HEMA與牙本質膠原的相互作用研究

孫翔 余凡 許榮宸 李鋒 黃鸝

甲基丙烯酸羥乙酯（2-Hydroxyethyl methacrylate，HEMA）是牙科樹脂材料中的常見成分。作為親水性小分子，在牙科粘接劑中作為溶劑成分，可以改善粘接劑中親水／疏水單體之間的不匹配性，減少相分離［1-2］。HEMA含有一個可聚合的甲基丙烯酰基團及親水性基團，用于牙本質粘接時可以改善脫礦牙本質表面的潤濕性能，促進粘接劑在脫礦牙本質中的滲透，因此，HEMA可以說是一種粘接促進單體［1，3］。HEMA的親水性基團與牙本質具備一定的親和性，研究表明HEMA可以影響牙本質膠原的硬度和滲透性及熱穩定性［4-6］。牙本質經過HEMA處理后，更加耐酸蝕脫礦［7］。但目前并不清楚HEMA是通過何種作用來對牙本質的性質產生影響，關于其是否和脫礦牙本質膠原起到化學結合作用，也一直存有爭議［8］。本文旨在探討HEMA與牙本質膠原的作用形式。

1 材料與方法

1.1 傅立葉紅外光譜分析（fourier transform infrared spectrum analysis，FTIR）

新鮮拔除的健康無齲壞的第三磨牙，使用慢速切割機（沈陽科晶自動化設備制造有限公司）流水下磨除釉質，制備1 mm厚度的牙本質片，800目SiC砂紙打磨，37%磷酸完全脫礦，沖洗后完全干燥。在傅立葉紅外光譜儀（島津，FTIR-8400s，日本）上檢測處理前的牙本質膠原的紅外光譜圖，然后將試件浸泡到含HEMA的離心管中，處理10 min后超聲震蕩并用去離子水沖洗試件，吸水紙吸干后再次上機檢測得到處理后的紅外圖譜，圖譜的波長范圍為1 000～4 000 cm-1。

1.2 干重測試

在慢速切割機流水冷卻下將40顆牙齒釉質磨除，均勻磨除牙根表面1 mm厚度牙體組織后牙長軸方向縱切成2 mm厚牙本質片。在液氮中浸泡2 h后研磨成粉末，用0.5 mol／L EDTA（pH＝6.4）浸泡脫礦24 h該反應在4℃條件下進行以最大限度的維持牙本質膠原三維結構。然后將混合液在3 000 r／2 min 4℃條件下離心后棄掉上清液，使用去離子水沖洗后重復離心3次，孵箱脫水干燥后備用。稱取脫礦后干燥的牙本質粉末2 g左右，置于含HEMA的EP管中，浸泡1 h后10 000 r／4 min離心，棄掉上清液后重復3次，干燥后稱取每管中牙本質粉末干重，計算脫礦牙本質粉末反應前后質量變化情況。每組實驗重復6次。

1.3 分子對接模擬

分子對接采用MOE軟件中DOCK1模塊，由Protein Data Bank（PDB）數據庫中下載靶標蛋白I型膠原的3種晶體結構 據（PDB ID：4OY5，1CGD2，1QSU3），作為分子對接的受體。利用MOE中的Structure Preparation1模塊對I型膠原蛋白進行結構處理，包括修復缺失殘基原子以及非標準原子名稱等，然后利用Protonate 3D1模塊對蛋白進行質子化處理，分子力場采用AMBER12：ETH，溶劑化模型選擇Reaction Field（R-field）。通過MOE對HEMA的化學結構進行能量最小化，作為分子對接的配體。采用柔性對接方法對初始構象進行基于力場的能量優化，并采用GBVI／WSA dG的結合自由能打分方法獲得小分子構象的最優結合構象。

1.4 統計學分析

利用SPSS17.0軟件對脫礦牙本質與HEMA反應前后干重變化量進行配對t檢驗（檢驗水準 α＝0.05）。

2 結 果

2.1 FTIR

HEMA與脫礦牙本質反應前后紅外結果如圖1。與HEMA作用前可觀察到牙本質膠原的牙特征紅外峰酰胺I帶，位于1 634.44 cm-1，酰胺Ⅱ帶位于1 544.74 cm-1，酰胺Ⅲ帶位于1 238.36 cm-1，并未觀察到羥基磷灰石的磷酸特征峰，表明脫礦完全。當脫礦牙本質與HEMA作用后，酰胺I帶向低波數方向偏移，位于1 633.93 cm-1，同時在1 715.46 cm-1附近出現新的C＝O峰。

圖1 脫礦牙本質與HEMA反應前后紅外圖Fig 1 The FTIR diagram of demineralized dentin before and after the reaction with HEMA

2.2 干重測試

脫礦牙本質粉末與HEMA反應后平均干重顯著增加到2.008 2±0.002 8（P＜0.01）（表1）。

表1 脫礦牙本質與HEMA反應前后干重變化情況Tab 1 Dry weight changes before and after demineralized dentin reacts with HEMA

2.3 分子對接

通過分子對接，獲得小分子與I型膠原蛋白的結合模式。HEMA與3種I型膠原分子結構的二維和三維蛋白結合模式如圖2，小分子HEMA均以黃色著色，結合口袋中的熱點氨基酸殘基以青色顯示。從HEMA與I型膠原蛋白（4OY5）的結合模式二維圖中可以看到HEMA與蛋白形成了2個氫鍵相互作用，其中從直觀的結合模式三維圖上顯示小分子HEMA結構中的羰基氧原子與I型膠原蛋白上的氨基酸殘基Gly16的骨架氮原子形成氫鍵相互作用，羥基氧原子與蛋白上的氨基酸殘基Pro14的骨架羰基氧原子形成氫鍵相互作用，相應的結合自由能為-14.51 kJ／mol。從HEMA與I型膠原蛋白（1CGD）的結合模式二維圖中可以看到HEMA與蛋白形成了2個氫鍵相互作用，其中從直觀的結合模式三維圖上顯示小分子HEMA結構中的羥基氧原子與I型膠原蛋白上的氨基酸殘基Hyp14的羥基氧原子以及Gly12的羰基氧原子形成氫鍵相互作用。相應的結合自由能為-15.09 kJ／mol。從HEMA與I型膠原蛋白的結合模式二維圖（1QSU）中可以看到HEMA與蛋白形成了2個氫鍵相互作用，其中從直觀的結合模式三維圖上顯示HEMA結構中的羥基氧原子以及羰基氧原子與I型膠原蛋白上的氨基酸殘基Lys14的側鏈氮原子形成氫鍵相互作用。相應的結合自由能為-14.85 kJ／mol。

圖2 I型膠原蛋白與HEMA的相互作用三維圖Fig 2 The 3D mode of the reaction between type I collagen and HEMA

3 討 論

在牙本質粘接過程中，牙本質在磷酸或其他酸性單體的作用下，礦物質溶解，暴露疏松的膠原網，進而樹脂單體滲入并包裹膠原網，固化后和膠原一起形成混合層，產生微機械嵌合力，這是牙本質粘接的基本原理。因此，目前普遍認為牙本質粘接固位主要是依靠機械結合作用，膠原僅通過物理作用整合到混合層中。但是體外研究發現，HEMA處理后牙本質膠原的玻璃化轉變溫度上升，熱變性溫度降低，這表明HEMA可能與牙本質膠原起作用，從而影響到了牙本質膠原的結構特征［6，9］。

通過脫礦牙本質與HEMA反應的紅外可以看出，牙本質膠原的酰胺I帶向低波數方向偏移，這表明HEMA與牙本質膠原產生了相互作用，導致偏移［10］。同時在1 715.46 cm-1附近新出現的C＝O峰為HEMA的特征基團，這可能是因為HEMA通過物理吸附或化學作用結合到膠原分子上。本實驗中處理后的脫礦牙本質經過了10 min的超聲震蕩和流水沖洗，可以最大程度的牙本質淺層HEMA殘留的影響，排除物理吸附作用。

Pashley等［11］研究發現脫礦的牙本質可以吸收HEMA，但與牙本質膠原的膨脹狀態有關。在紅外實驗中使用的是脫礦后完全干燥的牙本質，由于失水后牙本質膠原纖維間的氫鍵作用，膠原網塌陷體積收縮，因此可能會降低HEMA與膠原分子的結合機率，并不利于觀測反應情況［12］。在干重實驗中使用低溫條件下制備的牙本質粉末進行反應，保持了膠原的三螺旋結構，同時增加了HEMA與膠原分子作用的機會，可以很好的觀察到二者的反應情況。干重變化實驗結果與紅外結果一致，脫礦牙本質粉末與HEMA反應后干重量增加，證實了HEMA與牙本質膠原的結合作用。

分子對接（molecular docking）是依據配體與受體作用的“鎖-鑰原理”，模擬小分子配體與受體生物大分子相互作用來進行藥物設計的方法，常用于藥物的設計篩選。本實驗通過分子對接可以預測HEMA與膠原分子的結合模式和親合力。牙本質中的I型膠原的結構有3種，氨基酸序列有一定差異［4OY5：（Gly-Pro-Hyp）10，1CGD：（PROHYP-GLY）4-（PRO-HYPALA）-（PRO-HYP-GLY）5，1QSU：（PRO-HYP-GLY）4-（GLU-LYS-GLY）-（PRO-HYP-GLY）5］，基本結合位點在第5個重復單位，即編號為13～15位的氨基酸［13］。對接結果顯示HEMA與3種I型膠原分子結構均能形成氫鍵作用，結合自由能均為負值，表明二者之間的相互作用可以自發進行。HEMA分子上的羰基氧原子和羥基氧原子具備較高的反應活性，可以和膠原分子氨基酸殘基上的骨架氮原子、羥基氧原子或羰基氧原子發生作用。Nishiyama等［14］使用13C NMR觀察HEMA與牙本質膠原的作用，認為HEMA與膠原的酯羰基間形成氫鍵，該作用能促進粘接劑單體與牙本質膠原的雜化，提高粘接界面的結合力。也有研究認為HEMA并不與膠原側鏈中的賴氨酸反應；但是脫礦牙本質與HEMA親和性好，可以大量吸附HEMA［4］。

盡管該實驗結果表明HEMA與牙本質膠原分子間通過氫鍵作用結合，但在實際牙本質粘接過程中，牙本質膠原中結合水的存在會影響HEMA與膠原活性基團的接觸。Hiraishi等［8］使用飽和轉移差譜核磁研究了水環境下二者的相互作用，并未觀察到信號轉移，表明水抑制了HEMA與膠原分子的直接相互作用。在濕粘接條件下，由于HEMA的蒸發速率為水的1／32，隨著水分的蒸發，HEMA濃度增加，降低了水的蒸發壓力，殘留水分不易揮發，導致膠原纖維間存在殘留水分［15］。而且在有水存在的條件下，HEMA在聚合前溶液形成凝膠狀；固化后吸水也會引起水潴留［16］。牙本質膠原周圍水與HEMA共存的狀態可以在一定程度上維持膠原網的疏松膨脹狀態，有利于樹脂單體的滲透，提高即刻粘接強度［17］。但殘留水分會增加膠原酶解和樹脂水解的風險，影響牙本質粘接的耐久性。因此，考慮到HEMA與牙本質膠原的復雜的反應環境，濕粘接條件下HEMA與膠原的氫鍵作用對粘接力的貢獻仍然有待進一步研究。