C-met與Cox-2在口腔白斑和口腔鱗狀細胞癌組織中的表達研究

崔真真 柳志文

口腔鱗狀細胞癌（OSCC）是頭頸部常見的惡性腫瘤，占口腔頜面部惡性腫瘤的比例高80%，患者生存率低，預后差［1］。口腔白斑（OLK）是最常見的口腔角化異常，WHO定義其屬于癌前病變。研究表明，3%～17%的OLK會轉變為癌，異常增生程度越高，癌變風險越大［2］。目前臨床尚無有效預防OLK癌變的方法，早期發現OLK的惡性轉化，將對降低OLK癌變率和OSCC發生率具有重要意義。

研究表明［3-4］，環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，Cox-2）在促使腫瘤細胞發生轉移侵襲和增殖過程中與肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）／肝細胞生長因子受體（C-met）信號傳導通路有著密切的關系。目前C-met和Cox-2兩者在口腔黏膜病變中的相互作用，尚未見文獻報道。本研究采用免疫組織化學SP法對NOM，OLK以及OSCC組織中C-met和Cox-2蛋白進行檢測，探究C-met和Cox-2在OLK和OSCC中的表達情況及兩者的相關性，以期為OLK的早期癌變的診斷提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 標本選擇

OLK和OSCC標本均選自中南大學湘雅口腔醫院病理科蠟塊標本，10例NOM組織來自中南大學湘雅二醫院智齒拔除術患者組織。其中OLK 22例，輕度異常增生7例，中度異常增生7例，重度異常增生8例。OSCC 20例，高分化14例，中低分化6例。所有病例均經病理科2名中高級醫師確診，患者術前均未行放、化療。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗人多克隆C-Met抗體（1∶200；25869-1-AP）、兔抗人Cox-2單克隆抗體（1∶300；12375-1-AP，5869-1-AP，武漢三鷹有限公司）；S-P試劑盒（PV9001）、DAB顯色試劑盒（ZLI-9018，北京中山金橋）；光學顯微鏡（BA210T，中國麥克奧迪集團有限公司）。

1.3 實驗方法

試驗采用免疫組織化學技術免疫酶法。按下列操作步驟進行：脫蠟、水化；高壓煮沸抗原修復；阻斷滅活內源性過氧化物酶：3%H2O2；滴加一抗（C-met／Cox-2）（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照）；滴加生物素標記二抗37℃孵育30 min；DAB顯色；復染、各級酒精脫水、透明、封片、鏡檢。

1.4 判定標準

C-met和Cox-2表達于胞漿中，以細胞胞漿中出現定位明確、染色明顯的黃色或棕黃色顆粒為陽性。每張切片隨機選取5個高倍視野，每個高倍視野計數100個細胞，觀察陽性細胞染色強度，計數陽性細胞百分比。根據染色強度和陽性細胞數判定實驗結果。首先按染色強度評分：0分為無染色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；再按陽性細胞所占的百分比評分：陽性細胞＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。將染色強度記分和陽性細胞數得分相加為最后得分，0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為陽性（++），5～6分為強陽性（+++）。

1.5 統計學處理

采用SPSS 20.0統計軟件，各組間率的比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman法。統計學檢驗標準為P＜0.05。

2 結 果

2.1 C-met及Cox-2在NOM，OLK和OSCC中的表達

在OSCC中，C-met陽性表達率80%，高于OLK（45.5%）及NOM（10.0%），差異均具有統計學意義（P＜0.05）。Cox-2在OSCC中陽性表達率85.0%，高于OLK（54.5%）及NOM（10.0%）（表1）。

表1 C-met及Cox-2在3種組織中的表達Tab 1 The expression of C-met and Cox-2 in 3 types of tissue

2.2 C-met與Cox-2表達的相關性

C-met與Cox-2在OLK中表達呈正相關（r＝0.568，P＜0.05，表2），在OSCC中表達呈正相關（r＝0.480，P＜0.05，表3）。

表2 C-met與Cox-2在OLK中表達的相關性Tab 2 The relationship between expression of C-met and Cox-2 in OLK

表3 C-met與Cox-2在OSCC中陽性表達的相關性Tab 3 The relationship between expression of C-met and Cox-2 in OSCC

3 討 論

口腔癌是全球公共衛生問題，5年生存率約為50%［5］，口腔癌患者生存率低，預后差，因此對口腔癌的早期發現，尤其對癌前病變的診斷和干預極為重要。OSCC是口腔癌的常見類型，國內外的研究發現90%以上的OSCC是由口腔癌前損害發展而來，但是目前OSCC發病機制仍不清楚，因此需進一步研究OSCC的發病機制并尋求OSCC早期診斷及防治措施。

3.1 C-met蛋白

C-met蛋白是肝細胞生長因子的特異性配體，研究表明，C-met在甲狀腺癌，乳腺癌，肺癌和扁桃體鱗癌等呈現過度表達，在惡性腫瘤的發生發展以及侵襲轉移中起著重要的作用［6-9］。本研究發現C-met在NOM中微量表達，在OLK中呈部分陽性表達，在OSCC組織中呈強陽性表達，各組間C-met蛋白表達差異有統計學意義，支持C-met參與口腔黏膜病變惡變過程的觀點［10］。Sun等［11］研究發現C-met異常表達可通過ERK／c-Fos通路最終導致口腔黏膜病變惡變的發生，與本研究一致。

圖1 C-met和Cox-2在3種組織中的表達 （SP，×400）Fig 1 The expression of C-met and Cox-2 in 3 types of tissue （SP，×400）

C-met蛋白在OSCC的表達較OLK上皮細胞表達水平增高，提示C-met蛋白的表達強度與黏膜惡變程度有關，C-met蛋白的表達逐漸增強，提示與OLK進展惡化有關。與以往研究C-met在癌前病變及癌癥中表達逐漸上調的報道一致，并且與腫瘤的惡變程度有關的結果相符合［12-13］。C-met的過度表達可能發生在OSCC的早期階段。Szturz等［14］曾報道C-met表達隨口腔黏膜病變病理分化程度、OSCC惡性度的增高而增加，C-met的表達與OSCC患者預后密切相關。結合本實驗研究結果可推斷C-met蛋白表達與OSCC的發生發展有關，可作為一個潛在的檢測OLK惡變和早期OSCC的標志物。

3.2 Cox-2蛋白

本研究發現，Cox-2在NOM、OLK及OSCC中的陽性表達率明顯上調，陽性表達率分別為10%、54.5%、85%，差異均具有統計學意義。并且弱陽性和強陽性表達率也呈升高趨勢，與Seyedmajidi等［15］研究結果一致，提示Cox-2在口腔黏膜組織惡變的初始階段就已經參與并起到一定的作用，并且在口腔黏膜中的陽性表達率有隨著組織的惡變程度增強而表達增加的趨勢，可以初步判斷Cox-2蛋白與口腔的惡性病變程度相關。Wang等［16］發現Cox-2也是區分癌癥病理分期的良好標志物，Cox-2高表達患者往往預后較差，Cox-2高表達在食道癌，霍奇金淋巴瘤等中也有報道［17-18］。因此Cox-2有望成為癌癥早期診斷和預后判斷的標志物。同時Hsu等［19］發現通過敲除Cox-2可以抑制腫瘤細胞轉移，為癌癥治療提供新的治療思路。

3.3 C-met與Cox-2相互作用

近年來研究發現C-met與Cox-2在許多腫瘤中呈現高表達，它們協同參與了腫瘤的發生、發展以及侵襲轉移。Stabile等［20］通過體外實驗發現，C-met與Cox-2抑制劑聯合使用可以有效增強藥物的抗腫瘤作用。Byun等［21］研究發現C-met受體抑制劑可導致Cox-2表達下降；平行實驗發現抑制Cox-2可引起C-met表達下降。本實驗通過免疫組化方法研究OLK和OSCC中C-met與Cox-2的表達情況，經Spearman相關性分析，C-met與Cox-2在OLK（P＜0.05）和OSCC（P＜0.05）中分別相關。兩者的顯著相關性提示兩者在OLK以及OSCC的發生、發展中存在相互作用。

推測C-met與Cox-2相互作用主要通過以下2種途徑：HGF與C-met受體結合，通過C-met磷酸化和ERK1／2通路，誘發激活Cox-2表達和前列腺素合成，即C-met—ERK1／2—Cox-2軸［3-4］。Cox-2被激活后進一步激活EGFR刺激產生PEG2，PGE2與其受體相結合，通過EGFR通路和非HGF依賴型C-met磷酸化，進一步激活C-met，即Cox-2-PGE2-EGFR-C-met軸［20，22］。由此可以推測，C-met—ERK1／2—Cox-2軸和COX-2-PGE2-EGFR-C-met軸使得C-met與Cox-2在一個正反饋環中相互作用。C-met與Cox-2相互作用為進一步探討OLK癌變發病機制以及探尋OLK治療新途徑提供實驗依據，為OLK及OSCC雙靶向治療提供依據。