不同超聲條件重組油體乳液制備及其穩定性研究

李 楊 孫禹凡 謝鳳英 閆世長 鐘明明 齊寶坤

(東北農業大學食品學院， 哈爾濱 150030)

0 引言

油體是植物種子中用來儲存油脂的細胞器，為種子發芽后生長提供能量。油體是由磷脂及油體結合蛋白包裹的液態甘油三酯形成的球體結構，直徑通常為0.5～2.5 μm。其中Oleosin蛋白是油體蛋白的主要成分，且蛋白含量最為豐富(占油體結合蛋白的80%～90%)，是一類疏水、堿性小分子蛋白，分子質量通常為16～24 ku[1]，在油體中起到穩定油體、阻止油體融合等作用[2]，是一種良好的乳化劑，可在節省原料的基礎上作為乳化劑形成穩定乳液[3]。文獻[4]分析了油體結構模型，發現Oleosin蛋白的中間疏水區以錨式結構插入甘油三酯內部和磷脂疏水酰基端，其N端和C端分布其表面。由于這種特殊結構，它們在極端條件下也不會發生聚集，即使從種子中分離出來，也會保持穩定[5]。然而，正是由于這種穩定性，天然油體較難封裝天然疏水性化合物，因而限制了其應用領域。

隨著仿生技術的發展和油體研究的不斷深入，文獻[6]通過混合甘油三酯、磷脂酰膽堿和Caleosin蛋白成功制備出重組油體，但由于Caleosin蛋白占油體結合蛋白的2%～3%[7]，因此制備途徑過于繁瑣復雜。為解決原料提取率低的問題，文獻[4]將油體結合蛋白中的主要成分Oleosin蛋白代替Caleosin蛋白制備重組油體，但由于Oleosin含有較長的疏水肽段，在水中溶解性較差，重組油體在6 h后便出現嚴重的乳析和聚集現象。雖然之前有學者構建了重組油體，但穩定性不佳，進而限制了重組油體的應用。

超聲是一種用于食品加工的新技術，具有安全、無毒、環保等特性[8]。根據其頻率范圍，超聲可分為低功率和高功率超聲[8]。低功率超聲一直用于確保食品質量和安全性，而高功率超聲則用于改變食品的功能特性，包括提高乳液的穩定性[9]。據文獻[10-11]報道，超聲不能改變蛋白的一級結構，但其二級結構會有微小的變化；超聲可以展開部分蛋白的三級結構，將巰基和親水基團暴露于蛋白表面，以提高蛋白質的溶解度，有利于乳液的形成。文獻[12]研究表明，超聲處理可以減小粒徑，促進可溶性蛋白質聚集體的形成，并促進在油、水界面處形成更強的膜，以增加乳液的穩定性。因此，超聲處理是輔助構建重組油體的一種有效手段。

本文采用超聲手段輔助模擬天然油體結構，以甘油三酯、磷脂和Oleosin蛋白為原料構建重組油體，探究超聲條件對構建重組油體乳液及穩定性的影響，明確重組的穩定和影響機制，以期為構建穩定的重組油體乳液提供理論基礎，并為后期重組油體運載功能性物質提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆(東農36號)，東北農業大學大豆研究所提供；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)，北京百奧萊博科技有限公司；蔗糖，天津科密歐化學試劑有限公司；異辛烷，天津市富宇精細化工有限公司；異丙醇、丁醇、甲醇、氯仿、丙酮、氫氧化鈉，天津市天力化學試劑有限公司；尼羅紅、尼羅蘭，美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

KC-701型超微粉碎機，北京開創同和科技發展有限公司；SB25-12 DTD型超聲波細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2600/2700型紫外-可見分光光度計，島津企業管理(中國)有限公司；Tanon-4800型全自動化學凝膠成像儀，上海天能設備有限公司；Nano-ZS90型粒度分析儀，英國馬爾文公司；PHSJ-4A 型實驗室pH計，中國上海雷磁公司；分析天平(0.000 1 g)，北京賽多利斯儀器系統有限公司；FD5-3型冷凍干燥機，美國SIM公司； J-810型圓二色譜儀，日本JASCO公司。

1.3 方法

1.3.1油體及Oleosin蛋白的提取純化

參照文獻[13]的方法，并作適當修改。將大豆和水以液料比5 mL/g浸泡在蒸餾水中，在4～6℃條件下放置18～20 h。用組織搗碎機以18 000 r/min磨漿90 s，用4層脫脂紗布過濾除去豆渣，并收集濾液。向濾液中加入20%的蔗糖溶液，冰水浴攪拌15 min，并調節溶液pH值至11，轉移到離心管中，在4℃條件下，19 000 r/min離心30 min，收集上層乳狀物，并重復此步驟2次。最后收集的上浮物就是大豆油體富集物。最后提取得到的上層乳狀物用去離子水清洗離心后即為大豆油脂體。放置于4℃冰箱中備用。天然大豆油脂體化學組成測定方法：含水率參考AOAC 930.15方法測定；游離脂肪酸含量參照AOCS Official Method Ca 5a-40方法測定；蛋白質含量參考AOAC 979.09方法測定；磷脂含量參考GB/T 5537—2008方法測定。每個樣品測定3次。

根據文獻[3]的方法進行Oleosin蛋白的純化。將處理后的大豆油脂體與3倍體積的乙醚混合后，以10 000g離心10 min除去中性脂質，該過程重復3次。將獲得的殘渣再用氯仿/甲醇(體積比2∶1)混合后，以10 000g離心10 min從Oleosin蛋白中去除磷脂。使用3倍體積的冰丙酮沉淀蛋白，輕輕搖動后，將試管以10 000g離心10 min，收集沉淀即為Oleosin蛋白。最后將Oleosin蛋白置于氮氣下以除去剩余的有機溶劑，冷凍干燥獲得凍干的Oleosin蛋白用于進一步分析。

1.3.2Oloesin蛋白SDS-PAGE電泳

采用文獻[14]的實驗方式并稍作修改，SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離膠質量分數為15%，濃縮膠質量分數為5%。將Oleosin蛋白溶于水配制成質量濃度為3 μg/mL的溶液，取樣品加上樣緩沖液煮沸5 min。上樣量15 μL，在80 V條件下運行30 min，進入分離膠后增至120 V。采用考馬斯亮藍溶液凝膠染色后進行脫色。

1.3.3重組油體乳液制備

經測得天然油體的蛋白質質量分數5.65%、磷脂質量分數3.67%、甘油三酯質量分數40.79%、含水率49.89%，故本實驗依照天然油體的組成構建重組油體，具體方法如下：將225 mg/mL Oleosin蛋白與150 mg/mL磷脂酰膽堿混合于50 mL錐形瓶中攪拌2 h后，加入1.8 g/mL大豆油，在1 000 r/min條件下粗均3 min，再將超聲波處理器的鈦探頭(直徑0.636 cm)插入液面下，距離錐形瓶底部1 cm處，頻率20 kHz、輸出功率分別為200、400 W下處理6、12、24 min，超聲波處理時間4 s，間隔時間2 s，并每隔5 min向冰水混合物中加入冰塊保持低溫,以未經超聲處理樣品作為空白對照。

1.3.4乳化活性及乳化穩定性測定

乳化性的測定參照文獻[15]的方法。將均質的乳狀液用0.1% SDS溶液稀釋100倍，在波長500 nm處用紫外分光光度計測定吸光度，并計算乳化活性指數(Emulsifying activity index，EAI)。靜置30 min后測定吸光度，并計算乳化穩定性指數(Emulsion stability index，ESI)。乳化活性指數和乳化穩定性指數計算公式為

(1)

(2)

式中E1——乳化活性指數，m2/g

E2——乳化穩定性指數，min

N——稀釋倍數，取100

C——乳化液形成前蛋白質水溶液中蛋白質質量濃度，g/mL

φ——乳化液中油相體積分數，%

A0——0 min時的吸光度

A30——30 min時的吸光度

1.3.5粒徑、ζ-電位測定

采用Malvern Zetasizer Nano ZS型電位儀測定乳液ζ-電位，利用Malvern Mastersizer 2000型激光粒度儀測定乳液的液滴直徑。稀釋比(以體積計)約為1∶1 000，乳液液滴的平均粒徑采用體積平均直徑D4,3來表示。所有的測試均在25℃條件下進行，平行測定3次。

1.3.6激光共聚焦顯微鏡成像

激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscopy，CLSM)的成像根據文獻[16]的方法并稍作修改，乳液樣品的測定在室溫(20℃)條件下進行，采用Ar/K和He/Ne雙通道激光模式，激發波長分別是488 nm和633 nm。尼羅紅和尼羅蘭分別以液料比1 000 mL/g溶解在異丙醇里，制成染色液。1 mL乳液樣品加入40 μL配制好的染色液，混合均勻，染色30 min，取一滴染色的乳液樣品放在帶凹槽的載玻片上，蓋上蓋玻片并用甘油密封。油鏡進行圖像采集，分辨率為1 024像素×1 024像素，圖像采集的范圍為5～45 μm(直徑)，避免玻片上污染物對圖像的影響。

1.3.7絮凝指數測定

乳滴絮凝指數(Flocculation index，FI)的測定根據文獻[17]的方法并稍作修改，將新制備和儲存24 h的重組油體乳液分別在蒸餾水、1% SDS下稀釋1 000倍，采用Malvern Mastersizer 2000型激光粒度分析儀對稀釋后的乳液粒度進行測定，每個樣品重復測定3次。測定參數設置為：測定溫度25℃，顆粒折射率1.520，顆粒吸收率0.001，分散劑為水，分散劑折射率1.330。試驗采用D4,3表征體積平均粒徑，絮凝指數計算公式為

(3)

式中D4,3-water、D4,3-SDS——乳液在水和1% SDS分散劑中的體積平均粒徑

1.3.8儲藏穩定性測定

重組油體乳液儲藏穩定性的測定參照文獻[18]的方法。取新鮮乳液至10 mL透明玻璃瓶中，封口密閉，置于室溫，避光儲存每隔7 d觀察一次，上層為乳析層，下層為清液層。乳層析指數(Creaming index，CI)計算公式為

(4)

式中Hc——下層清液高度，cm

Ht——整個乳化液的高度，cm

1.3.9圓二色譜分析

參照文獻[19]的方法并稍作修改，將新鮮的重組油體乳液在室溫下10 000g離心30 min，取出上層的乳化層，將乳化層與冷凍的丙酮(按液料比20 mL/g)在-18℃下反應2 h，離心分離(10 000g，15 min，4℃)得到沉淀的蛋白，之后用丙酮清洗5～6次，最后得到的蛋白沉淀進行冷凍干燥，得到界面蛋白的粉末。利用圓二色譜測定界面蛋白二級結構的變化，將樣品溶于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中(pH值7.4)，并用去離子水將樣品濃度稀釋到0.5 mol/L，25℃下，以100 nm/min掃描速率在190～260 nm范圍內掃描，樣品池光程為1 mm，分辨率0.1 nm。采用CD Pro曲線擬合軟件對數據處理分析求得二級結構相對含量，每組樣品重復測定3次。

1.4 數據統計分析

所有的實驗進行3次，結果表示為平均數±標準差，利用SPSS 22.0軟件對數據進行ANOVA差異顯著性分析，P<0.05為顯著性差異。采用Origin 9.1軟件等進行數據分析、圖表處理及圖譜分析處理。

2 結果與分析

2.1 天然油體分析及Oleosin蛋白SDS-PAGE

天然油體含有較高含量的甘油三酯，屬于一種高含油結構，僅需5.65%蛋白和3.67%磷脂的包裹即可保護油體的穩定，本實驗依照天然油體的組成構建重組油體，具體添加量為：225 mg/mL Oleosin、150 mg/mL磷脂酰膽堿和1.8 g/mL大豆油，在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.4)中進行油體的重組。

Oleosin蛋白SDS-PAGE圖譜如圖1所示，結果表明，采用文獻[13]方法所提取的Oleosin蛋白除去了油體表面大部分的其他結合蛋白，其中24 ku被認為是Oleosin蛋白，通過凝膠成像儀表明Oleosin蛋白質量分數高達95.6%，滿足實驗純度要求。

圖1 Oleosin蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE of Oleosin

2.2 乳化活性及乳化穩定性分析

乳化活性及乳化穩定性是表征乳狀液乳化特性及穩定狀態的最重要指標之一。其中EAI表示的是重組油體乳液形成油-水界面的能力，ESI是指乳狀液形成小液滴的穩定能力[20]。不同超聲處理條件下重組油體的EAI和ESI如表1所示，與未經過超聲處理的重組油體乳液相比，經過超聲處理后，重組油體的EAI及ESI明顯提高(P<0.05)。隨著超聲時間的延長，乳液的EAI和ESI也隨之增加，這可能是由于重組油體表面電荷分布發生變化[21]。在200 W超聲處理24 min時重組油體顯示出最大的EAI(652.2 m2/g)和ESI(605.2 min)，這是由于此條件下油-水界面層一部分被Oleosin蛋白占據，一部分被磷脂酰膽堿所占據，形成第1層穩定乳化膜；另外，超聲作用使Oleosin蛋白的疏水基團充分暴露，與磷脂通過疏水相互作用形成第2層乳化膜，因此EAI及ESI顯著提升。但當超聲功率增加到400 W時，乳液的EAI和ESI不再升高反而降低，可能是由于超聲處理使重油體的蛋白疏水基團暴露到極端環境中，出現一定程度的變性，形成不溶性蛋白質聚集體，由于聚集體表面電荷分布不均勻，因此吸附在油水界面層上的蛋白質含量下降，導致水包油型乳液乳化性降低。這與文獻[21]的研究結果一致。

表1 不同超聲處理制備重組油體乳液的EAI及ESITab.1 EAI and ESI of reconstruction oil body emulsion with different ultrasonic treatments

注：同列不同字母表示樣品差異顯著(P<0.05)，下同。

2.3 重組油體粒徑及微觀結構分析

采用動態光散射技術探究不同超聲條件制備重組油體乳液粒徑分布情況，并利用激光共聚焦顯微鏡技術觀察重組油體的聚集狀態，結果如圖2所示。數據顯示，未經超聲處理的樣品粒徑最大且出現了明顯的聚集，但隨著超聲條件的改變，乳液的粒徑減小，聚集現象有所改善。當超聲功率為200 W時，隨著超聲時間的增加，重組油體乳液的平均粒徑(表2)從448.3 nm減小到337.5 nm，這可能由于超聲時間延長導致的湍流現象延長，該湍流可以使大多數液滴得到有效破碎，從而使粒徑減小。當超聲功率增加到400 W時，重組油體的粒徑又增大，說明在該功率下可溶性蛋白聚集體通過共價鍵和非共價鍵結合重新聚集成不可溶性聚集體，弱化重組油體表面蛋白與磷脂酰膽堿間的疏水相互作用，導致乳液的穩定性降低。粒徑分布圖像呈現多峰分布的狀態，400 W出現聚集現象，說明較高強度的超聲處理會造成乳液無規律的聚集，不利于形成均一穩定的乳液。在200 W超聲波處理時，湍流和微流效應增加分子間的碰撞和聚集，在空化作用下形成微小液滴，尤其是延長超聲波時間至24 min后，變化更加明顯，平均粒徑只有337.5 nm，且共聚焦圖像表明

圖2 不同超聲條件下制備重組油體乳液激光共聚焦顯微結構及粒徑分布圖Fig.2 CLSM and particle size distribution of reconstruction oil body emulsion with different ultrasonic treatments

超聲功率/W超聲時間/minD4,3/nm水SDS水(72h)SDS(72h)FI/%FI(72h)/%6(448.3±19.2)e(348.1±11.2)e(531.8±7.3)e(403.5±5.5)e(28.7±1.4)cd(31.8±0.1)d20012(399.9±2.7)f(318.5±11.0)f(465.6±5.6)f(362.4±7.9)f(25.6±3.4)d(28.5±4.3)e24(337.5±4.6)g(291.2±6.3)g(415.9±4.6)g(338.7±3.5)g(15.8±0.9)e(22.7±0.1)f6(761.0±21.5)b(553.9±14.7)b(850.2±9.6)b(603.5±10.3)b(37.3±0.2)b(41.0±0.8)b40012(602.9±10.3)c(457.8±7.7)c(720.6±5.3)c(527.4±7.1)c(31.7±0.1)c(36.7±0.8)c24(497.9±17.0)d(423.7±4.2)d(604.5±7.1)d(498.3±4.9)d(17.5±2.8)e(21.3±0.2)f00(1717.0±58.2)a(781.9±22.7)a(1978.2±30.4)a(853.5±15.2)a(119.6±1.2)a(131.8±0.5)a

乳液整體分布比較均勻，顆粒度明顯較小，顯示其穩定性最好，這與表2中重組油體乳液的D4,3及FI變化趨勢一致。說明適當強度的超聲處理可以加速重組油體乳液的形成，這與文獻[22]結果一致。

2.4 重組油體的電位分析

乳液體系的穩定性可以通過ζ-電位的絕對值進行判斷，絕對值越高，分散粒子間的排斥力越大，越不易發生相互碰撞產生聚集，呈現出穩定的乳液體系。反之，絕對值越低，粒子間越傾向于相互吸引而發生聚集[23]。由圖3(圖中不同字母表示樣品差異顯著，P<0.05)可知，未經過超聲處理樣品的ζ-電位絕對值最低為7.9 mV，經過超聲處理后各樣品的ζ-電位絕對值均明顯增加。隨著超聲時間和超聲功率的增加, 重組油體乳液的ζ-電位絕對值呈現增大的趨勢，這與文獻[24]研究結果相一致。隨著超聲處理時間的增加，重組油體乳液的ζ-電位絕對值增加，這可能是由于長時間的超聲作用可以增強Oleosin蛋白與磷脂間的疏水相互作用，增加顆粒間的靜電斥力，導致乳液穩定性增加[25]。其中在超聲功率為200 W、超聲時間為24 min時，重組油體乳液的ζ-電位絕對值最高, 表明在此條件下重組油體乳液表面有較高的靜電斥力, 可防止液滴發生聚集, 此時制備的重組油體乳液具有較高的穩定性。

圖3 不同超聲處理制備重組油體乳液的ζ-電位變化Fig.3 Changes of ζ-potential of reconstruction oil body emulsion with different ultrasonic treatments

2.5 凝絮指數分析

除乳化能力外，油滴的凝絮狀態是影響乳液穩定性的另一個重要指標，乳液的凝絮指數可以間接地表示乳化體系的穩定程度[26]，表2為不同超聲條件下制備重組油體的FI和D4,3的變化。所有樣品的FI值均在72 h后出現增大的現象，這表明乳液72 h后均發生聚集現象。與未經過超聲處理乳液相比，經超聲處理的凝絮指數較小，且隨著超聲時間的增加，凝絮指數不斷降低。在超聲功率為400 W，超聲時間為6 min時乳液凝絮指數最大，這說明在此時重組油體乳液最容易發生聚集，表現出較弱的抗凝絮穩定性，該現象可能是由于超聲功率的增加導致油滴間相互作用力加強，Oleosin蛋白與磷脂酰膽堿之間的相互作用較弱，所形成的界面膜無法完全包裹油滴，使乳液不穩定。在超聲條件為200 W、24 min時重組油體的FI最小，此時蛋白質內部分子骨鏈結構伸展適宜，與磷脂酰膽堿結合緊密，形成的重組油體界面膜最穩定，能完全包裹油滴，延緩乳液凝絮現象的發生，這與激光共聚焦顯微鏡及電位數據結論一致。

2.6 重組油體儲藏穩定性分析

乳層析指數可以反映乳液在儲存過程中的穩定性變化[27]。由圖4可知，不同超聲處理制備的重組油體乳液在室溫儲存28 d后出現不同程度的分層現象，這表明不同超聲處理下制備的重組油體乳液儲存穩定性各有差異。其中，未經超聲處理的樣品乳層析指數最大為46.3%，這與表2中乳液的絮凝指數變化趨勢一致，說明乳液中的油滴發生了脂肪上浮現象[28]。相比之下，超聲處理制備的重組乳液在儲存期間顯示較好的穩定性，當超聲功率200 W、超聲時間24 min時顯示出最低的乳層析指數(25.5%)，表明它具有最佳的穩定性。

圖4 不同超聲處理制備重組油體乳液的乳層析指數變化曲線Fig.4 Changes of CI of reconstruction oil body estimated using circular dichroism spectra

2.7 圓二色譜分析

圓二色譜是一種精準分析蛋白質二級結構的常用手段，能夠在蛋白液體中直接測定[29]。測定結果如表3所示。經過不同超聲處理后，蛋白質的二級結構均發生了明顯的變化，其柔性結構增加，蛋白質分子由無序變得有序，其中α-螺旋降低，β-折疊、β-轉角和無規則卷曲升高，且相對含量變化較為明顯，這與文獻[30]的研究結果一致。文獻[31]研究發現β-折疊在蛋白質二級結構中可促進蛋白聚集和網絡結構的形成，因此隨著超聲功率的增加(400 W)重組油體中蛋白β-折疊結構相對含量增加較多，促進了乳液中表面蛋白空間結構伸展，有利于蛋白與蛋白之間的聚集，導致重組油體乳液的粒徑部分增大，與本研究粒徑的測定結果相一致。在超聲波處理條件200 W、24 min時，超聲處理表現出最小的α-螺旋相對含量(10.4%)和最高的β-折疊相對含量(33.0%)，可能是由于Oleosin蛋白和磷脂酰膽堿在此條件下相互作用更完全，結合其他數據變化趨勢表明這種結構的改變更有利于形成穩定的重組油體乳液。

表3 不同超聲處理制備重組油體乳液中蛋白質的二級結構相對含量Tab.3 Secondary structural contents of reconstruction oil body estimated using circular dichroism spectra

3 結束語

當超聲條件為200 W、24 min時，制備的重組油體乳液粒徑均勻穩定，激光共聚焦顯微鏡觀察到的乳滴形狀規則，表現出較好的乳化性和較低的乳層析指數。同時，超聲處理改變了重組油體蛋白的二級結構，從而使乳化能力得到提高，重組油體蛋白的α-螺旋結構相對含量最少，重組油體表面蛋白構象發生轉變，使其更易形成穩定的重組油體乳液。本研究發現，超聲功率為200 W、超聲時間24 min時所制備的重組油體乳液最穩定，該結果為重組油體的構建和應用提供了一定的理論依據。