表達的影響更大。菌株H6、L22、C2的bsh1表達量高于C1、H9、L30。菌株H6具有最高的表達量4.25×10-3，對照菌株T19表達量最低（1.53×10-3）（P＜0.05），這可能是導致T19菌株BSH活性低的主要原因。

圖4 6 株菌株中4 種BSH基因的相對表達水平（n＝3）Fig. 4 Relative expression levels of four bile salt hydrolase genes in six strains (n = 3)

2.6 超聲處理對膽固醇環境中乳酸菌存活率的影響

超聲處理對乳酸菌存活率的影響與其生長環境中是否存在膽固醇密切相關（表6）。在不含膽固醇的MRS培養基中，7 個菌株的存活率為0.68%～1.52%。在含有膽固醇的MRS培養基中，存活率上升到1.45%～2.65%。在同時含有膽固醇和膽鹽的MRS培養基中，存活率進一步提高至5.6%～21.18%。原因可能是由于膽固醇吸附在乳酸菌細胞膜表面，從而增加了細胞膜的韌性。膽汁鹽作為表面活性劑增加了細胞膜的通透性，使更多的膽固醇吸附在細胞膜表面。因此菌體在超聲處理后的存活率顯著提高。對照組菌株T19在加入膽鹽后的存活率提高不顯著，可能是由于其本身對膽鹽的耐受性較低。

表6 超聲處理對不同培養基中乳酸菌存活率的影響（n＝5）Table 6 Survival rates of cells in various media before and after sonication (n= 5)

2.7 熱處理對乳酸菌去除膽固醇能力的影響

圖5 處于生長、熱處理、靜息狀態下6 株植物乳桿菌的膽固醇清除能力（n＝5）Fig. 5 Cholesterol-scavenging abilities of 6 strains of L. plantarum under growth, heat treatment and resting state (n = 5)

如圖5所示，靜息狀態下的6 株乳酸菌對膽固醇的清除率為18%～45%，熱處理后的菌體仍然具有10%～22%清除率。這說明即使在乳酸菌菌體細胞被破壞的情況下，仍然可以通過破碎的細胞膜吸附環境中的膽固醇。陰性對照組菌株T19與受試的其他6 個菌株情況類似，說明雖然細胞膜起到一定的吸附作用，但這并不是影響這些菌株降解效率的主要因素。

2.8 乳酸菌抑制膽固醇膠束的形成

膽固醇膠束的破壞會導致形成膠束的物質析出，從而使溶液的透光降低[24-25]。乳酸菌在模擬腸道環境條件下抑制膽固醇膠束形成的結果見圖6。與空白對照組相比，加入乳酸菌干預后的膠束溶液，其透光率顯著下降（從73.70%降低到60.51%～66.51%）（P＜0.05），說明乳酸菌破壞了膽固醇膠束的形成。目前已知膽固醇膠束的形成與膽汁鹽、卵磷脂以及膽固醇密切相關[24]。本實驗結果可能是由于乳酸菌細胞膜結合了膽鹽以及膽固醇，從而破壞了膽固醇膠束的形成。

圖6 乳酸桿菌對體外膽固醇膠束形成的影響（n＝3）Fig. 6 Effect of lactobacilli on cholesterol micelle formation in vitro (n = 3)

3 討 論

中國東北的傳統發酵食品作為東北地區居民必不可少的食物[26]，同樣也是分離益生性乳酸菌的主要來源[27]。本實驗從黏面子、辣白菜、辣醬中分離出的乳酸菌品種豐富，其中主要有乳桿菌屬、明串珠菌屬、鏈球菌屬等。本研究從體外評估了分離自上述食物中的乳酸菌的清除膽固醇的能力，其中有57 株菌株具有40%以上的清除率，這些菌株均為植物乳桿菌。期中，菌株C2、H6、L22具有較高的膽固醇清除能力，其清除率均在90%以上，明顯高于之前的文獻報道（30%～75%）[11,13,28]。由于菌株T19的清除率較低（20.7%），故在本研究中將其作為陰性對照菌株闡明優良菌株的降解機制。

本研究結果表明，具有高降解率的菌株會產生高的共沉淀效應，沉淀的膽固醇約占總膽固醇的5.50%左右，且菌株在甘氨膽酸鈉存在的條件下降解作用更高。在混合膽汁鹽的條件下降解效率低于甘氨膽酸鈉條件，原因可能是由于牛磺膽酸鈉的存在會對甘氨膽酸鈉的水解造成一定的影響[18]。實驗結果表明膽固醇的共沉淀低于總清除率的5%，并且最終pH值在3.99～4.31之間，即使將pH值控制在2.0左右的時候，共沉淀效應仍沒有明顯的加強（結果未顯示）。這說明共沉淀不是人體去除膽固醇的主要方式，因為人體腸道中的pH值高于6.0，共沉淀效應很少發生[29]。BSH活性與產生共沉淀效應以及總膽固醇的清除率均有相關性。本研究中，菌株H6在甘氨膽酸鈉為底物時具有最高的BSH活性（3.27±0.43）U/mL。陰性對照組菌株T19在體外膽固醇清除率、BSH活性以及共沉淀方面均顯著低于受試的6 株菌株（P＜0.05），這說明并非所有乳酸菌均具有良好的膽固醇降解能力，降膽固醇能力即使在同一種屬內也具有明顯的菌株特異性。雖然BSH受到多種基因共同調控[30]，但本研究結果表明，bsh1基因的表達最為活躍，推測其在植物乳桿菌BSH合成過程中起到主要作用。為了進一步探究乳酸菌細胞膜對膽固醇是否有吸附作用，本研究采用超聲裂解和熱裂解兩種方式評價了細胞膜裂解產物對膽固醇的吸附作用。結果表明，裂解后的細胞碎片對膽固醇仍有吸附作用，但這種吸附作用低于完整細胞狀態。本研究最后采用模擬人的腸道環境進行了膽固醇膠束的配制，結果表明在乳酸菌存在的情況下，膠束的形成受到了抑制。膽固醇膠束對于脂肪類物質的吸收起到至關重要的作用，因此，抑制膽固醇膠束的形成就可以起到降低膽固醇在腸道內的吸收。

陰性對照菌株T19主要在BSH活性、bsh基因的表達量以及抑制膠束形成方面與其他6 株菌產生了顯著差異（P＜0.05），而在膽固醇吸附實驗中表現的差異不顯著，其原因可能是膠束的抑制作用同樣是通過膜的吸附及BSH作用。因此，雖然植物乳桿菌可以通過多種機制清除膽固醇，但其BSH活性是影響清除固醇能力的主要因素。

4 結 論

從東北傳統發酵食品中分離的植物乳桿菌H6具有最高的清除膽固醇能力，并且降解機制主要通過膽固醇與細胞膜的結合、膽固醇膠束的破壞、膽汁鹽的解離以及BSH活性清除膽固醇，且BSH為主要因素。菌株H6可以作為降低人體膽固醇的潛在后選菌株。后續還需要進行動物實驗進一步確定H6的體內降膽固醇特性。