TiN／Ag復合抗菌涂層與微溝槽形貌對HGFs的生物相容性和抗菌性能研究

賴穎真 周麟 陳江

牙種植體穿過牙齦的上皮和結締組織到達骨內，形成了2個界面：種植體骨組織界面，種植體軟組織界面。其中種植體軟組織愈合良好有利于形成良好的邊緣封閉及阻止細菌入侵的作用。研究發現口腔黏膜的上皮細胞具有沿著種植體根方遷移的趨勢，良好的結締組織愈合有利于阻止上皮的根方遷移［1］，課題組研究［2］發現種植體穿齦部分的微溝槽結構有利于引導結締組織的牙齦成纖維細胞順著溝槽生長緊束牙齦結締組織，然而溝槽結構一定程度上增加了材料的表面積，從一定程度上增加了細菌黏附的可能，如何在微溝槽上面制作合適的納米抗菌涂層是本研究的重點。研究發現銀（Ag）具有良好的抗菌性能，但影響細胞的生物相容性，氮化鈦涂層的細胞生物相容性較好，但抗菌性能略差［2］，本研究利用2種涂層的優缺點，在60 μm寬，10μm深的溝槽結構表面，利用磁控濺射技術制作5%Ag的TiN／Ag的納米復合膜（TiN／Ag-MG），研究新的材料表面對牙齦成纖維細胞生物活性及牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）抗菌性能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料的準備及理化性能檢測

60μm寬，10μm深的微溝槽表面硅片制作方法同課題先前［3］，JS-3X-100B磁控濺射臺，掃描電鏡（FE-SEM）（LEO1530，Zeiss，德國），原子力顯微鏡（AFM）（Agilent，5500，美國），親水性測量儀（KRUSS DSA30），X射線光電子能譜儀（XPS）（Thermo Scientific ESCALAB 250，美國），電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS）（DRC-e，PE公司，美國）。

利用磁控濺射臺，對照組選擇（Ti靶），濺射200 nm鈦，實驗組選擇Ti靶+Ag靶，濺射氣體為高純度氮氣，通過調節Ag靶功率條件Ag含量為5%。材料面積為2 cm×2 cm。

掃描電鏡放大倍數500倍觀察材料表面微溝槽形貌，原子力顯微鏡（測量范圍2μm×2μm），觀察涂層表面納米形貌，測量納米級粗糙度。利用XPS分析各種涂層表面（測量范圍2 mm×3 mm）的元素含量價態與結合方式。利用ICP-MS測量TiN／Ag-MG材料表面Ag+離子釋放：將材料浸泡在10 ml純水中，測量1、3、5、7 d的Ag+釋放量。每次測量完后更換新的純水，每個時間點重復測量3次。材料的底面積為1 cm2最終濃度換算為ppb。

1.2 牙齦成纖維細胞培養和材料對生物活性檢測

細胞培養：DMEM低糖培養液（Gibco，美國），胎牛血清FBS（HyClon，美國）；細胞活性檢測：吖啶橙／碘化丙啶（AO／PI）染色；免疫熒光：一抗：Monoclonal Anti-Vinculin antibody（V9131，Sigma），二抗：Anti-Mouse IgG（whole molecule）-FITC antibody（F0257，Sigma），細胞骨架：羅丹明鬼筆環肽Rhodamine Phalloidin（Cat.＃PHDR1，Cytoskeleton），細胞核DAPI（D9542，Sigma）；細胞周期：細胞周期試劑盒（南京凱基），流式細胞儀（FC-500，貝克曼庫爾特，美國）。

AO-PI染色：牙齦成纖維細胞原代培養同前［3］，AO-PI染色：HGF接種于實驗組和對照組材料1 d，放入24孔板，每孔加入500μl AO／PI，室溫避光15 min，熒光顯微鏡下計數100個HGF細胞中活細胞個數，重復7次，并計算百分比。

細胞周期：材料（2 cm×2 cm）消毒后放入6孔板，接種HGF 1×105個／孔，培養1、3、7 d，消化細胞，加ACCUTASETM細胞消化液，吹打分離材料片上的細胞收集至離心管，加入預冷70%乙醇，4℃固定1 h；離心收集細胞，細胞沉淀中加入RNaseA重懸，37℃水浴30 min；再加入400μl PI染色，4℃避光30 min；用300目尼龍網（孔徑40～50μm）過濾細胞，去除細胞團塊；1 h內流式細胞儀分析細胞DNA含量分布，Modfit 2.0軟件分析。

免疫熒光：材料（1 cm×1 cm）消毒后放置于24孔板中，接種HGF 3.5×104個／孔，培養1 d，4%多聚甲醛室溫固定15 min，，0.5%Triton X-100室溫破膜5 min，1%BSA室溫封閉30 min；一抗：anti-vinculin antibody，37℃孵育1 h；二抗：Anti-Mouse IgG（whole molecule）-FITC 1∶32，37℃避光30 min；細胞骨架Rhodamine Phalloidin，300μl／孔，37℃避光30 min，PBS清洗1次；DAPI染色：室溫避光作用3～5 min；將材料片倒扣在滴有抗淬滅封片劑的蓋玻片，熒光倒置顯微鏡100倍拍照觀察。

1.3 材料對Pg抗菌性能檢測

Pg ATCC 33277，LIVE／DEAD?BacLightTMBacterial Viability Kits（L7007 Invitrogen），BHI 3.7 g／100 ml，YEA 0.5 g／100 ml，Hemin 1 ml／100 ml，Vitk3 0.2 ml／100 ml，厭氧產氣袋AnaeroPackTM-Anaero（C-11）。

材料（1 cm×1 cm）常規消毒后放置于24孔板中，A值為0.01菌液濃度接種于24孔板，在厭氧環境中培養1 d，加入STYO9／PI熒光染料避光15 min，將材料倒扣在蓋玻片于倒置熒光顯微鏡下100倍觀察拍照，重復7次，用Image J（http：／／rsb.info.nih.gov／ij／）進行熒光像素定量分析。

1.4 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件，單因素方差分析，組間統計SNK-q test進行兩兩比較，P＜0.05差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 材料表面理化性能檢測

掃描電鏡結果（圖1）顯示對照組表面形貌為光滑，實驗組為規則的溝槽結構，溝槽寬度為60μm，深度為10μm。原子力顯微鏡結果（圖2）顯示Ti涂層納米顆粒較大，納米粗糙度為：1.9 nm，TiN／Ag涂層納米顆粒較小，納米粗糙度為1.45 nm，實驗組表面的納米粗糙度小于對照組（圖3）。親水性結果顯示對照組接觸角99°，實驗組接觸角42°，實驗組材料表面的親水性優于對照組。表面元素含量分析顯示：TiN／Ag-MG表面含有3.54%間隙氮（N），同時存在Ag 3 d，對照組材料表面不存在間隙氮（N），無Ag 3 d，實驗組和對照組表面O 1s含量接近。實驗組TiN／Ag-MG材料Ag釋放量在第1天最高，后逐漸下降，到第3天后趨于穩態（圖4）。

圖1 材料表面微米級形貌（SEM）Fig 1 Microtopography of material surfaces（SEM）

圖2 材料表面納米級形貌（AFM）Fig 2 Nanotopography of material surfaces（AFM）

圖3 材料表面靜態接觸角Fig 3 Static contact angle of different material surfaces

圖4 TiN／Ag-MG材料Ag+釋放量Fig 4 Silver ion release of TiN／Ag-MG

2.2 材料表面死活細胞檢測

根據AO／PI原理，活細胞核呈亮綠色熒光，而死細胞核呈現橙紅色（圖5）。選擇1 d Ag+釋放量最大的時間點，可見各組細胞中死細胞和活細胞比例沒有明顯差異，經過計數統計，實驗組和對照組組活細胞比例分別為：90.5%，91.5%，P＞0.05，差別沒有統計學意義，可以推測實驗組5%Ag的TiN／Ag的納米復合膜中Ag+釋放量沒有加重HGF細胞的凋亡。

圖5 HGFs在材料表面（AO／PI染色）Fig 5 HGFs on the material surfaces（AO／PI staining）

2.3 材料表面細胞周期推進

紅色區域代表細胞增殖期S（圖6），可見實驗組材料表面紅色區域面積明顯大于對照組，即在HGF培養第1、3、7天，實驗組材料表面細胞增殖周期推進比例均大于對照組，可見微溝槽表面加5%Ag的TiN／Ag的納米復合膜有利于促進HGF的增殖。

2.4 HGF在材料表面的免疫熒光染色

細胞在材料表面免疫熒光（圖7）：藍色熒光代表細胞核，綠色熒光代表細胞Vinculin蛋白，紅色熒光代表細胞骨架，可見對照組表面HGFs無規律排列，實驗組材料表面HGFs順著溝槽有規律排列，同時實驗組表面生長細胞多于對照組。

2.5 Pg在材料表面死活菌黏附檢測

圖8綠色熒光代表活菌，橙色代表死菌，對照組材料表面綠色熒光即活菌的密度遠遠大于對照組，幾乎連成片狀菌斑，實驗組材料表面綠色熒光代表的活菌黏附量明顯少于對照組，且細菌狀態不佳，出現較多黃色或橙色熒光，實驗組材料顯示了較好的抗菌性能。

3 討 論

種植體穿齦部分與周圍組織愈合的好壞關系到種植體的邊緣封閉性能，該部分與組織愈合的越牢固，越能防止口腔內細菌順著種植體邊緣垂直遷移入深部，導致種植體周圍炎和種植體失敗。本課題組先期致力于加強種植體邊緣愈合而進行種植體穿齦部分的微溝槽改性，研究證明微溝槽的存在確實有利于周圍HGFs的生物活性，由于微溝槽的存在一定程度下增加了細菌可以黏附的表面積，需要在溝槽表面制作一定的抗菌涂層，研究證明Ag涂層具有良好的抗菌性能［4］，然而先期研究做了單獨的Ag涂層和TiN涂層，研究發現Ag涂層抗菌性能好，但對HGFs的生物活性影響較大［5］，TiN抗菌性能一般，但對HGFs的生物活性較優［6］。因此本實驗利用2種涂層的性能，對磁控濺射工藝進行改良，通過預實驗制作5%Ag的TiN／Ag的納米復合膜于微溝槽（MG，寬度60μm，深度10μm）表面，稱為TiN／Ag-MG。

圖6 HGFs在材料表面細胞周期圖Fig 6 Cell cycle diagram of HGFs on material surfaces

圖7 HGFs在材料表面免疫熒光染色Fig 7 Immunofluorescence stained of HGFs on material surfaces

圖8 Pg在材料表面的死活菌檢測Fig 8 Detection of dead／live Pg on the material surfaces

3.1 TiN／Ag-MG對HGFs生物活性的影響

結果顯示：TiN／Ag-MG材料表面死細胞的量沒有高于對照組，同時細胞周期S期所占的比例高于對照組，細胞骨架排列良好，順著溝槽方向排列?？梢娦碌膹秃贤繉硬牧媳砻嬗欣贖GF的生物活性，保持了溝槽具有的“接觸誘導效應”。分析其原因與材料本身的理化性質有關，研究認為［7］材料表面的納米粗糙度越小，越有利與細胞增殖和細胞周期的推進，復合涂層材料表面納米顆粒小于對照組，納米粗糙度也小于對照組，有利于HGF在材料表面細胞周期的推進和細胞的增殖。此外，研究還發現［7］材料疏水性越大，細胞在材料表面黏附鋪展的越差，細胞骨架呈皺縮狀態，材料表面親水性越好，越有利于細胞黏附，細胞骨架的鋪展越好，實驗組材料由于溝槽形貌存在，N元素的加入［5］，材料的親水性優于對照組，接觸角為42°，HGF在其表面黏附狀態優于光滑對照組，細胞骨架順著溝槽表面鋪展，顯示出良好的細胞黏附狀態。最后，5%Ag含量所帶來的Ag離子釋放量較低，沒有導致明顯的細胞死亡，這在AO-PI實驗中得到證實，少量Ag涂層的存在沒有影響細胞的生物活性，分析原因可能是由于Ag含量較低，且TiN涂層3.54%間隙氮（N）有利于細胞的生物活性，兩者綜合的結果還是有利于HGF的生物活性。

3.2 TiN／Ag-MG對Pg抗菌性能的影響

材料表面微溝槽形貌的改變一定程度上增加了材料的表面積，有研究認為微溝槽形貌的存在形成了保護細菌的場所，免受周圍液體的沖刷［8］，實驗結果顯示復合納米涂層材料表面細菌黏附的量遠低于實驗組，可見溝槽的存在雖然增加了細菌黏附的表面積，但其他的理化性能彌補了這一不足。首先細菌黏附在材料表面主要依靠材料與細菌的疏水作用力。材料表面疏水性越大，細菌黏附的越多越牢，微溝槽的形貌的存在極大降低了材料的疏水性，因此實驗組材料表面的親水性不利于細菌的黏附，其次，材料表面的納米粗糙度對細菌黏附的影響不同的研究有不同觀點，有研究認為細菌的黏附與納米粗糙度的大小無關，也有研究認為納米粗糙度增加能刺激細菌新陳代謝，促進細菌繁殖，相反的也有研究認為納米粗糙度增加能減少細菌的黏附［9］，與傳統觀點越光滑的表面細菌黏附越少相反，本實驗中實驗組納米粗糙度較小，實際細菌黏附減少，可能還有與復合涂層中Ag離子的釋放關系很大，Ag離子一開始能夠抑制細菌的黏附，進而直接影響細菌的分裂增殖，導致細菌細胞壁破裂而死亡，本實驗ICP測試復合抗菌膜上方Ag離子釋放從第1天到第7天始終高于1 ppb，研究證明0.1 ppb就能達到較好的抗菌作用［10］，因此微溝槽上方復合涂層的抗菌效果應該來源于材料表面的親水性及Ag離子的釋放。

綜上所述，具有5%Ag的TiN／Ag復合抗菌涂層與微溝槽形貌結合（TiN／Ag-MG）材料優于單一Ag或TiN涂層，有利于牙齦成纖維細胞粘附增殖及細胞周期推進，并能引導細胞順著溝槽生長，同時具有良好的抗菌性能，可以運用于種植體穿齦部分表面。