LC3、P62在口腔黏膜下纖維性變組織固有層中的表達研究

戴卓 吳穎芳 朱冰玉 喻暉喬 吳凌云 蔣琪

口腔黏膜下纖維性變（oral submucous fibrosis，OSF）是一種以黏膜下組織炎癥和進行性纖維化為特征的口腔潛在惡性疾病［1］，其病理表現主要為膠原堆積和微血管改變［2］。現有研究認為OSF的發(fā)生主要與咀嚼檳榔有關，其發(fā)病機理尚不明確。

細胞自噬（autophagy）是細胞將細胞器和細胞質形成膜結構與溶酶體融合進行降解的代謝過程。自噬被認為與人體控制穩(wěn)態(tài)、炎癥和免疫的生理過程密切相關［3］。有研究表明自噬可以通過抑制口腔鱗癌細胞的增殖和遷移發(fā)揮抗癌效應［4］，通過促進血管生成對肥胖及其并發(fā)癥的發(fā)生起推動作用［5］，參與調控動脈粥樣硬化［6］、腹主動脈瘤［7］、肺動脈高壓［8］等血管疾病的發(fā)生發(fā)展。自噬是否通過調節(jié)血管功能參與OSF的發(fā)生發(fā)展目前尚無相關研究。本實驗通過檢測正常口腔頰黏膜組織及OSF早、中、晚期患者頰黏膜組織固有層中自噬相關微管蛋白1輕鏈3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3，LC-3）和P62（sequestosome1／SQSTM1）的表達，分析自噬對OSF發(fā)生、發(fā)展的作用，為OSF的發(fā)病機理及臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

石蠟（上海國藥生物）；中性樹膠（Sigma，美國）；蘇木素、PBS（7.2-7.6）、枸櫞酸鹽緩沖液、二步法試劑盒、DAB試劑盒（中杉金橋）；兔抗人LC-3抗體（CST，美國）；兔抗人P62抗體、抗-兔、兔-IgG抗體-HRP多聚體（Proteintech Group公司，美國）。

1.2 實驗步驟

1.2.1 收集標本 選取就診于中南大學湘雅醫(yī)院口腔醫(yī)學中心，經臨床和病理確診的早、中、晚期OSF患者的口腔頰黏膜組織各30例作為實驗組，同時收集正常口腔頰黏膜組織30例作為對照組。所有患者均簽署知情同意書，研究方案經中南大學湘雅醫(yī)院倫理委員會審批。患者均為男性，年齡23～66歲，平均年齡（45.43±13.03）歲，其中OSF早期組平均年齡（43.27±12.40）歲，OSF中期組平均年齡（47.73±12.88）歲，OSF晚期組平均年齡（45.30±13.41）歲，正常對照組平均年齡（42.47±13.31），各組平均年齡無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

1.2.2 納入標準和排除標準 納入標準：收集2016-08～2018-06中南大學湘雅醫(yī)院病理科確診為OSF并明確分期的病例，標本取自頰黏膜病變明顯處，大小約1 cm×1 cm。排除標準：OSF合并有其他口腔黏膜病變患者；病變部位存在感染；曾經接受過局部注射或全身治療；患者同時有其他全身疾病或遺傳性疾病；標本不符合臨床和病理診斷標準。正常組織：收集頜面部外傷或整形手術患者口腔頰黏膜組織。患者無咀嚼檳榔、煙酒嗜好，無口腔黏膜病和其他全身疾病（正常組織經病理證實）。

1.2.3 組織處理 組織標本以10%福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片備用。

1.2.4 免疫組化染色 切片脫蠟，常規(guī)HE染色，二步法免疫組化染色采用微波處理修復抗原，已知陽性片做陽性對照，PBS液體代替一抗作空白對照。

1.2.5 結果判斷 陽性染色為黃色或棕黃色染色。利用電腦采像并使用Image-Pro-Plus（IPP）軟件進行圖像分析，每張切片隨機選取5個視野（400倍）及定標的空白區(qū)，計算視野下陽性表達部位的累積光密度值（integrating optical density，IOD）。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料統(tǒng)計結果以表示。計量資料采用單因素方差分析（one-way ANOVA），采用Spearman相關分析自噬關鍵蛋白LC3、P62間的相關性。以α＝0.05作為檢驗水準，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 正常及OSF頰黏膜組織HE染色結果

正常口腔黏膜組織上皮無萎縮和增生情況，上皮釘突形狀規(guī)則，清晰可見，膠原纖維較少，排列有序，固有層血管豐富，炎癥細胞數量極少。OSF患者頰黏膜組織（圖1）上皮萎縮或異常增生，固有層膠原纖維玻璃樣變，血管狹窄、閉塞，有大量炎癥細胞浸潤。且隨著病變的發(fā)展，固有層血管逐漸減少直至消失。

圖1 正常及OSF頰黏膜組織HE染色 （×400）Fig 1 HE staining of normal and OSF buccal mucosa （×400）

2.2 免疫組化結果

LC3蛋白在黏膜組織固有層中的陽性表達為內皮細胞胞核、胞質內棕黃色染色（圖2），LC3蛋白在正常口腔黏膜組織固有層內皮細胞中少量表達，在OSF病變組織固有層內皮細胞中表達明顯，OSF各組表達均高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在OSF早、中、晚各期組織中，中、晚期組較早期組LC3表達上調，晚期組比中期組下調，各組間表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

P62蛋白在黏膜組織固有層中的陽性表達為內皮細胞胞質、包膜內棕黃色染色（圖2），P62蛋白在OSF早、中期頰黏膜組織固有層內皮細胞中表達較少，在正常及OSF晚期頰黏膜組織固有層內皮細胞中表達明顯。早、中期組較正常組P62表達下調，晚期組較正常組上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且OSF各組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

圖2 LC3和P62蛋白在口腔黏膜固有層中的表達 （SP，×400）Fig 2 LC3 and P62 protein expression in the lamina propria of oral mucosa （SP，×400）

表1 LC3和P62在口腔黏膜組織固有層中的表達（n＝30，）Tab 1 Expression of LC3 and P62 in the lamina propria of oral mucosa （n＝30，）

表1 LC3和P62在口腔黏膜組織固有層中的表達（n＝30，）Tab 1 Expression of LC3 and P62 in the lamina propria of oral mucosa （n＝30，）

注：①與正常組比較，P＜0.05；②與早期組相比，P＜0.05；③與中期組相比，P＜0.05

組 別 LC3累積光密度值（×10-3）P62累積光密度值（×10-3）1.474±0.811 6.756±2.907 OSF早期組 2.095±0.954① 2.217±0.877①OSF中期組 7.262±1.679①② 0.964±0.417①②OSF晚期組 5.849±1.001①②③ 11.690±3.681正常組①②③

2.3 口腔黏膜固有層中LC3、P62蛋白表達的相關性

經Spearman相關性分析LC3蛋白與P62蛋白表達呈負相關（r＝-0.172，P＜0.05）。

3 討 論

自噬廣泛存在于酵母及哺乳動物真核細胞中，是細胞程序性死亡的一種形式。根據與溶酶體結合的傳輸機制不同細胞自噬分3種類型：巨自噬、微自噬、分子伴侶介導的自噬［9］。本實驗涉及自噬類型是巨自噬，在哺乳動物和植物細胞中均存在，其過程表現為細胞內質網或高爾基體首先形成雙層膜性結構，包裹細胞內蛋白質及部分細胞器形成自噬泡，隨后沿微管蛋白軌道運輸至溶酶體并與之結合，形成自噬溶酶體，其中的內容物隨即被降解并循環(huán)到細胞質中［9］。自噬是一個復雜的動態(tài)過程，LC3和P62是其中2個重要的蛋白分子，自噬體的形成通常由LC3B（herein LC3）證實［10］。在自噬體形成過程中，LC3B被ATG4裂解產生LC3I，LC3I通過介導ATG12-ATG5復合物與磷脂酰乙醇胺結合而轉化為脂質化形式LC3Ⅱ［11］；LC3Ⅱ反應了自噬體和自噬溶酶體的水平，并行使靶向功能使自噬體與溶酶體結合，最終在自噬溶酶體消化完內容物后，LC3Ⅱ消失［12］。因此，在自噬過程中，LC3通常被作為判斷自噬激活的一個指標，隨著自噬過程的推進，表達量通常表現為上調。P62是由c-myc基因外顯子2和3共同編碼的磷酸化蛋白。P62蛋白在LC3和泛素化底物之間起連接作用［13］。P62可以將LC3和相應的泛素化底物整合到完整的自噬體中，并在自噬溶酶體中降解，因此P62成為判斷自噬降解的一個指標，隨著自噬過程的推進，P62表達量通常表現為下調。

口腔黏膜下纖維性變的病理變化主要為上皮組織萎縮，黏膜固有層及黏膜下層膠原纖維的堆積和玻璃樣變，血管通透性增加，小血管閉塞、減少。在口腔黏膜下纖維性變的發(fā)生發(fā)展過程中，微血管病變是其中一個重要的病理變化。現有研究表明，OSF的發(fā)生發(fā)展和血管形成密切相關。吳穎芳等［14］的研究表明，在一定范圍內，檳榔堿可以呈濃度依賴性抑制內皮細胞的增殖，這可能是OSF發(fā)生的原因之一。自噬對人體細胞的調節(jié)功能十分復雜，在受環(huán)境條件影響較少時，細胞自噬抑制細胞凋亡，然而，當自噬使細胞內蛋白和細胞器過量消耗，致使細胞無法繼續(xù)生存下去時，細胞自噬即會轉化成凋亡，其對血管生成的作用同樣具有兩面性［15］。自噬在口腔黏膜下纖維性變組織固有層血管病變中發(fā)揮的作用尚未見相關研究報道。

本實驗對正常頰黏膜及OSF早、中、晚期頰黏膜組織固有層中的LC3和P62蛋白分別進行檢測，結果顯示LC3主要表達于內皮細胞的胞核、胞質內，P62主要表達于內皮細胞的胞質、包膜內，正常組和OSF組中均可見表達。在OSF早期組中，LC3表達上調，P62表達下調，可能在OSF發(fā)病早期，血管內皮細胞對外界刺激通過激活自噬這種適應性反應自我調節(jié)，為細胞提供氨基酸、核苷酸等營養(yǎng)物質，加強細胞的存活能力。自噬在OSF早期很可能對內皮細胞起保護作用，促進血管新生，從而抵抗纖維化的發(fā)展。在OSF中期組中，LC3表達最高，P62表達最低，提示該階段自噬活性強，結合臨床，OSF中期患者通常表現為口腔黏膜固有層血管減少，顏色呈片狀灰白色改變，質地變硬，雙翼下頜韌帶及軟腭可捫及纖維條索，推測這可能是因為細胞自噬過度消耗胞內蛋白和細胞器，引起內皮細胞功能障礙，抑制血管新生，加速了纖維化的發(fā)展。在OSF晚期組中，LC3表達下調，P62表達上調，提示在該階段自噬活性減弱，且自噬降解功能受阻，導致P62在體內蓄積。其原因可能是因為外界刺激進一步加強，致使內皮細胞自噬轉化為凋亡，凋亡的內皮細胞具有促凝血作用，可以增強血小板的黏附性，促進血栓的形成，進一步加重局部的缺血缺氧情況，加重纖維化的發(fā)展，甚至可能導致OSF的惡性轉變。

綜上所述，在OSF早期，自噬可能表現為對內皮細胞的保護作用，改善局部的微循環(huán)，從而抵抗纖維化的發(fā)展；在OSF中期，自噬異常活躍，引起內皮細胞功能障礙，促進纖維化的發(fā)展；在OSF晚期，自噬被抑制，纖維化進一步加重。但自噬在OSF組織中對內皮細胞及血管形成的作用仍需要進一步的實驗驗證。本實驗為OSF的發(fā)病機理研究提供了新的思路。