HP-HA-肝ECM水凝膠制備及細胞相容性研究

董嬌 張霓霓 姚禮 張立剛 王明雪 王帥 黃桂林

舍格倫綜合癥、頭頸部惡性腫瘤放射治療常常導致涎腺分泌功能障礙，嚴重影響患者的生活質量［1］。組織工程學方法再生涎腺能重建腺泡、導管結構，恢復涎腺受損的分泌功能，是目前較有前景的治療方法［2］。生物材料［3-4］作為其重要組成部分，成為目前的研究熱點。人工合成材料因為缺少生物活性成分，多為“惰性”界面，不能取得良好的再生效果。相比而言，天然組織來源的細胞外基質是優良的組織工程支架材料。涎腺和肝臟同屬于外分泌腺體，而且在胚層發育上同屬于外胚層來源，具有胚層來源相關性［5］，肝臟ECM亦是理想的組織工程天然支架來源。肝素-透明質酸水凝膠是廣泛應用于組織工程領域的一種支架載體，具有緩釋生長因子［6］、具有生物活性、促進三維培養［7］等諸多優點。大量研究表明，用改良方法制備的肝素-透明質酸-肝臟細胞外基質水凝膠（HP-HA-肝ECM水凝膠）有利于組織再生［8］；但是該HP-HA-肝ECM水凝膠在涎腺再生中的作用尚未見報道。目前，組織工程化涎腺類器官研究存在的問題是：缺少具有生物活性成分、具有緩釋作用的生物支架材料，因而不能為組織工程化涎腺類器官三維培養提供良好微環境。所以，本研究希望采用與之類似的改良方法制作一種HP-HA-肝ECM水凝膠，尋找到一種具有生物活性、能緩釋生長因子、能夠自組裝和三維培養的生物支架材料，為后續三維構建組織工程化涎腺類器官的研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

動物來源8周齡20只雌、雄性SD大鼠由第三軍醫大學動物中心提供，雌鼠平均體重250 g，雄鼠平均體重300 g，動物許可證號：SCXK（渝）2012-0005，成年雌雄性大鼠交配后生產，按醫學倫理學中對動物處置的標準進行相關操作。

1.2 試劑和儀器

DMEM／F12（SH30023.01B，Hyclone，美國）；胎牛血清 （16000-044，Gibco，美國）；表皮生長因子（E5036）、胰島素（91077C）、氫化可的松（614157）、轉化生長因子、胃蛋白酶（P6887）（T9580，Sigma，美國）；CK7抗鼠單克隆抗體（Aab181598）、α-淀粉酶抗鼠多克隆抗體（ab125230）、Alexa Fluor?488熒光二抗（ab150077，Abcam，英國）；臺式凍干機（VirTis，Bench-TopPro，美國），NuncTMLab-TekTMChamber Slide System（177445PK）、酶聯免疫檢測（1500，Thermo，美國）。

1.3 制備HP-HA-肝ECM水凝膠

無菌條件下切取健康大鼠肝臟，PBS液洗凈血液，-80℃冰凍保存48 h。復溫解凍，挑選質地勻稱的部位，剪成1 cm3小塊后用500 ml ddH2O，200 r／min震蕩沖洗3 d，每天更換液體3次。再用2%TritonX-100沖洗4 d，每天更換2次液體。最后用ddH2O沖洗2 d，4℃冰箱保存。用HE染色及DAPI染色法鑒定大鼠肝臟ECM脫細胞的效果。凍干處理肝ECM 48 h后，冰凍球磨儀研磨，100 mg肝臟ECM粉末用1%胃蛋白酶溶液消化溶解48 h，3 000 r／min離心15 min，反復離心3次至上清液清澈，將得到的膠狀混合物（即肝ECM成分）用0.22μm過濾器過濾，紫外線消毒，4℃保存。在室溫下用雙蒸水完全溶解Heprasil、Gelin-S、Extralink粉末形成2%、2%、4%溶液，2 h內以2∶2∶1比例充分混合，加入1／10比例的膠狀肝ECM成分，充分混勻，30 min內完全成為凝膠狀態。

1.4 下頜下腺細胞培養及分組

處死新生1 d的SD大鼠后，無菌條件下切取其下頜下腺腺體組織并保留部分導管，PBS液清洗，剝離周圍纖維組織；將腺體剪切成3 mm3小塊，PBS液清洗，以50塊／瓶接種到用1%明膠包被的T25培養瓶，5%CO2、37℃孵育箱中培養4 h，待組織塊完全貼壁后，再加入2 ml完全培養基；3 d后，查看組織塊四周有無細胞爬出并貼壁，每2 d換液1次，控制胰酶消化時間法去除成纖維細胞，至貼壁達80%時以1∶2的比例傳代，取第2代細胞用于后續步驟的檢測。下頜下腺細胞接種于HP-HA-肝ECM水凝膠上為實驗組，直接培養于96孔板或48孔板中為對照組。

1.5 免疫學方法鑒定α-淀粉酶及CK7的表達

免疫熒光化學方法鑒定α-淀粉酶的表達，免疫細胞化學方法鑒定CK7表達。以PBS液為陰性對照組。熒光顯微鏡及倒置相差顯微鏡保留影像學資料。

1.6 細胞毒性試驗

包被組將100μl第2代大鼠下頜下腺細胞懸液滴加至包被膠表面并孵育4 h（37℃，5%CO2），待細胞貼壁后，用PBS液輕輕沖洗3次，洗去未貼壁及死亡的細胞，然后再次在每孔中加入HP-HA-肝ECM水凝膠，室溫下交聯1 h，在每孔中加入100μl完全培養基覆蓋膠體表面，置于37℃的5%CO2培養箱中培養，每2 d換液1次。不包被組為對照組，細胞直接接種于96孔板中。每組設置5個平行孔，分別在培養的第1、3、5、7天時每孔加入20μl的CCK-8溶液，孵育4 h后，于酶標儀上測定A＝490 nm時每孔的吸光度值，記錄并比較。

1.7 細胞活力實驗

同上述方法進行48孔板的包被、細胞的消化、接種、分組及培養。在培養的第1、3、5、7天，利用Live／Dead細胞染色法評估細胞存活情況。簡述如下：等量的活、死細胞染色試劑均勻混合獲得2×的Live／Dead染色母液，PBS液1∶1比例稀釋獲得Live／Dead工作液，吸棄原培養基，PBS液沖洗1次，加入染色劑后于室溫下孵育15 min，因為膠體較厚，實驗組孵育時間可延長至45 min。于熒光顯微鏡下拍照并比較。共重復3次。每次每組設置3個培養孔，拍照時每個培養孔以同樣放大倍數隨機選取3個不同視野分別拍照。計算死細胞比率。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 大鼠肝臟ECM的HE及DAPI染色

脫細胞處理前，HE切片中細胞核藍紫色、形態圓潤，DAPI染色中可見亮藍色細胞核，表明肝臟脫細胞處理前組織內有大量細胞。脫細胞處理后，HE及DAPI染色中細胞核消失，表明肝臟脫細胞處理后細胞脫除完全（圖1）。

2.2 大鼠肝ECM成分的獲取及交聯獲得HP-HA-肝ECM水凝膠

圖1 肝臟脫細胞前后的比較 （×100）Fig 1 Comparison of the liver tissue before and after decellularization （×100）

經過脫細胞化、凍干、冰凍研磨、胃蛋白酶溶解后得到的膠狀肝ECM成分（圖2A）。該成分外觀通透，無肉眼可見雜質，無明顯異味（圖2B）。成品肝素-透明質酸水凝膠，初始為均質白色固態，待完全溶解后為透明狀液體。將兩者交聯得到HP-HA-肝ECM水凝膠，無色無味透明狀，稍黏稠，30 min完全成為凝膠狀態（圖2C），分別包被于96孔板和48孔板中（圖2D～E）。

2.3 新生SD大鼠下頜下腺細胞的形態學特征

原代培養第3天可見典型的上皮細胞貼壁，第4天時可見少量成纖維細胞，采用差速貼壁法去除成纖維細胞后可得到形態較為一致的下頜下腺細胞，第5天時于顯微鏡下觀察見細胞呈多角形，邊界清晰，排列呈鵝卵石樣外觀；培養至第14天時，可見細胞排列緊密，呈鋪路石狀，胞漿豐富，可見分泌顆粒（圖3）。培養第14天時第1次傳代。

圖2 肝ECM成分的獲取及交聯Fig 2 The preparation of liver decellularized extracellular matrix and crosslink

圖3 原代培養的SD大鼠下頜下腺細胞形態（A：×200；B：×400）Fig 3 Primaryly cultured submandibular gland cells of SD rat（A：×200；B：×400）

2.4 體外培養SD大鼠下頜下腺細胞免疫學鑒定

以α-淀粉酶和CK7作為下頜下腺細胞的標記蛋白。α-淀粉酶和CK7陽性表達的表現是下頜下腺細胞胞膜及胞質呈綠色熒光染色和棕色染色。α-淀粉酶免疫熒光染色和CK7免疫細胞化學染色結果PBS液作為陰性對照。第2代SD大鼠下頜下腺細胞陽性表達α-淀粉酶、CK7標記蛋白。對照組結果陰性（圖4）。

圖4 SD大鼠下頜下腺細胞α-淀粉酶和CK7免疫學鑒定（×400）Fig 4 Immunological identification ofα-amylase and CK7 in SMGCs （×400）

2.5 下頜下腺細胞在HP-HA-肝ECM水凝膠中的增殖情況

隨時間延長，實驗組和對照組下頜下腺細胞的增殖活性均先增加后降低。實驗組在全部檢測時間段內的細胞增殖活性高于對照組（P＜0.05）。第5天，實驗組細胞增殖活性高于對照組（P＜0.05）（圖5）。

2.6 下頜下腺細胞在HP-HA-肝ECM水凝膠中的存活情況

死細胞比率指某一具體時間點死亡細胞數目占細胞總數目的百分比。圖6示實驗組和對照組下頜下腺細胞在培養第1、3、5、7天時的存活情況。經Live／Dead細胞染色法染色后，異硫氰酸熒光素染色活細胞，表現為綠色熒光，德克薩斯紅染色死細胞，表現為紅色熒光。隨時間延長，實驗組和對照組活細胞數目逐漸增多，相同檢測時間點時，實驗組活細胞數目多于對照組。統計死細胞比率如圖7。在1～7 d內，HPHA-肝ECM水凝膠組的死細胞比率低于對照組，差異有統計學意義。第5天和第7天時，實驗組死細胞比率較對照組降低（P＜0.05）。

圖5 細胞的生長曲線Fig 5 The cell growth curves

圖6 下頜下腺細胞在HP-HA-肝ECM水凝膠材料上的存活情況 （Live／Dead細胞染色法，×100）Fig 6 The survival of SMGCs cultured on the HP-HA-liver ECM-hydrogel（Live／Dead Cell Imaging，×100）

圖7 2組細胞的死細胞比率Fig 7 The cell death ratio of the 2 groups

3 討 論

脫細胞方法是獲得組織工程學再造器官天然生物支架的一種重要方法，發揮著不可替代的作用。目前，采用物理、化學和生物制劑等脫細胞技術制取的生物支架已廣泛應用于組織工程領域，但是不同脫細胞方法對ECM的結構及其細胞外基質本身含有的生長因子及蛋白保存的影響卻不一樣。本研究的脫細胞方法采用了對ECM成分、結構影響較小的冷凍復融法［9-11］、TritonX-100［12］和胃蛋白酶［13］，避免了SDS［14］等其他方法破壞ECM結構、溶解ECM成分。大量ddH2O輔助沖洗、低溫的設置、抗生素的使用等均有利于在保留肝臟原有ECM結構及蛋白成分的同時去除細胞成分。用HE染色及DAPI染色鑒定脫細胞效果，HE及DAPI染色圖均表明：處理前肝組織內含有大量細胞，但脫細胞處理后細胞脫除完全，為后期HP-HA-肝ECM水凝膠的制備奠定了基礎。

本研究后續步驟采用凍干、冰凍球磨儀低溫研磨、胃蛋白酶溶解消化、高速離心方法獲得凝膠狀肝ECM成分。相比于肝臟ECM粉末，該凝膠狀態肝ECM更能充分融合并交聯肝素-透明質酸水凝膠，從而有利于充分發揮2種膠體材料的優勢。有研究發現，肝素的緩釋作用［15-16］和透明質酸水凝膠的載體效應［17-18］在理論上均應有利于該ECM水凝膠材料激活脫細胞化肝臟ECM中的生長因子和蛋白基質成分并發揮其營養作用［7，19］。

通過分析改良脫細胞方法和肝素透明質酸水凝膠作用后，認為HP-HA-肝ECM水凝膠作為三維構建組織工程化涎腺類器官的支架材料具備較多優越性。生物相容性［20］是生物材料研究中始終貫穿的主題。細胞相容性是其中的一個方面，它是指宿主細胞對生物材料產生反應的一種性能。細胞相容性一般要求材料應該具有細胞黏附性、細胞激活性和抗炎癥性、無誘變性、無抗原性、無致癌性、無抑制細胞生長性、無致畸性等等。目前檢測細胞相容性的研究方法有：過敏實驗、細胞毒性實驗、顯性致死實驗、植入實驗（皮下植入實驗、骨內植入實驗）、遺傳毒性和致癌實驗等等。本實驗中CCK8法檢測細胞增殖能力，考察的是支架材料是否會抑制細胞生長、有無細胞毒性；Live／Dead細胞染色法檢測了細胞的存活情況，考察的是生長于支架材料上的細胞的存活情況。CCK-8結果中，下頜下腺細胞接種于HP-HA-肝ECM水凝膠后，在全部檢測時間段內的細胞增殖活性高于對照組（P＜0.05），表明HP-HA-肝ECM水凝膠有助于提高細胞增殖活性。Live／Dead細胞染色法結果中，下頜下腺細胞接種于HP-HA-肝ECM水凝膠后，在全部檢測時間段內死細胞比率低于對照組（P＜0.05），表明HP-HA-肝ECM水凝膠有助于降低死細胞比率。以上2個實驗結果均表明：HP-HA-肝ECM水凝膠有助于下頜下腺細胞的存活并提高其增殖活性，降低死細胞比率。這表明HP-HA-肝ECM水凝膠材料具有細胞相容性。所以綜上所述，自制的HP-HA-肝ECM水凝膠具有細胞相容性，為涎腺類器官的構建提供了理想的支架材料。

有研究表明Triton X-100灌注法制備大鼠肝臟ECM支架比SDS灌注法更能保留GAGs和膠原成分，體內植入后亦有更好的膠原纖維重塑反應［21］；王雷等用細胞外基質Ⅰ型膠原蛋白免疫熒光染色和苦味酸-天狼星紅染色證實，大鼠肝臟灌注Triton X-100能在完全脫除細胞的同時有效保留肝臟ECM中的膠原成分［22-23］。所以，下一步本研究將對自制的HP-HA-肝ECM水凝膠中含有的生物活性因子及蛋白質進行檢測，如對細胞外基質中的膠原蛋白、GAGs和彈性蛋白進行定量或半定量分析，比較肝臟脫細胞前、后ECM中生物活性成分含量的變化。另外，本研究將對該ECM水凝膠體三維構建組織工程化涎腺類器官的可能性及能力進行評估。希望獲得細胞相容性良好、具有生物活性、有利于種子細胞自組裝和三維培養的理想細胞外基質支架材料，為組織工程化涎腺類器官三維構建的研究打下基礎。