高效液相色譜-串聯質譜法同時測定番茄中的番茄苷與番茄堿

2019-12-04 02:59:30張新娜潘賽超張旭冬張秀杰張永新張春嬌黃昆侖馬麗艷

食品科學 2019年22期

張新娜，潘賽超，張旭冬，張秀杰，張永新，周昉，張春嬌，黃昆侖,3，馬麗艷,3,*

（1.農業農村部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（北京），北京 100083；2.農業農村部科技發展中心，北京 100045；3.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

糖苷生物堿是植物體內的次生代謝產物，主要分布于茄科和百合科的植物體內[1]。番茄是茄科番茄屬草本植物，番茄苷和番茄堿是番茄化合物中重要的生物活性因子[2]。番茄苷，又名番茄素或番茄苷，是一種含有D-木糖、D-半乳糖及兩分子葡萄糖的糖苷生物堿[3]，番茄堿是番茄苷水解脫糖后形成的糖苷元，其生物活性比番茄苷低[4-5]。番茄苷能夠保護番茄植株在生長過程中免受細菌、真菌、病毒和某些昆蟲的侵害[6-7]，對很多害蟲都有驅拒性，是一種天然的植物源殺蟲劑[8-9]。研究表明，番茄苷具有抗炎[10-11]、抗癌功效[12-13]，對乳腺癌[14]、前列腺癌[15]、結腸癌[16]、肝癌和肺癌[17]等有一定的治療效果。然而，作為一種甾體生物堿，番茄苷會造成小鼠胚胎畸形或顱面畸形等[18-21]，對人的胃腸道也有刺激作用，具有一定的神經毒性[22-23]，大量食用后會出現頭暈、惡心、嘔吐和乏力等癥狀。

番茄中生物堿的檢測方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法、免疫測定法、高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法等。利用HPLC法進行分析時，可采用紫外檢測器、脈沖安培檢測器，示差檢測器等進行測定[24-28]。紫外檢測器易受到其他物質的干擾，檢出限高于脈沖安培檢測器。利用GC-MS法進行分析時，不能對番茄苷直接進行測量，而是要先將其水解成相應的糖苷并衍生后才能進行測量，增加了操作的復雜性[4,29]。免疫測定法需要檢測樣品有相當高的純度，Barbour等[30]用免疫測定法測定番茄苷時發現，該方法對于分析糖苷生物堿呈現的是一種非線性關系。此外分光光度檢測法[31]、放射配體檢測法[32]也可用于番茄苷的檢測。分光光度檢測法容易受到提取物中雜質和有色物的影響，放射配體檢測法不需要對沉淀物進行純化，能夠檢測出溶液中與膽固醇相結合的番茄苷的含量[33]。HPLC-MS/MS具有高選擇性和靈敏度，在番茄堿的分析中應用越來越廣泛，目前對番茄苷的檢測多采用選擇離子監測的模式[34-36]，番茄苷和番茄堿同時測定的報道較少。

目前，對番茄中番茄堿的含量測定的報道較少，有研究表明番茄在成熟過程中，番茄苷的含量逐漸降低，正常成熟的番茄中番茄堿的含量較低，一般不會引起中毒[4]。但在番茄生產、銷售過程中，部分生產者為了方便運輸，會提前采收，利用藥物對番茄進行催熟，尤其是在反季節上市的番茄，這種現象更為普遍。為監測番茄中番茄堿的含量水平，保護消費者身體健康，迫切需要建立番茄中番茄苷和番茄堿的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸（均色譜純），冰乙酸、乙酸銨（均為分析純），番茄堿（C27H45NO2，CAS號：77-59-8，純度98%）、番茄苷（C50H83NO21，CAS號：17406-45-0，純度98%）北京百靈威科技有限公司；C18固相萃取柱（500 mg，6 mL）安捷倫科技（中國）有限公司；超純水由Millpore純水儀制備。

1.2 儀器與設備

6460型HPLC-MS/MS儀、固相萃取裝置美國安捷倫科技有限公司；IKA T25高速勻漿機北京德泉興業商貿有限公司；VORTEX-5渦旋振蕩器海門市其林貝爾儀器制造有限公司；YP5002電子天平上海越平科學儀器有限公司；HC-3018離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

番茄采自北京昌平蔬菜生產基地，樣品制成勻漿后，-18 ℃冰箱保存。

1.3.2 提取

稱取番茄樣品5.00 g置于燒杯中，加入10%乙酸溶液20.0 mL，勻漿提取2 min，轉移至離心管中，8 000 r/min離心5 min，上清液用提取液定容至25 mL，待凈化。

1.3.3 凈化

采用C18固相萃取柱凈化。先用5 mL甲醇活化，5 mL 10%乙酸溶液平衡，準確吸取5 mL上清液上柱，5 mL 15%甲醇溶液淋洗，抽干2 min，用5 mL含1%甲酸的90%甲醇溶液洗脫。洗脫液用水稀釋1 倍后過0.22 μm微孔濾膜，上機檢測。

1.3.4 液相色譜條件

色譜柱：Proshell 120 EC-C18（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；柱溫30 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量3 μL；流動相A為5 mmol/L乙酸銨（含0.05%甲酸）溶液；流動相B為乙腈；梯度洗脫程序：30% B保持2 min，5 min后變為80% B，6 min后變為30% A，保持7 min。

1.3.5 質譜條件

離子化模式：電噴霧離子源，正模式；毛細管電壓3 500 V；干燥氣流速10 mL/min；干燥氣溫度350 ℃；霧化器壓力35 psi；鞘氣溫度400 ℃；鞘氣流速11 mL/min。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

分別在正、負離子模式下對番茄堿和番茄苷標準溶液進行母離子掃描，設置掃描范圍在300～1 200 u之間，結果表明2 種化合物均在正離子模式下響應較高。確定母離子和掃描模式后，對鞘氣溫度、干燥氣溫度、碎裂電壓、子離子及碰撞能量進行優化。結果表明干燥氣溫度對2 種化合物的響應無明顯影響，而隨著鞘氣溫度的升高，番茄苷的響應有明顯的提高。通過優化，方法設置干燥氣溫度為350 ℃，鞘氣溫度為400 ℃。

番茄苷的相對分子質量為1 033，相對較大，雖然采用離子掃描的方式能對番茄苷的含量進行分析[36]，但參照2002/657/EC中的相關規定，利用HPLC-MS/MS進行確證時需提供一個母離子，2 個子離子的信息。實驗經過優化，確定了番茄苷和番茄堿的多反應監測參數，見表1。

表1 番茄堿和番茄苷多反應監測參數Table 1 Multiple reaction monitoring parameters of tomatine and tomatidine

2.2 色譜條件優化

2.2.1 流動相組成優化

實驗分別比較了0.1%甲酸-甲醇溶液、0.1%甲酸-乙腈溶液、0.1%乙酸-乙腈溶液、5 mmol/L乙酸銨-乙腈溶液、5 mmol/L甲酸銨-乙腈溶液組成的流動相體系對番茄苷和番茄堿分離效果及響應值的影響，結果表明不同流動相組成體系均能將2 種化合物進行分離，乙腈的流動相體系響應值高于甲醇體系，甲酸優于乙酸，乙酸銨優于甲酸銨。添加銨鹽后，2 種化合物的保留時間有不同程度的延長。優化結果表明甲酸對番茄苷的響應值有抑制作用，乙酸銨對番茄苷的響應有明顯增強作用；而使用乙酸銨后番茄堿的響應值和重復性變差。考慮到同時檢測番茄中2 種主要的生物堿，實驗采用乙酸銨-乙腈體系，并在5 mmol/L乙酸銨溶液中加入了0.05%的甲酸，番茄苷和番茄堿即能良好的分離，也有較高的靈敏度和重復性。

2.2.2 色譜柱選擇

圖1 標準溶液中番茄苷和番茄堿總離子流圖和提取離子色譜圖Fig. 1 Total ion current and extracted ion chromatograms of tomatine and tomatidine standards

分別比較Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）、Poroshell 120 C18（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）和SB C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）3 種不同型號的色譜柱對番茄苷和番茄堿分離效果及響應值的影響，結果表明Poroshell 120 C18色譜柱的分離效果和響應值最好，其次是SB C18色譜柱，實驗最終選擇Poroshell 120 C18色譜柱。結果如圖1、2所示。

圖2 樣品提取液中番茄苷和番茄堿總離子流圖和離子提取色譜圖Fig. 2 Total ion current and extracted ion chromatograms of tomatine and tomatidine in tomato extract

2.3 提取方法優化

2.3.1 提取溶劑優化

圖3 提取溶劑對番茄苷和番茄堿的提取效果Fig. 3 Effect of extraction solvents on the recovery of tomatine and tomatidine

參考已有相關文獻報道[24,27,29,34]，實驗采用1%乙酸溶液、5%乙酸溶液、10%乙酸溶液、85%乙醇溶液及100%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶5（g/mL），超聲提取2 次，每次30 min。以乙酸溶液為提取溶劑直接進行凈化處理，含有機溶劑的提取液去除有機溶劑后進行凈化。

從圖3可以看出，從1%乙酸溶液到10%乙酸溶液提取時，番茄苷含量無明顯差異，但番茄堿含量隨著乙酸溶液體積分數的增加，提取效率有增加。以100%乙醇為提取溶劑的提取效果低于85%乙醇溶液的提取效果。雖然85%乙醇溶液與10%乙酸溶液的提取效果無明顯差異，也有良好的提取效果，但該方法適合于番茄堿粗提物的提取制備[34,36]，對番茄樣品中番茄苷、番茄堿含量進行分析時需要去除大量有機溶劑后才能進行凈化處理，增加了分析的步驟，實驗最終選擇10%乙酸溶液作為提取溶劑。

2.3.2 提取方式優化

實驗以10%乙酸溶液為提取劑，料液比1∶10，分別比較超聲、攪拌和勻漿3 種提取方式的提取效果，其中超聲提取的時間為30 min[36]，攪拌提取時間為2 h[27]，勻漿提取時間為3 min，結果見圖4。

圖4 提取方式對提取效果的影響Fig. 4 Effect of extraction methods on the recovery of tomatine and tomatidine

目前番茄中生物堿的提取方式多采用超聲提取法[29,36]，但從圖4可以看出，3 種提取方式中，超聲的提取效果最差。攪拌提取[27]雖然與勻漿提取無明顯差異，但提取時間相對較長，實驗最終選擇勻漿提取方式。

2.3.3 提取時間、料液比優化

實驗以勻漿提取方式，分別比較了勻漿1、2 min和3 min的提取效果，結果發現三者無明顯差異，為保障提取完全，實驗選擇勻漿提取時間為2 min。實驗比較了料液比為1∶3、1∶4、1∶10（g/mL）的提取效果，結果發現三者無明顯差異，考慮操作方便性和溶劑的消耗情況，實驗選擇料液比為1∶4。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性范圍

將番茄苷配制成質量濃度為50、100、250、500 ng/mL和1 000 ng/mL標準工作溶液，番茄堿配制成質量濃度為5、10、25、50、100 ng/mL標準工作溶液，按已建立測定條件進行分析，以質量濃度為橫坐標，定量離子峰面積為縱坐標繪制標準曲線。番茄苷的線性方程為y=422.37x＋9 905.6，相關系數為0.999 1；番茄堿的線性方程為y=66 213x-113 318，相關系數為0.999 4，2 種化合物線性方程良好，相關系數均大于0.99，滿足定性檢測方法的要求。

2.4.2 方法的準確度和精密度結果

方法的準確度采用添加回收實驗進行。分別向番茄樣品中添加番茄堿及番茄苷標準溶液，使番茄苷的添加量分別為5.00、10.0 mg/kg和20.0 mg/kg，番茄堿的添加量分別為50、100 μg/kg和200 μg/kg，按建立的方法進行提取、凈化和分析，添加回收率和精密度結果見表2。

表2 添加回收測定結果（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of tomatine and tomatidine (n= 6)

從表2可以看出，番茄苷回收率在86.0%～92.0%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在2.3%～6.8%之間；番茄堿添加回收率在85.6%～105%之間，RSD在1.0%～6.1%之間，能滿足測定的需要。以10 倍信噪比計算，番茄苷的檢出限為1.0 μg/kg，番茄堿的檢出限為0.10 μg/kg。

2.4.3 基質效應評價

分別用溶劑和番茄基質配制相同質量濃度的標準工作液，進行色譜-質譜分析，計算基質效應。基質效應/%=（基質標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率-1）×100[37]。利用HPLC-MS/MS進行分析時，由于有共流出組分的存在，會影響離子化效率，當基質效應為-20.0%～20.0%、-50.0%～-20.0%和20.0%～50.0%、小于-50.0%和大于50.0%時，分別表示輕微、中等、較強的基質效應[38]。可以通過改善色譜分離條件、對樣品進行凈化、基質配制標準曲線等方式減少基質對分析的影響。本實驗出現結果表明，番茄苷的基質效應為4.5%，番茄堿的基質效應為2.8%，均小于20%，基質效應較弱，因此可以用溶劑配制標準溶液進行樣品的定量分析。

2.5 樣品測定

2.5.1 樣品含量測定

采用本實驗建立的方法，對來自北京昌平番茄生產基地的樣品進行檢測，部分樣品檢測結果見表3。

表3 番茄樣品檢測結果Table 3 Contents of tomatine and tomatidine in tomatoes determined by the developed method

從表3可以看出，大番茄中番茄苷含量在6.06～37.54 mg/kg之間，番茄堿含量在0.18～25.54 μg/kg之間；櫻桃番茄中番茄苷含量在0.11～35.58 mg/kg之間，番茄堿含量在0.13～9.86 μg/kg之間。無論是大番茄還是櫻桃番茄中番茄苷的含量均明顯高于番茄堿，表明番茄生物堿主要是以糖苷生物堿的形式存在。番茄苷的生物活性高于番茄堿[4-5]，研究番茄中番茄苷的含量變化對保障食用安全有重要的意義。

2.5.2 成熟過程中番茄苷含量變化

選擇3 個不同品種的番茄，研究其在青熟期、轉色期、半熟期和完熟期等不同生長過程中番茄苷含量的變化規律。由圖5可以看出，3 個品種的番茄：壽研、浙粉、紅寶石在成熟過程中均呈現出下降趨勢，青熟期到半熟期下降速度較快，半熟期后下降趨于平緩，這與陶永霞等[24]報道一致。