貴州火龍果采后病害主要病原菌分離鑒定及抑菌植物精油篩選

張綠萍, 袁啟鳳, 解 璞, 王 宇, 王 彬

(貴州省農業科學院 果樹科學研究所， 貴州 貴陽 550006)

貴州省自2001年引種火龍果，目前已成為全國主要的火龍果產區之一，其中貴州羅甸和關嶺火龍果獲國家地理標志產品。隨著種植時間的延長和種植面積的擴大，火龍果栽培上病害發生日趨嚴重。而由于采前病菌侵染及采后果實衰老和抗性下降，病菌從潛伏狀態轉變為致病狀態而引起果實發病腐爛，加重了采后病害的發生。據報道，引起上海市進口火龍果軟腐致病真菌主要為尖孢鐮刀菌(FusariumoxysporumSchl.)和單隔鐮刀菌(FusariumdimerumPenzig in Saccardo)[1];海南火龍果采后主要病害有炭疽病〔ColletotrichumgloeosporioidesPenz.和C.capsici (Syd.)Butler & Bisby〕、根霉病〔Rhizopusstolonifer(Ehrenb.exFr.) Vuill.〕、焦腐病(Botryodiplodiatheobromaepat.)、仙人掌平臍蠕孢〔Bipolariscactivora(Petrak) Alcorn〕和革節孢菌〔Scytalidiumdimidiatum(Penz.) Sutton and Dyko〕，偶見鐮刀菌果腐病(Fusariumsp.)[2];廣西火龍果采后主要病害有木賊鐮刀菌〔Fusariumequiseti(Corda) Sacc.〕、桃吉爾霉〔Gilbertellapersicaria(Eddy) Hesselt.〕、鏈格孢〔Alternariaalternata(Fr.) Keissl.〕、仙人掌平臍蠕孢〔Bipolariscactivora(Petrak)Alcorn〕、新暗色柱節孢〔Neoscytalidiumdimidiatum(penz.) Crous et Slippers〕[3];云南火龍果采后果腐病主要有科桃吉爾霉(Gilbertellapersicaria)[4]；浙江紅肉火龍果采后貯藏期腐爛病主要有層生鐮刀菌(Fusariumproliferatum)和平頭炭疽菌(Colletotrichumfructicola)[5]。貴州作為全國最大的河谷火龍果產地和全國優質火龍果的主要輸出地，調查貴州火龍果的采后病害的種類和發生情況，以及研究其綠色防治方法，對減少采后損失，延長貨架期極為重要。因此，以貴州羅甸、關嶺、鎮寧采摘的火龍果為研究對象，應用分離培養、柯赫氏法則、形態學觀察、rDNA-ITS序列分析、分離鑒定病原菌；并篩選抑制火龍果采后病害適宜的精油種類及濃度，以期為火龍果采后健康環保的防腐保鮮措施和新型保鮮劑的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 果實 火龍果品種為紫紅龍和晶紅龍，2013-2015年從貴州羅甸、鎮寧采收，果皮表面無病害、無機械損傷。火龍果分別進行5～6℃冷藏或室溫貯藏，冷庫冷藏于15 d、20 d、25 d后觀察采后病害發生情況，室溫貯藏分別于采后5 d、7 d、9 d觀察采后病害發生情況。

1.1.2 試劑 肉桂精油、生姜精油、桔子精油、丁香葉精油、丁蕾精油、羅勒精油、香根精油均為單方精油，工業生產，購于國際香精香料公司，玻璃瓶封裝，4℃冰箱貯藏。培養基：PDA培養基(馬鈴薯葡萄糖培養基)：馬鈴薯浸汁200 mL；葡萄糖20 g，瓊脂20 g，121℃滅菌20 min。

1.2 病原菌的分離及形態學鑒定

采用組織分離法對發病火龍果的病原菌進行分離純化[6]，將純化后的菌株接種于PDA培養基上，28℃倒置培養，觀察菌落特征，在顯微鏡下觀察菌絲體形態、產孢結構、孢子形態、顏色、大小等特征，進行形態學鑒定。

1.3 致病性測定

根據柯赫法則進行致病性檢測。挑選健康的火龍果果實，先用清水清洗晾干，再用75%酒精對果實表面消毒，最后用無菌水沖洗3遍，晾干后備用。將從病果組織中分離純化獲得的真菌接種至PDA固體培養基上，28℃培養3～5 d備用。無傷接種：用無菌打孔器取直徑6 mm的菌落塊接種到果實赤道部位；有傷接種：用接種針在果實赤道部位刺傷(直徑約5 mm，深度約5 mm)，接種105CFU/mL的待測菌孢子懸浮液10 μL，置于溫度28℃，相對濕度90%的培養箱培養，每處理果實5個，重復3次，定期觀察發病情況，顯現病癥后再次分離鑒定。將分離出的菌株與所接菌株的菌落形態、菌絲形態、孢子形態等進行比較，并判斷是否一致。

1.4 植物精油對病原菌的抑制效果

選擇已有報道的對果蔬病原菌有較好抑制效果的肉桂、羅勒、姜油、丁香葉、桔子、丁蕾、香根等7種精油，采用熏蒸法研究其對貴州火龍果提純分離的致病微生物的抑制效果。

1.4.1 體外抑制試驗 將融化的PDA培養基倒入到平板培養皿中，每個15 mL。用無菌的打孔器在病原菌(培養7 d)平板上打取直徑為6 mm菌塊放入平板中央，將平板倒置，取一片無菌直徑為1 cm的濾紙置于平板蓋子中央，根據預試驗結果，用移液槍取肉桂精油2 μL、4 μL、8 μL滴于濾紙上，其他精油用移液槍取4 μL、8 μL、12 μL分別滴于濾紙上。以濾紙片不添加植物精油的平板為對照。將平板密封，放入28℃生化培養箱中培養7 d后觀察抑菌效果。“十字”法測量菌落縱橫徑，計算抑制率，每個濃度梯度3個平板，試驗重復3次。

抑制率=(C-T)/C×100%

式中，C為對照菌落面積，T為不同濃度條件下菌落面積。

1.4.2 活體抑制試驗 火龍果用 75%酒精進行表面消毒，晾干后，進行有傷接種和無傷接種。有傷接種：接種4個果，重復3 次，用接種針刺傷果皮，在傷口注射配制好的仙人掌平臍蠕孢、鏈格孢、桃吉爾霉、層生鐮刀菌、尖孢鐮刀菌5種孢子懸浮液5 μL，然后用體外抑制試驗中抑制效果較好的精油20 μL/L進行密閉熏蒸處理，室溫貯藏4 d后用軟尺測量病斑大小。無傷接種：接種30個果，在果實表面分別噴灑配制好的孢子懸浮液，用20 μL/L抑制效果較好的精油進行密閉熏蒸處理，室溫貯藏7 d后觀察火龍果腐爛情況。

2 結果與分析

2.1 發病情況

貴州火龍果采收后由于生理、病理、物理以及三者協同作用引起腐爛，表面著生大量微生物，主要病害為黑斑病和軟腐病(圖1)。

圖1 火龍果貯藏期主要病害癥狀

2.2 病原菌分離純化及鑒定結果

從火龍果發病部位共分離得到8株真菌，5株具有致病能力，產生典型病害癥狀，分別標記為HS1、HS2、HS3、HS4、HS5。其中HS3能使無傷果發病，且發病迅速，感染后3 d全果果皮腐爛，呈水浸狀。另外4菌株可使傷果發病，先褪色凹陷，然后在病斑處生長接種菌絲。

2.2.1 病原菌HS1 致病菌HS1在PDA培養基上菌落為圓形，絨毛狀，邊緣整齊，氣生菌絲白色，成熟后變為暗綠(圖2-1)。分生孢子梗叢生或散生，分枝有隔，頂部常見分支或合軸式延伸，褐色。分生孢子褐色，橢圓形或倒棍棒狀，表面光滑，具1～4個假隔膜，多數為2～3個假隔膜(圖2-2)。回接2 d，接種處呈擴大凹陷、周圍約2 cm的圓形褪色病斑(圖2-3)；接種5 d病斑略為擴大，軟腐，水浸狀，感病中心著生大量絨毛狀菌絲，外觀形態與PDA培養基相似(圖2-4)。參照李敏[2-3，7]特征描述，以及通過與真菌鑒定手冊的形態對比，HS1病原菌鑒定為仙人掌平臍蠕孢〔Bipolariscactivora(Petrak) Alcorn〕。

2.2.2 病原菌HS2 HS2病原菌在PDA培養基菌落呈圓形，初期菌絲灰白色，后變為灰綠色，培養基底面為黑色(圖3-1)。分生孢子梗直立、分枝或不分枝，淡褐色；分生孢子褐色或深褐色，呈梨形或橢圓形、卵形，形狀變化較大表面光滑或有瘤(圖3-2)。回接2 d，接種周圍約0.5 cm的圓形褪色；接種5 d病斑呈圓形擴大，軟腐，水浸狀，感病中心著生灰白色絨毛狀菌絲，外觀形態與PDA培養基初生菌絲相似(圖3-3、3-4)。參照林珊宇等[3，8-9]的特征描述，以及與真菌鑒定手冊的形態對比，HS2病原菌鑒定為鏈格孢〔Alternariaalternata(Fr.) Keissl.〕。

2.2.3 病原菌HS3 HS3病原菌在PDA培養基上生長迅速，培養3 d即布滿直徑為9 cm的培養皿,菌落無色，有大量黑色點狀孢子囊(圖4-1);分生孢子梗透明，無隔無分枝，頂部有圓形孢子囊(圖4-2)。回接2 d，病斑呈水浸狀擴大、無凹陷，病斑大小約2 cm×3 cm，接種5 d整個果實呈水浸狀腐爛，著生與PDA培養相似的菌絲(圖4-3、4-4)。參照林珊宇等[3-4]的特征描述以及與真菌鑒定手冊的形態對比，HS3病原菌鑒定為桃吉爾霉(Gilbertellapersicaria)。

圖2 HS1菌落形態、菌絲及分生孢子形態、回接2 d和5 d的致病癥狀

圖3 HS2菌落形態、菌絲及分生孢子、回接2 d和5 d的致病癥狀

圖4 HS3菌落形態、菌絲及分生孢子、回接2 d和5 d的致病癥狀

2.2.4 病原菌HS4和HS5 致病菌HS4、HS5在PDA培養基上生長速度相似，且均為絨狀、棉絮狀白色菌絲，HS4較為致密(圖5-1)，菌絲背面為淡黃色，在PDA培養基中分泌出淡黃色和紅黃色色素(圖5-2)。HS4的分生孢子梗為藍綠色，著生菌絲呈短小爪狀，透明有隔。分生孢子藍色，呈長橢圓形或新月形，多數2～3個隔膜(圖 5-3) 。回接2 d，接種處褪色，著生白色棉絮狀菌絲(圖5-4)；接種5 d，形成黃褐色、凹陷且邊緣清晰，著生白色致密絨狀微生物的病斑，病斑約2 cm×3 cm大小，其感病中心菌絲外觀形態與PDA培養基相似(圖5-5)。HS5較為疏松(圖6-1),在培養基中分泌黃色至橘黃色色素(圖6-1)，分生孢子淡藍色，鐮刀形，具3～5隔(圖6-2)。回接2 d，接種處呈擴大凹陷、形成約1 cm凹陷、軟腐圓形褐色病斑，中間著生白色菌絲(圖6-3)，接種5 d病斑約為直徑2 cm軟腐(圖6-4)，感病中心菌絲外觀形態與PDA培養基相似。參照崔志婧等[1，3，5]的特征描述，以及與真菌鑒定手冊的形態對比，將HS4、HS5病原菌初步鑒定鐮刀菌(Fusarium)。

為進一步鑒定HS4和HS5，利用PCR方法對病原菌基因組DNA進行ITS鑒定。真菌HS4的rDNA序列擴增產物測序，經blast比對和系統發育樹分析(圖7)，HS4與層生鐮刀菌(Fusariumproliferatum,登錄號636868)的ITS序列100%同源，HS5與尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum,登錄號MN181571)ITS序列的同源性為100%。

圖5 HS4菌落正面和反面形態、菌絲及分生孢子、回接2 d和5 d的致病癥狀

Fig.5 Morphology of HS4 positive and negative forms of colony, morphology of mycelia and conidia,and pathogenic symptoms of 2 d and 5 d grafting

圖6 HS5菌落形態、菌絲及分生孢子、回接2 d和5 d的致病癥狀

Fig.6 Morphology of HS5 colony, morphology of mycelia and conidia, and pathogenic symptoms of 2 d and 5 d grafting

圖7真菌HS4和HS5的分子系統樹

Fig.7 Molecular tree of fungal HS4 and HS5

2.3 植物精油對火龍果致病真菌的抑菌效果

2.3.1 體外抑菌效果 從表1看出，隨著精油添加量的增加，其抑菌效果也增加。對5種病原菌的抑制效果以肉桂精油的最佳，當精油添加量為6 μL時，對HS1、HS2、HS4、HS5的抑制率均達100%。其次是羅勒和丁香葉精油，精油添加置為12 μL時，對HS1、HS2、HS4和HS5的抑制率在80%以上；香根的抑制效果也較好，抑制率在80%左右；姜油和丁蕾對病原菌有一定的抑制效果，抑制率在60%左右；桔子精油對病原菌的抑制效果最差，抑制率低于50%。肉桂精油對HS3有抑制作用，在精油添加量為6 μL時，抑制率達96.71%；羅勒、丁香葉和姜油精油對HS3病原菌的有一定的抑制效果，但效果相對較差，在精油添加量為12 μL時抑制率分別為31.48%、29.14和3.96；桔子、丁蕾和香根精油對HS3病原菌無抑制效果。

表1 不同精油對火龍果采后主要病原菌的體外抑菌率

2.4 體內抑菌效果

將對各病原菌抑制效果較好的肉桂精油熏蒸無傷接種和有傷接種的果實，結果表明(表2)，肉桂精油熏蒸處理能抑制無傷接種的腐爛率，腐爛率與對照均呈顯著差異；減緩有傷接種病斑的擴大速度，病斑大小與對照呈顯著差異。HS3的致病性最強，有傷接種3 d，果皮50%面積出現水浸狀病斑，接種5 d全果腐爛；無傷接種4 d，50%以上果實表皮出現水浸狀病斑。此外，精油直接接觸果皮會造成藥害。

表2 肉桂精油熏蒸接種致病菌火龍果的腐爛率及病斑大小

注：不同字母表示差異顯著(P≤0.05)；有傷接種的腐爛率為100%，無傷接種的病斑不一定在接種點，因此沒有測量。

Note: Different letters mean significant difference (P≤0.05). The decay rate of inoculation with wound was 100%, and the lesion without wound inoculation was not necessarily at the inoculation site, so no measurement was made.

3 結論與討論

研究結果初步確定貴州火龍果采后主要病害致病菌為仙人掌平臍蠕孢、鏈格孢、桃吉爾霉、層生鐮刀菌和尖鐮刀菌，與廣東[7]、廣西[3]、海南[2]、云南[4]、浙江[5]等產區及上海市[1]進口火龍果的文獻報道有部分相似之處，也與朱迎迎等[10]統計的引起在我國火龍果釆后病害的真菌相符。另外，研究首次從同一軟腐病組織中分離層生鐮刀菌和尖孢鐮刀菌2種鐮刀菌。

精油是存在于植物體內的一類可隨水蒸氣蒸餾且具有一定氣味的揮發性油狀液體的總稱[11]。精油及其成分具有明顯的抑菌作用，其低毒且對環境影響小，可作為傳統化學殺菌劑的替代物用于果蔬貯藏保鮮[12]。植物精油作為植物源熏蒸類抑菌劑，已經用于多種果蔬采后病害控制的研究[13-15]。肉桂精油經美國食品香料和萃取物制造者協會(food spices and extract manufacturers associa-tion, FEMA)認證可作為食品香料使用，并獲得美國食品藥物管理局(food and drug administration, FDA)批準，FEMA號為2258，且已被納入中國《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》GB 2760-2014，進入允許使用的食品用天然香料名單，編碼為039。目前，肉桂精油在水果貯藏保鮮方面的應用已成為研究熱點[16-19]。試驗結果表明：7種植物精油中，對貴州火龍果采后5種致病菌的抑菌效果最好的是肉桂精油，其能有效降低腐爛率，減緩傷口病斑的擴增，試驗結果與劉瑞玲等[5]的肉桂精油對浙江產區火龍果采后主要致病菌層生鐮刀菌的抑制作用相一致。

研究結果可為貴州火龍果采后病害發生規律研究及進一步制定切實有效的采后病害綜合防治措施提供參考和依據。同時，根據精油的體內抑菌和體外抑菌效果，肉桂精油作為火龍果貯藏前及貯藏期熏蒸殺菌劑具有較好的應用前景，但生產上應用的最適宜濃度，避免藥害及有效熏蒸的放置點等參數還有待于進一步探索。