大黃素對慢性牙周炎模型大鼠牙周膜細胞生物學(xué)特性的影響

徐梅 牛玉明 梁守建 陳德森

慢性牙周炎約占牙周炎患者的95%，是由長期存 在的牙齦炎向深部牙周組織擴展而引起的最常見的一類牙周炎，其主要的病理改變?yōu)檠乐艽脱啦酃俏眨?］。牙周致病菌滋生是導(dǎo)致牙齦炎的主要病因，而牙齦炎可逐漸、隱匿地過渡成牙周炎，導(dǎo)致牙齒與牙齦分離，嚴重者造成牙齒松動甚至脫落，降低了患者生活質(zhì)量，嚴重威脅患者口腔健康，且近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)增加趨勢［2］。因此，提高患者生活質(zhì)量，早期發(fā)現(xiàn)和診斷，防止牙槽骨吸收十分重要。治療慢性牙周炎的關(guān)鍵是促進牙周膜細胞增殖、增加細胞活性，抑制牙周膜細胞炎癥因子釋放。牙周膜細胞即能合成膠原、亦可降解膠原，能夠不斷分化成成骨細胞而形成新的主纖維和牙骨質(zhì)，對牙槽骨改建、創(chuàng)傷修復(fù)和牙周再生中發(fā)揮重要作用，牙周膜細胞是牙周組織中的主要功能細胞［3］。故在對慢性牙周炎治療中，除應(yīng)用抗生素、治療牙周袋、修復(fù)遭到破壞的牙槽骨外，還應(yīng)注重牙周膜細胞的再生功能。大黃素是從掌葉大黃的根莖中提取的生物堿，具有抗炎、抗腫瘤、抗微生物生長、免疫抑制等作用，目前已有研究證實其可通過抑制炎癥因子而治療牙周炎［4］。但大黃素是否對牙周膜細胞的再生功能產(chǎn)生影響卻鮮有報道，本研究采用牙周結(jié)扎并在牙齦涂布卟啉單胞菌混懸液的方法建立大鼠慢性牙周炎模型，觀察大黃素牙周膜細胞的生物學(xué)特性的影響，為尋找治療慢性牙周炎潛在的有效藥物提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物和分組

SPF級SD大鼠30只，雌雄不拘，體質(zhì)量180～200 g，動物購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。在進行實驗時，所進行的動物實驗應(yīng)符合倫理學(xué)原則，按實驗動物3R原則，給予SD大鼠人道關(guān)懷。本實驗在湖北省隨州市中心醫(yī)院動物實驗中心標(biāo)準(zhǔn)實驗室進行實驗，動物使用合格證編號：SCXK（京）2017-019；實驗室設(shè)施合格證編號：［SYXK（鄂）2018-001］。實驗時選取其中20只正常健康大鼠構(gòu)建慢性牙周炎模型并隨機均分為模型組和大黃素組（n＝10），另10只正常健康大鼠不造模，設(shè)為對照組。

1.2 主要藥品及試劑

大黃素標(biāo)準(zhǔn)品（批號：B10249，上海士鋒生物科技有限公司）；過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptors-γ，PPAR-γ）和牙齦組織核因子 κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB）檢測試劑盒（批號：H0347和0315，上海超研生物科技有限公司）；牙周膜組織中白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-8（interleukin-8，IL-8）和白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（批號：4361、4325和4327，上海信裕生物科技有限公司）；流式細胞儀（貝克曼庫爾特中國分公司，美國）；酶聯(lián)檢測儀（Bio-Rad公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠慢性牙周炎模型的建立 模型建立采用牙周結(jié)扎后手術(shù)區(qū)域牙齦涂布卟啉單胞菌混懸液的方法。在牙周結(jié)扎手術(shù)前，大鼠禁食1 d，不禁水。用3%戊巴比妥鈉腹腔注射（0.25 ml／kg）全麻大鼠，于上頜第一、二磨牙牙周行8字交叉結(jié)扎，術(shù)后1周后開始在手術(shù)區(qū)域牙齦涂布卟啉單胞菌混懸液，間隔2 d涂藥1次，共涂菌15～20次（約8～10周）至第一、二磨牙牙間隙增寬、牙根分叉暴露，牙槽出現(xiàn)嚴重骨吸收為牙周炎模型建模成功標(biāo)準(zhǔn)［5］。然后拆除第一、二磨牙結(jié)扎絲，開始進行藥物治療實驗。

1.3.2 治療 治療前先將大黃素配制成0.5%的溶液，根據(jù)人與實驗動物用藥換算公式計算大鼠大黃素的用藥劑量。大黃素組的用藥劑量為每日2 ml／kg，采用灌胃給予大黃素的方法治療，模型組和對照組正常飼養(yǎng)，每鼠灌胃給予0.9%生理鹽水（2 ml／kg）對照。所有動物均按上述灌服給藥方法治療2周。

1.3.3 流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測牙周膜細胞周期 處死大鼠后摘取上頜第一、二磨牙，小心刮取牙周組織制成組織勻漿，常規(guī)胰酶消化法收集勻漿懸液牙周膜細胞細胞，用500μl Buffer A（5 g／LBSA，100 mml／L PBS）重懸，洗滌2次，加300μl細胞染色液（含RNase A 50μg／ml，PI 25μg／ml）吹勻，4℃避光溫孵30 min，然后用流式細胞儀檢測牙周膜細胞周期，用Cell Quest析軟件分析各組G1／G0、G2／M、S、G2+S細胞所占百分率。

1.3.4 Western blotting檢測牙周膜組織PPAR-γ和NF-κB表達 取上述牙周組織制成組織勻漿，3 000 r／min離心10 min，取上清，-80℃冰箱凍存?zhèn)錅y。按試劑盒說明書操作，先提取總蛋白，經(jīng)SDS分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜；加入兔抗人PPAR-γ和NF-κB抗體，用封閉緩沖液封閉非特異性結(jié)合位點，室溫1 h，振搖，4℃過夜。TBST室溫洗膜2次，每次10 min；加二抗，在鏈霉親和素-偶聯(lián)物即鏈霉親和素-POD中孵育；在大容量的TBST中洗膜4次，每次15 min；在DAB中室溫孵育5～15 min；設(shè)定酶標(biāo)儀波長為450 nm，讀取樣品A值，使用Curve expert 1.3軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以A值為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算PPAR-γ和NF-κB濃度。

1.3.5 ELISA檢測牙周膜細胞IL-6、IL-8和IL-1β濃度 取上述牙周組織制成組織勻漿，離心（3 000 r／min）10 min，取上清，-80℃冰箱凍存?zhèn)錅y。離心管中加稀釋標(biāo)準(zhǔn)、輕輕振蕩使之充分混勻。設(shè)96孔，每孔準(zhǔn)確加入100μl標(biāo)準(zhǔn)品，室溫下孵育2 h。準(zhǔn)確加入100μl用Assay Dliuent稀釋的備測樣本。加一抗后吸出標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，加入300μl 1×wash buffer，振蕩、沖洗3次。加入100μl detection antibody solution。密封孔板后于室溫下孵育2 h。然后加鏈霉親和素-辣根過氧化物酶的生物素標(biāo)記過夜，吸出Detection antibody solution，洗板，加100μl稀釋的streptavidin-HRP solution室溫下孵育，30 min后吸出streptavidin-HRPsolution，然后洗板4次。加100μl底物室溫避光孵育30 min至變色，迅速加入終止液100μl，30 min后移至Bio-Rad酶標(biāo)儀，酶標(biāo)儀波長設(shè)置為540 nm，讀取樣本吸光度A值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出IL-6、IL-8和IL-1β的濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大黃素對大鼠牙周膜細胞周期的影響

FCM檢測顯示模型組牙周膜細胞G1／G0和G2／M較對照組明顯升高，而S和G2+S明顯降低（P＜0.05），提示模型組大鼠牙周膜細胞增殖放緩，細胞活力降低，細胞增殖在S期和G2期分化增殖受阻。大黃素組牙周膜細胞G1／G0和G2／M較模型組明顯降低，而S和G2+S明顯升高（P＜0.05），與模型組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。提示大黃素治療，大鼠牙周膜細胞細胞活力增強，S期和G2期分化增殖速度增快（表1）。

表1 各組大鼠牙周膜細胞周期分布比較 （n＝10，%，）Tab 1 Comparison of periodontal ligament cell cycle distribution of the rats among groups（n＝10，%，）

表1 各組大鼠牙周膜細胞周期分布比較 （n＝10，%，）Tab 1 Comparison of periodontal ligament cell cycle distribution of the rats among groups（n＝10，%，）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

+S對照組組 別 G1／G0 G2／M S G2 56.02±7.82 7.02±0.91 34.17±8.02 45.14±6.47模 型 組 75.19±8.06① 9.15±1.04① 14.84±1.63① 22.96±2.03①大黃素組 57.24±6.43② 6.87±0.81② 35.17±7.51② 43.64±5.86②

2.2 大黃素對大鼠牙周組織PPAR-γ和NF-κB表達的影響

Western blotting檢測檢測顯示模型組牙周組織且PPAR-γ表達降低、而NF-κB表達增強，與對照組比較（P＜0.05）；而大黃素組牙周組織PPAR-γ高表達、而NF-κB低表達（P＜0.05）（表2）。

2.3 大黃素對大鼠牙周組織IL-6、IL-8和IL-1β濃度的影響

與對照組比較，模型組牙周組織IL-6、IL-8和IL-1β濃度升高（P＜0.05）；而大黃素組IL-6、IL-8和IL-1β濃度降低（P＜0.05），與模型組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

表2 各組大鼠牙周組織PPAR-γ和NF-κB表達比較及IL-6、IL-8和IL-1β濃度比較（n＝10，pg／ml，）Tab 2 Comparison of PPAR-γgamma and NF-κB expression and IL-6，IL-8 and IL-1βconcentrations in periodontal tissues of the rats among the groups （n＝10，pg／ml，）

表2 各組大鼠牙周組織PPAR-γ和NF-κB表達比較及IL-6、IL-8和IL-1β濃度比較（n＝10，pg／ml，）Tab 2 Comparison of PPAR-γgamma and NF-κB expression and IL-6，IL-8 and IL-1βconcentrations in periodontal tissues of the rats among the groups （n＝10，pg／ml，）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

組 別 PPAR-γ NF-κB IL-6 IL-1βIL-8對 照 組 19.57±2.04 27.35±3.14 0.27±0.02 0.43±0.06 0.12±0.03模 型 組 11.31±1.68① 41.33±5.27① 1.38±0.37① 1.53±0.22① 0.72±0.09①大黃素組 20.13±3.29② 26.54±2.97② 0.26±0.07② 0.42±0.09② 0.13±0.02②

3 討 論

慢性牙周炎一類嚴重威脅類口腔健康的牙周病，因牙周炎可導(dǎo)致牙齒與牙齦分離造成牙齒松動甚至脫落而影響進食，是造成患者營養(yǎng)不良的重要病因，對其治療的關(guān)鍵是促進患者牙周膜細胞增殖、使牙周組織再生，形成牙周新附著，因此，如何使牙周膜細胞快速增殖和分化并有效的附著在根面是治療的關(guān)鍵所在［6-7］。

本研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可促進牙周膜細胞快速增殖和分化，增強牙周膜細胞活力，表現(xiàn)在G1／G0和G2／M較模型組明顯降低，而S和G2+S明顯升高。牙周膜細胞的增殖是通過細胞周期來實現(xiàn)的，細胞周期是指從一次細胞分裂形成子細胞開始到下一次細胞分裂形成子細胞為止所經(jīng)歷的過程。整個細胞周期分為DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和M期（細胞分裂期）4個階段。其中S和G2+S是DNA合成的關(guān)鍵時期，處于此階段的細胞增殖旺盛，其比例在細胞周期中較高［8］。因此，S和G2+S在細胞周期中可客觀地反映細胞增殖能力和活力［9］。有研究表明，大黃素可通過抑制內(nèi)毒素而促進牙周膜細胞增殖［10］。但目前沒有實驗證實其是否是通過影響S和G2+S期而增強牙周膜細胞增殖能力和活力。本實驗觀察到：大黃素組S和G2+S分別為（35.17±7.51）%和（43.64±5.86）%，明顯高于模型組的（14.84±1.63）%和（22.96±2.03）%，這一結(jié)果提示經(jīng)大黃素治療，大鼠牙周膜細胞細胞活力增強，S期和G2期分化增殖速度增快。

本研究還發(fā)現(xiàn)，大黃素組牙周組織PPAR-γ高表達、而NF-κB低表達，IL-6、IL-8和IL-1β濃度較模型組明顯降低。研究表明，牙周炎患者體內(nèi)NF-κB長期處于高激活狀態(tài)，而NF-κB又可促進炎性細胞因子IL-6、IL-8和IL-1β的產(chǎn)生，造成骨與牙周組織破壞增強，故抑制NF-κB活性可減少炎性細胞因子IL-6、IL-8和IL-1β的產(chǎn)生，降低后者對骨與牙周組織的破壞［11］。大黃素可能作用于NF-κB信號通路，抑制NF-κB活性，間接減少炎性細胞因子IL-6、IL-8和IL-1β的產(chǎn)生而發(fā)揮保護牙周組織炎癥創(chuàng)面的作用［12］。PPAR-γ是核激素受體家族中的配體激活受體，PPAR-γ與配體結(jié)合后調(diào)節(jié)多種核內(nèi)靶基因轉(zhuǎn)錄，參與程序性細胞死亡及細胞分化的發(fā)生發(fā)展［13］。PPAR-γ還可通過調(diào)控NF-κB信號通路而實驗現(xiàn)抑制炎性細胞因子（如IL-6、IL-8和IL-1β）的產(chǎn)生，提高PPAR-γ表達能顯著抑制炎性細胞因子的基因表達，這對牙周炎的治療具有重要意義［14］。本實驗發(fā)現(xiàn)大黃素具有上調(diào)PPAR-γ表達的作用，降低NF-κB表達，并通過降低NF-κB表達而抑制子IL-6、IL-8和IL-1β的產(chǎn)生，從而實現(xiàn)調(diào)控炎癥反應(yīng)的作用。

總之，大黃素可能通過促進大鼠牙周膜細胞S期和G2期分化和增殖速度，增加細胞活性，并通過提高PPAR-γ信號通路下調(diào)NF-κB表達，進而抑制牙周膜細胞炎癥因子IL-6、IL-8和IL-1β的表達而降低牙周組織炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對慢性牙周炎的治療作用。本實驗的重要發(fā)現(xiàn)是觀察到大黃素可促進牙周膜細胞的再生功能，這對臨床治療慢性牙周炎具有后果要意義，為治療慢性牙周炎提供了實驗和理論依據(jù)。