生物活性玻璃對早期根面齲再礦化的研究

高鵬 彭偉 李慧 張煒 武孟琳

根面齲是老年人及牙周病患者最常見的牙體硬組織疾病，隨著年齡的增長根面齲的患病率也在逐步增高［1］。由于根面齲廣泛的流行性、口腔臨床損害的特殊性及齲損位置的隱蔽，使治療難度加大且療效不佳，因此對于根面齲的防治尤為重要。前期實驗已經(jīng)證實生物活性玻璃對牙釉質(zhì)與牙本質(zhì)有再礦化作用［2-3］，國內(nèi)外對于生物活性玻璃促進(jìn)早期根面齲再礦化的作用未見報道。本研究通過建立早期根面齲模型，通過原子力顯微鏡與熒光顯微鏡觀察生物活性玻璃（BAG）、酪蛋白磷酸肽-無定形磷酸鈣（CPP-ACP）、氟化鈉（NaF）處理脫礦牙骨質(zhì)后的表面結(jié)構(gòu)形態(tài)、粗糙度、熒光面積與總熒光量，討論生物活性玻璃對早期牙骨質(zhì)齲的再礦化作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

生物活性玻璃（北京刷新活力）；人工唾液（ISO／TR10271標(biāo)準(zhǔn)）［4］：NaCl 0.8 g、KCl 0.8 g、CaCl2·2H2O 1.59 g、NaHPO4·2H2O 1.56 g、Na2S·2H2O 0.01 g、Urea 2 g、DDW 2 000 ml，pH＝7.0；人工酸蝕液（酸性緩沖液）：Ca（NO3）22.2 mmol／L、KH2PO42.2 mmol／L、CH3COOH 50 mmol／L，pH＝4.7；中性緩沖液：20 mmol／L HEPES，1.5 mmol／L KH2PO4，pH＝7.0。原子力顯微鏡（Agilent，5600LS，德國）；熒光顯微鏡（O-lympus，BX53，日本）；掃描電子顯微鏡 （Hitachi，S3400N，日本）往復(fù)水浴恒溫箱（SHA-CA，江蘇新寶）；超聲震蕩機（KQ-600DE，昆山舒美），硬組織切骨機（QGJ-1A，上海珂淮）；抗酸指甲油（美寶蓮，美國）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的選擇與制備 選擇華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科因正畸治療而拔除的雙側(cè)下頜第一前磨牙20顆（年齡在18～22歲，單根管下頜第一前磨牙，患者已知情同意簽署知情同意書，符合華北理工大學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)）。體視顯微鏡（×20）下篩選無裂痕、齲損及充填物且牙根發(fā)育完全的牙齒，去除根面牙周纖維等軟組織，去離子水超聲振蕩10 min，位于秞牙骨質(zhì)界下2 mm進(jìn)行冠根分離，再用硬組織切骨機將牙根切割成4 mm×3 mm×2 mm的牙骨質(zhì)塊40個，放置于0.05%麝香草酚去離子水中4℃保存，實驗區(qū)外均用抗酸指甲油覆蓋備用［5］。

1.2.2 實驗分組與早期牙骨質(zhì)齲模型建立 將40枚牙骨質(zhì)塊隨機分為4組，A（BAG組）、B（CPP-ACP組）、C（NaF組）、D（DDW組）平均每組10枚牙骨質(zhì)塊，放置在37℃恒溫水浴箱內(nèi)進(jìn)行為期96 h脫礦，脫礦后在去離子水中超聲振蕩5 min，形成70～100μm齲損深度的早期根面齲模型［6］。人工齲成功標(biāo)準(zhǔn)：牙骨質(zhì)塊表面出現(xiàn)白堊色改變，電子顯微鏡下觀察牙骨質(zhì)塊表面粗糙，有蜂窩狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生［7］。

1.2.3 pH實驗循環(huán)［4］將A、B、C、D組樣本：分別進(jìn)行再礦化處理（BAG、CPP-ACP、2%NaF、去離子水）小毛刷涂擦5 min→中性緩沖液5 min→人工唾液中浸泡3.5 h→酸性緩沖液50 min→人工唾液中浸泡3.5 h，每次更換新配置溶液前使用去離子水沖洗1 min，按照此循環(huán)3次／d，共計20 d，分別在37℃搖動恒溫水浴箱中進(jìn)行，循環(huán)結(jié)束后分別在去離子水中沖洗5 min晾干。

1.2.4 牙骨質(zhì)樣本檢測 各組樣本于脫礦前、脫礦后及再礦化后隨機選出5塊于原子力顯微鏡下掃描范圍5μm觀察其形態(tài)自帶軟件測得粗糙度，剩余樣本用慢速切割機在流水下切取350μm后薄片，使用0.1 mmol／L羅丹明B染料染色60 min，超聲蕩洗脫色10 min，清洗、吹干、封片，使用Image Pro-Plus 6.0軟件分析牙骨質(zhì)塊熒光量面積（A）單位 μm2；總熒光量（TF）；平均熒光量（AF）［8］收集數(shù)據(jù)整理。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。使用單因素方差分析及SNK兩兩比較，假設(shè)檢驗水準(zhǔn)P＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 原子力顯微鏡觀察結(jié)果與粗糙度

通過AFM觀測BAG、CPP-ACP、NaF、DDW處理前后牙骨質(zhì)片的表面形態(tài)，脫礦前牙骨質(zhì)表面比較粗糙，高度起伏不平，脫礦后牙骨質(zhì)表面更加粗糙，有微凹坑的存才，經(jīng)BAG、CPP-ACP、NaF再礦化處理后的牙骨質(zhì)表面相對光滑（圖1）；4組樣本處理后的粗糙度值（Ra值）測試結(jié)果（表1），4組牙骨質(zhì)片脫礦前與脫礦后粗糙度值無統(tǒng)計學(xué)差異，再礦化后各組與脫礦后比較粗糙度值均有明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。再礦化后各組比較：BAG組、NaF組與CPP-ACP組粗糙度值明顯低于DDW組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；BAG組與NaF組粗糙度值無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），BAG組與NaF組粗糙度值明顯低于CPP-ACP組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組牙骨質(zhì)塊的粗糙度 （n＝5，）Tab 1 The cementum roughness of the groups（n＝5，）

表1 各組牙骨質(zhì)塊的粗糙度 （n＝5，）Tab 1 The cementum roughness of the groups（n＝5，）

注：a與b比：P＜0.01；①與②比：P＜0.05；②與③比：P＜0.05；①與③比：P＞0.05

組別 脫礦前（μm）再礦化前（μm）再礦化后（μm）BAG 3.78±0.19 5.18±0.19 3.18±0.34a ①＞0.05 ＞0.05 ＜0.01 CPP-ACP 3.75±0.14 5.24±0.32 3.92±0.46a②NaF 3.62±0.11 5.12±0.20 3.22±0.12a③DDW 3.64±0.16 5.37±0.26 4.85±0.28b F值 1.28 0.97 29.15 P值

2.2 熒光顯微鏡結(jié)果

熒光顯微鏡鏡下觀察可見脫礦前牙骨質(zhì)樣本熒光條帶較淺，脫礦后熒光條帶明亮，大部分牙本質(zhì)熒光明亮。BAG組處理的牙骨質(zhì)熒光條帶與其他組比較較淺。單因素方差分析顯示BAG組、NaF組與CPP-ACP組的A、TF均低于DDW組（P＜0.05），BAG組的A、TF均低于NaF組與CPP-ACP組，CPP-ACP組與NaF組的A、TF無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。各組間AF無統(tǒng)計學(xué)差異（AF＞0.05）（表2，圖2）。

圖1 牙骨質(zhì)表面AFM圖像Fig 1 AFM image of cementum surface

圖2 牙骨質(zhì)表面熒光顯微鏡圖像 （IFM，×20）Fig 2 IFM image of cementum surface （IFM，×20）

表2 各組牙骨質(zhì)塊再礦化后熒光染色情況 （n＝5，）Tab 2 The remineralized fluorescence area of the groups （n＝5，）

表2 各組牙骨質(zhì)塊再礦化后熒光染色情況 （n＝5，）Tab 2 The remineralized fluorescence area of the groups （n＝5，）

注：各組內(nèi)比較字母不同的表示有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；符號相同表示無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）

組別 A（×104，μm2） TF（×107，a.u.） AF（a.u.）BAG 84.41±2.77d 19.41±1.13g 250.50±2.25*＜0.01 ＜0.05 ＞0.05 CPP-ACP 101.46±3.68c 23.83±1.38f 234.80±6.89*NaF 104.07±5.64c 24.48±1.81f 235.58±17.41*DDW 126.43±2.39e 29.22±5.02h 230.70±36.93*F值 101.34 10.17 0.86 P值

3 討 論

原子力顯微鏡分辨率高，可分辨出納米級別形貌特征，水平向分辨率可達(dá)0.1 nm縱向分辨率可達(dá)0.01 nm，分辨能力超過電鏡，F(xiàn)rank等［9］利用原子力顯微鏡的壓痕技術(shù)，觀察了人體內(nèi)與體外牙釉質(zhì)表面脫礦和再礦化現(xiàn)象，本實驗采用原子力顯微鏡很直觀的觀察到牙骨質(zhì)脫礦后的粗糙表面以及凹坑狀結(jié)構(gòu)，并且從三維立體的形貌外觀觀察到再礦化后表面粗糙度降低以及凹坑減少或消失的表征，為使用原子力顯微鏡進(jìn)行牙骨質(zhì)研究提供理論依據(jù)。

生物活性玻璃（45S5）由Na2O-CaO-SiO2-P2O5四元系統(tǒng)構(gòu)成，能夠緊密的與骨接觸不易脫落且刺激骨生長［10］。2004年英國葛蘭素史克公司研究發(fā)現(xiàn)，BAG在牙本質(zhì)層表面形成硅酸鹽與類羥基磷灰石封閉牙本質(zhì)小管，可以降低牙齒敏感從而替代了傳統(tǒng)牙膏中的硝酸鉀等脫敏藥物的單一處理［11］，并將BAG制成凝膠，在臨床中用于牙本質(zhì)脫敏［12-13］。本課題組前期實驗證實生物活性玻璃可以促進(jìn)早期釉質(zhì)齲的再礦化［2］，本研究證實，經(jīng)BAG、CPP-ACP與NaF處理的牙骨質(zhì)在原子力顯微鏡下可見牙骨質(zhì)粗糙度值均有明顯降低，熒光顯微鏡下熒光條帶面積與熒光總量均有明顯降低，表明BAG、CPP-ACP與NaF對早期根面齲都有一定的再礦化作用；但BAG與NaF的再礦化作用要強于CPP-ACP，分析原因，可能是BAG與唾液接觸后釋放Na+，造成局部弱堿環(huán)境，有利于形成類羥基磷灰石，促進(jìn)了牙體組織表面再礦化［14-15］。BAG的再礦化機制除與鈣磷有關(guān)，還與牙骨質(zhì)表面形成硅酸鹽有關(guān)，可更好地在牙骨質(zhì)表面沉積，促使再礦化的進(jìn)行。本課題組前期研究表明生物活性玻璃可以誘導(dǎo)l929細(xì)胞以及成牙骨質(zhì)細(xì)胞的增殖分化［16］，另外Lepp?ranta等［17］通過長期試驗證實生物活性玻璃對17種厭氧菌與需氧菌有抑制作用，Waltimo等［18］研究發(fā)現(xiàn)BAG在牙周袋內(nèi)能夠?qū)Ω锾m氏陰性菌有抑制作用。因此對于牙周炎牙槽骨吸收而引起的根面齲，生物活性玻璃有著不可替代的優(yōu)勢，一方面可以促進(jìn)牙周組織的再生，另一方面還能促進(jìn)牙骨質(zhì)再礦化，同時對細(xì)菌還有一定的抑制作用，因此生物活性玻璃用于防治根面齲有著廣闊的前景。