蛹蟲草新型黃色素結構的初步鑒定及響應面優化提取工藝

唐鴻標，陳楚欣，林俊芳,*，婁海偉，葉志偉，郭麗瓊,*

（1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.廣東省微生態制劑工程技術研究中心，廣東 廣州 510642）

蛹蟲草（Cordyceps militaris），屬子囊菌門（Ascomycota）昆蟲寄生真菌[1]，在我國被廣泛用作民間醫藥或功能性食品[2]。蛹蟲草子實體的活性成分含量高，如蟲草多糖、總氨基酸、腺苷、蟲草素等，因此常被用作冬蟲夏草的替代品[3-4]。蛹蟲草具有多種藥理功能，如抗藥性、炎癥、抑制腫瘤和癌細胞生長[5]、增強動物和人的免疫力[6]、抗衰老、抗氧化[7-8]、抗凝血、降血糖[9-10]等。

在傳統人工培養過程中，光照被用于刺激蛹蟲草原基的形成和子實體的分化[11-12]。在固體培養基發酵培養條件下，當暴露于充足光照下，菌絲的顏色將從白色變為黃色[13-14]。隨著光照培養的繼續進行，蛹蟲草子實體繼續分化，蟲草色素持續積累[15-16]。在光合作用植物、藻類和大型真菌的生長過程中，各種色素在協調生物體的正常發育和生長方面發揮著各種作用[17]。如葉綠素吸收光能并將其轉化為化學能，為細胞生長提供能量[18]；類胡蘿卜素淬滅由光產生的氧自由基并保護細胞組織[19-20]。因此，為了研究蛹蟲草黃色素在蛹蟲草發育過程中的重要作用，必須先對蛹蟲草黃色素的種類進行鑒定及歸類。

付鳴佳[21]在蛹蟲草中發現類胡蘿卜素。有研究在蛹蟲草中發現了玉米黃素[22]和葉黃素[23]，并成功鑒定出4 種新型的水溶性北蟲草黃素[24]。除了蛹蟲草黃色素，多種蟲草屬真菌也都各具有色素。在雙棱孢蟲草（Cordyceps bifusispora）中發現一種新型黃色素[25]，從冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）的發酵液中分離出黑色素[26]，單側蟲草（Cordyceps unilateralis BCC 1869）中發現了萘醌[27]。

本實驗通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對蛹蟲草黃色素進行分離純化，并結合質譜法、紫外-可見光譜法、傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，FTIR）光譜法對純化素色進行結構鑒定。同時，采用響應面法對蛹蟲草黃色素提取工藝進行優化，為其日后的生產和綜合開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草（C. militaris CM 19）保藏于華南農業大學食品學院生物煉制實驗室；CM 19子實體購買自廣東省江門市鴻豪生物科技有限公司。

甲酸、乙腈均為色譜純，其他提取用有機溶劑均為分析純，購自成碩化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

An UV2310II紫外分光光度計 中國杭州奧盛儀器有限公司；RV8旋轉蒸發儀 德國IKA公司；FD-1D-50冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；Synapt G2-Si液相色譜-質譜聯用儀 美國Waters公司；LC-2030 HPLC儀 日本島津公司；Vertex 70 FTIR光譜儀德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 蛹蟲草新型黃色素種類鑒定

1.3.1.1 提取溶劑的確定

蛹蟲草子實體經冷凍干燥、粉碎、過60 目篩備用。取子實體粉末1.0 g，加入20.0 mL不同溶劑（丙酮、乙醚、石油醚、水、甲醇、乙醇、50%甲醇和50%乙醇），充分振蕩2 min，室溫浸提30 min，8 000×g離心10 min，取上清液觀察。

1.3.1.2 黃色素提取液的分離純化

樣品的制備：取1.3.1.1節中50%乙醇提取液，過0.22 μm微孔濾膜后，供HPLC分析。

HPLC檢測條件：GL Inertsil C18ODS-SP色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫40 ℃，流速1 mL/min，進樣量20 μL。洗脫程序為：A相為0.1%甲酸溶液，B相為0.1%甲酸-乙腈溶液（0 min， 45% B；1 min，45% B；8 min，48% B；9 min，45% B；14.21 min，停止）。采用二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD），檢測波長為449 nm。在此基礎上，利用制備型HPLC對各峰進行收集。

1.3.1.3 純化色素的HRMS與FTIR分析

高分辨質譜（high resolution mass spectrometry，HRMS）檢測條件：電噴霧離子源，負離子模式；DAD檢測波長200～800 nm，干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速750 L/h；毛細管電壓2.5 kV；質量掃描范圍m/z 100～1 000。

FTIR檢測條件：采用溴化鉀壓片法，按照1∶100的比例加入純化黃色素樣品和溴化鉀，研磨均勻后壓片，在500～4 000 cm-1范圍內測定紅外光譜。

1.3.2 純化黃色素標準曲線的繪制及提取量的計算

標準溶液的制備：取5.0 mg純化色素，加入1.0 mL二甲基亞砜，充分溶解后過0.22 μm微孔濾膜，再用色譜純乙腈稀釋成不同質量濃度（0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL），以1.3.1.2節方法進行HPLC分析，得到標準曲線Y=80 411X-3 830.9，R2=0.999 4。Y為純化色素峰積分面積，X為純化色素質量濃度（μg/mL）。蛹蟲草純化色素提取量按下式計算：

式中：m0為用標準曲線測定得到的純化色素質量/μg；M0為蛹蟲草子實體質量/g。

1.3.3 單因素試驗

分別以甲醇、乙醇溶液體積分數（0%、20%、40%、60%、80%、100%）、提取溫度（4、16、25、40、50、60、70、80 ℃）、料液比（1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL））、提取時間（15、30、45、60、90、120、160 min）為影響因素進行單因素試驗，考察各因素對純化色素提取量的影響。

1.3.4 響應面試驗設計

以純化色素提取量為響應值，根據單因素試驗結果，采用Box-Behnken試驗設計原理，選擇乙醇溶液體積分數、提取溫度和提取時間3 個因素，共17 個試驗點的響應面分析試驗，確定最佳提取工藝。每一變量的低、中、高水平分別以-1、0、1編碼，試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of factors used in Box-Behnken design

1.4 數據處理

采用Design-Expert V8.0.6軟件進行響應面Box-Behnken試驗設計，采用GraphPad Prism 7軟件對數據進行整理統計分析，各項指標結果以表示（n=6），采用Tukey’s Multiple Comparison Test進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的比較

圖1 不同提取溶劑的比較Fig. 1 Comparison of extraction efficiencies of yellow pigment with different solvents

如圖1所示，蛹蟲草黃色素能較好地溶解于水（圖1H）、甲醇（圖1E）溶劑，以及水分別與甲醇、乙醇的混合液（圖1G、1F）。其微溶于乙醇（圖1D）、丙酮（圖1C）溶劑，在乙醚（圖1B）、石油醚（圖1A）中溶解性極差，說明水等強極性溶劑的提取效果明顯優于石油醚等弱極性有機溶劑。根據相似相溶原理，說明蛹蟲草黃色素是一類極性較大的化合物[28]。

2.2 HPLC、HRMS分析結果

為了進一步了解從蛹蟲草中獲得的色素種類，采用HPLC分離純化蛹蟲草粗提物，結果顯示蛹蟲草黃色素有9 個主要峰（圖2A），各峰的分離度均大于1.5，說明通過反相C18柱可以實現蛹蟲草黃色素的有效分離。同時，對第5號峰（保留時間為5.562 min）進行HRMS與全波長掃描測試，結果表明，純化色素5準分子離子峰為m/z262.108 6 [M-H]-（圖2B），并推測其分子式為C14H17N1O4。全波長掃描結果顯示，純化色素5在278、449 nm和477 nm波長處檢測到最大吸收波長（圖2C），表明該色素具有與類胡蘿卜素結構相似的不飽和共軛體系[29]。

圖2 HPLC、HRMS譜圖Fig. 2 HPLC chromatogram and HRMS spectra

2.3 FTIR分析結果

圖3 純化色素5 FTIR光譜圖Fig. 3 FTIR spectra of purified pigment 5

如圖3所示，純化色素5在3 384 cm-1處產生吸收，結合MS結果，氮規則表明該化合物有奇數個N原子存在，故推測此處為仲胺（R—N—H）伸縮振動。樣品在3 303 cm-1處有強的寬帶（R—O—H伸縮）振動吸收，并且在1 078、1 145 cm-1和1 175 cm-1處有較強的（C—O單鍵）振動吸收，在1 695 cm-1和1 565 cm-1處產生強的（C＝C）伸縮振動，在876 cm-1處產生（C—H）面外扭擺振動吸收，表明純化色素5具有與類胡蘿卜素相似的紅外吸收特征[30]。同時，根據純化色素5具有不飽和共軛多烯結構的特點，將該色素命名為蟲草烯。

為了最終確定蟲草烯的分子結構和立體結構，需結合核磁共振波譜法和單晶衍射技術對蟲草烯進一步分析。同時，鑒于蟲草烯具有與類胡蘿卜素相似的紫外、紅外吸收特征，蟲草烯在抗氧化、抗衰老方面的藥用價值也值得進一步研究。

2.4 單因素試驗結果

2.4.1 甲醇、乙醇溶液體積分數對蟲草烯提取量的影響

圖4 甲醇、乙醇溶液體積分數對蟲草烯提取量的影響Fig. 4 Effects of methanol and ethanol concentration on the extraction efficiency of cordycepene

在提取溫度25 ℃、料液比1∶20、提取時間30 min條件下，測定不同體積分數甲醇和乙醇溶液對蟲草烯提取量的影響。由圖4可知，當甲醇、乙醇溶液體積分數為60%，蟲草烯提取量最大，分別為（903.13±42.21）μg/g和（1 145.04±59.13）μg/g。再增加體積分數時，由于子實體粉末中脂溶性物質的溶出增加，從未減少蟲草烯的溶解，提取量呈現下降趨勢[31]。同時，由于甲醇具有一定毒性，不適宜應用于食品工業生產，所以選擇60%乙醇溶液作為最佳提取溶劑。

2.4.2 提取溫度對蟲草烯提取量的影響

圖5 提取溫度對蟲草烯提取量的影響Fig. 5 Effect of extraction temperatures on the extraction efficiency of cordycepene

在提取溶劑60%乙醇溶液、料液比1∶20、提取時間30 min條件下，測定不同提取溫度對蟲草烯提取量的影響。由圖5可知，在較低溫度范圍內，隨著提取溫度的升高，增加了水分子的動能，促進了擴散運動的進

行[32]，蟲草烯提取量不斷增加，在40 ℃時提取量達到最大值（1 277.15±57.78） μg/g。超過40 ℃后，高溫破壞蟲草烯的結構穩定性，導致蟲草烯碳鏈分解，失去原有的光學性質，蟲草烯提取量呈現較快的下降。因此，在單因素優化試驗過程中，始終保持提取環節在40 ℃以下的工作環境中進行。

2.4.3 料液比對蟲草烯提取量的影響

圖6 料液比對蟲草烯提取量的影響Fig. 6 Effect of solid to solvent ratio on the extraction efficiency of cordycepene

在提取溶劑60%乙醇溶液、提取溫度40 ℃、提取時間30 min條件下，測定不同料液比對蟲草烯提取量的影響。由圖6可知，蟲草烯提取量隨料液比的增加，呈現先增加后穩定的趨勢。當料液比為1∶20時，提取量達到（1 489.71±50.01）μg/g。這一現象符合質量傳遞原則，當提取溶劑使用量比較大時，較大的濃度差會促使傳質推動力增加，使傳質速率增大，從而提高提取量[33-34]。再增大料液比，提取量的增加不明顯，表明溶劑已將有效成分基本溶出完全。同時，過大的料液比會造成溶劑和能源的浪費，不利于后期濃縮工作的進行。因此，選擇1∶20作為最佳的料液比，繼續進行優化實驗。

2.4.4 提取時間對蟲草烯提取量的影響

圖7 提取時間對蟲草烯提取量的影響Fig. 7 Effect of extraction time on the extraction efficiency of cordycepene

在提取溶劑60%乙醇溶液、提取溫度40 ℃、料液比1∶20條件下，測定不同提取時間對蟲草烯提取量的影響。由圖7可知，隨著提取時間的延長，蟲草烯提取量不斷增加，當時間超過45 min，提取量趨于降低。提取45 min時，提取溶劑中蟲草烯提取量趨向飽和狀態，提取量達到（1 915.95±65.98）μg/g，時間不再成為影響提取量的重要因素。但隨著提取時間的延長，40 ℃乙醇容易混發，減少的乙醇導致提取量緩慢降低[35-36]。

2.5 響應面試驗設計與結果

2.5.1 響應面試驗結果與回歸方程擬合

利用Design-Expert V8.0.6軟件，對實驗結果進行多項式回歸分析，結果見表2。經擬合回歸，得到綜合得率Y對自變量A、B、C的回歸方程Y=2 212.08-438.49A＋152.21B＋179.90C＋60.57AB-112.06AC＋5.91BC-967.37A2-248.90B2-317.68C2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken design in terms of coded values with response variable

2.5.2 響應面模型方差及可行度分析

表3 回歸模型方差及可信度分析Table 3 Analysis of variance and reliability of regression model

由表3可知，此模型P值小于0.01，表明回歸模型達到極顯著水平。失擬項P=0.125 4＞0.05，模型失擬度不顯著，模型相關系數R2為0.983 3，校正決定系數R2Adj為0.961 8表明此模型擬合優度好，實驗誤差小，可用該模型分析和預測各因素對蛹蟲草蟲草烯提取量的影響[37-38]。在一次項中，乙醇溶液體積分數、提取時間對蛹蟲草蟲草烯提取量的影響極顯著；提取溫度對蟲草烯提取量的影響顯著。各因素顯著性程度依次為乙醇溶液體積分數＞提取時間＞提取溫度。

2.5.3 交互作用分析結果

圖8 各因素交互作用對蟲草烯提取量影響的響應面圖Fig. 8 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on cordycepene extraction

由圖8可知，蟲草烯提取量隨著乙醇溶液體積分數、提取溫度、提取時間的增大呈現先增大后減少的趨勢，說明該模型具有極大值。響應面的陡峭程度隨乙醇溶液體積分數、提取時間的變化起伏較大，說明乙醇溶液體積分數、提取時間對蟲草烯提取量的影響大于提取溫度。以上分析與表3的方差分析結論一致。

2.5.4 工藝參數優化驗證結果

表4 提取次數對蟲草烯提取率的影響Table 4 Effect of number of extraction cycles on the extraction yield of cordycepene

通過軟件求解回歸方程，最佳蛹蟲草蟲草烯提取條件為乙醇溶液體積分數57.68%、提取溫度44.40 ℃、提取時間52.44 min，預測蟲草烯提取量可達到2 299.61 μg/g。在此條件下，測定實際蛹蟲草黃色素得率為（2 259.23±83.88）μg/g（表4），與預測值相近，偏差較小，證明了該方程的準確性和實用性。同時，在最佳提取條件下，進行多次提取，確定提取級數和蟲草烯在子實體粉末中的最終含量。蟲草烯提取量隨著提取次數的增加而增大，當提取級數達到第7次時，HPLC已經檢測不到蟲草烯的存在，此時蛹蟲草子實體中蟲草烯提取量為（2 780.97±170.38）μg/g（表4）。當提取級數達到第3次時，蟲草烯提取率已達到99.88%（表4），為了節省提取時間和減少提取溶劑的使用，故確定提取級數為3 級[39-40]。

3 結 論

本實驗利用HPLC、質譜與FTIR相結合的方法，發現一種新型的蛹蟲草黃色素，推測其分子結構式為C14H17N1O4。該色素具有與類胡蘿卜素相似的紫外-可見光和紅外吸收特征，表明該色素具有不飽和共軛多烯結構的特點，故將其命名為蟲草烯。

響應面試驗結果顯示，各因素對蟲草烯提取量的顯著性程度依次為乙醇溶液體積分數＞提取時間＞提取溫度，確定蟲草烯最佳提取工藝條件為乙醇溶液體積分數57.68%、提取溫度44.40 ℃、提取時間52.44 min，實際測定蟲草烯提取量為（2 259.23±83.88）μg/g。提取級數確定為3 級，此時蟲草烯提取率可達99.88%，含量為（2 777.72±170.46）μg/g（表4）。