石油烴降解菌株的復配及其降解特性研究

高鵬飛,劉 虹，叢唯一，曾繁城，杜小彥，溫 鋼，付 凈

(1.吉林化工學院資源與環境工程學院，吉林 吉林 132022；2.吉林省環境科學研究院，吉林 長春130012；3.吉林化工學院生物與食品工程學院，吉林 吉林 132022)

石油污染是最常見的環境污染問題之一，石油是碳氫化合物和非碳氫化合物組成的復雜混合物，包括烷烴、環烷烴和芳香烴等多種物質[1]，其中苯、萘、蒽及它們的衍生物等均為具有致癌、致畸和致突變特性的潛在化學物質[2]。石油污染物一旦進入環境，將破壞土壤和地下水的物理化學性質及使用功能，且環境中石油污染物的有毒組分經食物鏈富集，會對人類健康構成威脅[3-5]。石油污染環境的修復技術通常有物理、化學和微生物技術。其中，微生物技術是一種高效、廉價、多功能的修復技術，其關鍵因素取決于土著微生物種群或接種的外源微生物菌群的降解能力[6-7]。通常，單一菌株很難將石油烴類物質完全降解，且其適應環境的能力較差。混合微生物群落通常具有更強大的生物降解潛力，因為多種生物的代謝特征不同，從而不同的菌株擁有不同的降解能力，如吸附能力、乳化能力等,且不同菌株間可能具備協同降解能力，所以將多種微生物復配、構成混合菌群，用于石油污染的微生物修復，將更有利于污染區域中石油烴的降解[8]。

關于石油烴微生物降解及微生物修復已有大量的研究，主要集中于石油烴降解菌株的分離、篩選、鑒定及其降解特性和機制等方面[9-10]。在石油烴降解菌株的復配方面，國內外已有研究報道了將不同種菌株混合用于油泥及石油污染土壤的修復，去除其中的總石油烴及多環芳烴，例如Kasakova等[11]將惡臭假單胞菌和紅球菌混合，用于油泥中多環芳烴等物質的降解，35 d對多環芳烴的降解率達到76%；Dhote等[12]將芽孢桿菌屬和假單胞菌共培養，用于降解油泥中的總石油烴，其降解率達到75%；Pacwa-Pociniczak等[13]采用枯草芽孢桿菌和假單胞菌共同修復石油污染土壤，與單菌株相比，兩種菌株聯合使用對總石油烴的去除率提高了3倍；Asadirad等[14]將枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌混合用于石油烴的降解，10 d對石油烴的降解率達77.5%。上述研究主要是將石油烴降解菌混合，研究混合菌株對石油烴或某種組分的降解效果，而未研究菌株間的復配比例及其協同降解作用，且采用的菌株主要有惡臭假單胞菌、紅球菌、芽孢桿菌屬、假單胞菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等。為此，本文選取新的菌株：微嗜酸寡養單胞菌YH、類產堿假單胞菌TM和紅球菌K1，將3種菌株以不同的比例進行復配，且對其間的協同降解作用進行分析，研究3種單菌株及其復配菌株對石油烴的降解效果，以為石油烴污染環境的微生物修復提供基礎數據和理論支持。

1 試驗材料與儀器

1.1 主要試驗試劑

LB液體培養基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.2。

無機鹽液體培養基：(NH4)2SO42 000 mg/L，K2HPO41 550 mg/L，NaH2PO4850 mg/L，MgCl2·6H2O 100 mg/L，EDTA 10 mg/L，FeSO4·7H2O 5.0 mg/L，ZnSO4·7H2O 2.0 mg/L，MnCl2·2H2O 1.0 mg/L，CaCl2·2H2O 1.0 mg/L，CoCl2·6H2O 0.4 mg/L，NaMoO4·2H2O 0.2 mg/L，CuSO4·5H2O 0.2 mg/L。

磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH值7.0)：39 mL 0.2 mol/L NaH2PO4·2H2O 溶液與61 mL 0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O 溶液混勻即得。

原油培養基：100 mL無機鹽液體培養基中加入1 mL柴油(0#柴油，中國石化)，濃度為7.7 g/L。

富集培養基：無機鹽液體培養基中加入5 g/L的葡萄糖，1 g/L的酵母膏，pH值7.0。

1.2 試驗菌株

菌株來源：試驗所用菌株從松原油田石油污染土壤樣品中篩選、分離而得。篩選、分離條件為：采集松原油田石油污染區不同地點土壤樣品進行混合，取土壤混合樣品10 g，用無菌水90 mL懸浮，磁力攪拌子高速攪拌10 min，再用8層紗布過濾掉雜物碎泥，靜止1 h。

首先取10 mL 懸浮液接入 100 mL富集培養基中，30℃、120 r/min 搖瓶培養10 d，由于采集的土壤樣品受到石油烴污染，其石油烴含量為10 mg/kg，所以不需要另外添加石油烴；然后取10 mL上述培養液接入100 mL原油培養基中，30℃、130 r/min搖瓶培養，待觀察到以上培養基中有混濁時，培養完畢，搖勻，再取培養液10 mL轉接至新的馴化培養基中搖瓶培養，反復轉接12次進行培養，馴化時間共計3個月；最后將馴化后的菌株懸液涂布于無機鹽固體平板上，以柴油為碳源，在30℃下培養3 d后，將長出的單菌株落接種至普通固體平板中進行劃線分離數次，30℃下培養，直至分至純菌株，接種斜面培養基保藏。分離、篩選出的3種優勢降解菌株，選擇同源性大于98%的基因序列，經16S rDNA鑒定，3種菌株分別為：微嗜酸寡養單胞菌(Stenotrophomonasacidaminiphila) YH、類產堿假單胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)TM和紅球菌(Rhodococcussp.)K1，冷藏保存。

1.3 主要儀器設備

試驗所用儀器設備為：LD4-2A 醫用離心機；氣相色譜儀(島津GC2014)；手提式壓力蒸汽滅菌器；SP-DJ系列垂直凈化工作臺HZQ-QX 全溫振蕩器；JMS-6700F 場發射掃描儀；DHG-9320A鼓風干燥箱；DPN-9082電熱恒溫培養箱。

2 試驗方法

2.1 菌落、菌體形態觀察

將3種菌株分別接種于LB液體培養基后130 r/min、30℃下振蕩培養24 h作為菌株懸液，分別將各菌株菌懸液稀釋至10-8后取50 μL涂布于LB固體平板，電熱恒溫培養箱中培養48 h，觀察菌落大小及其形態。

將3種菌株于LB液體培養基中培養至對數期，取40 mL于離心管中以6 000 r/min離心5 min，沉淀用磷酸鹽緩沖液清洗2次后，將菌體懸浮于磷酸鹽緩沖液中。各菌株采用JMS-6700F場發射掃描儀進行電子顯微鏡掃描成像，觀察菌株大小及其形態。

2.2 菌株的復配及其對石油烴的降解效果測定

石油烴降解菌株的復配試驗:將3種單菌株和兩兩組合以及3種菌株混合共組建了7個處理組，然后按照 1∶1的比例將菌懸液混合接種到含有2 000 mg/L 0#柴油的 100 mL培養基中，其中不加菌株作為空白對照，130 r/min、30℃下振蕩培養6 d后每隔1 d取7個不同菌株樣品和空白樣測定總石油烴(TPH)的殘留量，并計算總石油烴的降解率。試驗設2個平行樣。總石油烴降解率的計算公式如下：

(1)

式中：η為總石油烴的降解率(%)；C0為空白對照的石油烴質量濃度(mg/L);C1為降解后的石油烴質量濃度(mg/L)。

通過對比單菌株與混合菌株對石油烴的降解率的大小可以得出菌株間的協同與拮抗作用，再分別將3種菌株以不同的比例(YH∶TM∶K1)0.5∶1∶1.5、0.5∶1.5∶1、1.5∶0.5∶1、1.5∶1∶0.5、1∶0.5∶1.5、1∶1.5∶0.5進行復配，考察復配菌株對石油烴的降解效果。

2.3 復配菌株對石油烴的降解動力學研究

將最佳復配菌株接種到不同石油烴濃度(400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L、1 000 mg/L、2 000 mg/L)的菌懸液中，考察復配菌株對不同初始濃度石油烴降解效果的影響，并根據復配菌株對不同初始濃度石油烴的降解曲線，研究其降解動力學。

2.4 總石油烴(TPH)的測試分析方法

石油烴的前處理提取方法：取培養液樣品50 mL，加入10 mL正己烷進行液液萃取(萃取1次，不濃縮，回收率大于98%)。萃取后的有機相經無水硫酸鈉干燥后，采用配備氫火焰離子化檢測器的氣相色譜儀(GC-FID)測定總石油烴(TPH)的殘留量。

色譜條件：進樣口溫度為280.0 ℃，載氣為氮氣，壓力為59.5 kPa，總流量為37.7 mL/min；分流比為20.0；采用Rtx-1色譜柱，30.0 m×0.25 μm×0.32 mm，柱流量為1.65 mL/min，初始溫度80.0℃下平衡3.0 min，按8℃/min升溫速率升溫至100℃，再按10℃/min升溫速率升溫至200 ℃，最后按15℃/min升溫速率升溫至280 ℃平衡15 min，總程序為35.85 min；柱箱最大溫度為330 ℃；FID檢測器溫度為290.0 ℃；進樣體積為1.0 μL。

總石油烴(TPH)的定量分析：選取0#柴油作為標準油，用正己烷分別制備2 000 mg/L、1 000 mg/L、500 mg/L、250 mg/L、125 mg/L的溶液，并繪制其工作曲線，以色譜圖中總峰面積(y)對石油烴濃度(x)進行線性回歸，作標準工作曲線，兩者之間存在良好的線性關系，相關系數R2=0.998 6。本方法檢測限為10-6g/L。

3 結果與討論

3.1 菌落、菌體形態特征

3種石油烴降解菌株的菌落形態特征，見表1。

表1 3種石油烴降解菌株的菌落形態特征Table 1 Morphological characteristics of three petroleum hydrocarbon degradation strains

經電子顯微鏡掃描，3種石油烴降解菌株YH、TM、K1的形態，見圖1。

圖1 3種石油烴降解菌株YH、TM、K1形態的電子 顯微鏡掃描圖Fig.1 Electron microscopy scan of three petroleum hydrocarbon degradation strains(YH,TM,K1)

由圖1可見：菌株K1為球菌，菌體大小約為0.3 μm；菌株YH、TM為桿菌，菌體大小約為0.7 μm×1 μm。

3.2 復配菌株對石油烴的降解效果

將3種菌株中任意2種菌株和3種菌株分別進行等比復配，以確定降解過程中菌株間的相互作用，即通過菌株對石油烴降解率的大小可以確定菌株間的相互作用是協同還是拮抗，若協同則菌株混合后對石油烴的降解率會高于單個菌株對石油烴的降解率，拮抗則反之。通過研究菌株間的相互作用可以得出對石油烴降解效果更好的復配菌株，3種菌株中單菌株、任意2種菌株及3種菌株等比復配對石油烴的降解效果，詳見表2。

表2 3種菌株復配試驗及其對石油烴的降解效果Table 2 Three strains compounding experiments and their degradation effects on petroleum hydrocarbons

通過分析表2可知：任意2種菌株(1∶1)混合后對石油烴的降解率分別為84.5%、85.4%、86.2%，均高于單個菌株的降解率81.2%、79.8%、82.1%；3種菌株(1∶1∶1)混合后對石油烴的降解率為90.7%，均高于任意2種菌株(1∶1)混合后對石油烴的降解率，表明3種菌株的混合對石油烴污染環境具有更強的降解能力。

由于石油烴是一種復雜的混合物，含有多種烴類(正烷烴、支鏈烷烴、芳烴、脂環烴等)，一種微生物通常只對特定的石油成分具有較強的降解能力[15]，因此3種菌株復配對石油烴的降解效果明顯；同時，這表明微嗜酸寡養單胞菌S.acidaminiphilaYH、類產堿假單胞菌P.pseudoalcaligenesTM和紅球菌Rhodococcussp.K1 3種菌株因相互適應而在它們之間形成了一種協同降解石油烴的機制，因此在混合后表現出更佳的降解效果[16]。相關文獻研究表明：紅球菌在單一組分十二烷、十八烷、苯、甲苯、二甲苯和萘的培養基中生長良好，其中紅平紅球菌和慶笙紅球菌還能在芘的培養基中生長[17]；假單胞菌屬對正十四、正十五及正十六烷烴的降解率均達80%以上，且對正十六烷的降解率高達95.9%，對、芘、蒽和菲的降解效率分別可達86.0%、80.2%、91.4%和94.5%[18]。而關于微嗜酸寡養單胞菌降解石油烴以及以上3種菌株的復配菌株對石油烴的降解研究鮮有報道，僅有對石油烴降解菌株間協同降解的相關研究，如Patowary等[19]從印度的石油污染土壤中分離出多種石油烴降解菌株，并將這些降解菌株聯合使用，用于原油污染土壤的微生物修復，經過5周的降解試驗，對總石油烴的降解率高達84.15%，清除了大部分石油烴。

微生物菌株的復配比例是提高石油烴降解效果的關鍵所在，只有調整到最佳配置比例，才能獲得復合微生物菌株對石油烴的最佳降解效果，3種菌株以不同的比例進行復配對石油烴的降解效果，見圖2。

圖2 3種菌株不同的復配比例對石油烴的降解效果Fig.2 Degradation effect of different proportions of three strains on petroleum hydrocarbons

由圖2可見，3種菌株的復配比例(YH∶TM∶K1)為1∶0.5∶1.5時對石油烴的降解效果最好，其降解率高達94.3%。這可能是因為這3種菌株在該復配比例時能夠更好地相互利用營養源，單菌株產生的胞外酶和酶解基質的產物會迅速在環境中稀釋，不能為種群所利用，而多種菌株復配，種群間的微生物可以利用其他微生物產生的基質，促進彼此生長，從而進一步提高了石油烴的降解率[20]。

3.3 復配菌株對石油烴的降解動力學研究

石油烴濃度過大，將會對許多石油烴降解菌株產生抑制作用，甚至導致大量菌體死亡[21]；石油烴濃度過低，則不能為菌株提供充足的營養物質，使菌株生長受到限制。本文考察了當石油烴初始濃度分別為2 000 mg/L、1 000 mg/L、800 mg/L、600 mg/L、400 mg/L時復配菌株對石油烴的降解效果。復配菌株對不同初始濃度石油烴的降解曲線見圖3，通過對圖3的降解曲線進行擬合，得到復配菌株對不同初始濃度石油烴的降解動力學擬合方程和降解半衰期(t1/2)，見表3。

圖3 復配菌株對不同初始濃度石油烴的降解曲線Fig.3 Degradation curves of petroleum hydrocarbons with different initial concentrations by compound strains表3 復配菌株對不同初始濃度石油烴的降解動力學 擬合方程和降解半衰期Table 3 Kinetic fitting equations and degradation hafe life for the degradation of petroleum hydrocarbons with different initial concentrations by compound strains

石油烴的初始濃度(mg·L-1)降解動力學擬合方程反應級數t1/2/dR22 000y=-309.6x+2 045.003.40.9311 000lny=-0.447x+7.42712.70.994800lny=-0.434x+6.94912.20.976600lny=-0.411x+6.62312.20.982400lny=-0.391x+6.24612.40.991

由圖3和表3可見，復配菌株對不同初始濃度石油烴的降解效果有所差異，但降解率都高于90%，證明復配菌株對石油烴的降解效果良好；當石油烴的初始濃度為2 000 g/L時，復配菌株的降解動力學曲線與零級動力學過程的擬合效果良好，這表明石油烴殘留濃度隨著時間的增加呈線性降低；當石油烴的初始濃度分別為1 000 mg/L、800 mg/L、600 mg/L、400 mg/L時，復配菌株的降解動力學曲線與一級動力學方程的擬合效果良好，其降解半衰期t1/2為2.2～2.7 d。

4 結 論

(1) 本試驗選取新的菌株：微嗜酸寡養單胞菌YH、類產堿假單胞菌TM和紅球菌K1，對3種菌株以不同的比例進行復配，考察了單菌株與復配菌株對石油烴的降解效果。結果表明：復配后的菌株對石油烴的降解效果均優于單菌株，且3種菌株對石油烴具有協同降解能力。

(2) 通過對3種菌株不同的復配比例(YH∶TM∶K1)0.5∶1∶1.5、0.5∶1.5∶1、1.5∶0.5∶1、1.5∶1∶0.5、1∶0.5∶1.5、1∶1.5∶0.5時對石油烴的降解效果進行研究，結果表明：當復配菌株的復配比例(YH∶TM∶K1)為1∶0.5∶1.5時對石油烴的降解效果最好；初始濃度為2 000 mg/L的石油烴，加入復配菌株，在130 r/min、30℃下振蕩培養6 d后，總石油烴的降解率為94.3%。

(3) 復配菌株對石油烴的降解動力學研究表明：當石油烴的初始濃度為2 000 g/L時，復配菌株降解動力學曲線與零級動力學方程的擬合效果良好；當石油烴的初始濃度分別為1 000 mg/L、800 mg/L、600 mg/L、400 mg/L時,復配菌株降解動力學曲線與一級動力學方程的擬合效果良好，其降解半衰期為2.2～2.7 d。