不同藥劑對茶赤葉斑病原菌的體外抑制效果

董照鋒, 程光祿, 曹秀榮

(1.商洛市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測中心， 陜西 商洛 726000； 2.鎮(zhèn)安縣達(dá)仁鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)站， 陜西 鎮(zhèn)安 711507)

商洛位于秦嶺南麓，地處暖溫帶向亞熱帶過渡帶，屬于暖溫帶半濕潤季風(fēng)氣候，是中國最北端茶區(qū)。特殊的生態(tài)環(huán)境、立地條件和耕作方式，形成了獨(dú)特的有害生物群體。2016—2017年，筆者所在課題組對商洛茶區(qū)病蟲害種類開展普查，弄清了茶樹病蟲害種類及主要病蟲害發(fā)生規(guī)律[1]，相繼開展茶云紋葉枯病、茶輪斑病、茶芽枯病的防治試驗(yàn)[2]。茶赤葉斑病(病原PhyllostictatheicolaPetch)是商洛茶園的重要病害，該病為高溫高濕性的病害，在商洛常年5—6月發(fā)病，盛發(fā)期為7—8月，夏季高溫干旱、秋天多雨有利于病害的發(fā)生流行。目前，對該病防治技術(shù)研究的文獻(xiàn)較少，胡淑霞等[3-4]研究表明，茶樹益微TBM對茶赤葉斑病的抑制可達(dá)到66.28%，500倍多抗霉素對茶赤葉斑病的抑制率為51.90%。王瑾等[5]研究表明，糖苷類和順-3-己烯醇、水楊酸甲酯、苯甲醇、苯乙醇、芳樟醇氧化物、香葉醇和芳樟醇7類物質(zhì)對茶赤葉斑病菌都有明顯的抑制作用，其中香葉醇的抑制作用最強(qiáng)，抑制率和物質(zhì)濃度有著明顯的線性關(guān)系。張華艷[6]研究表明，咖啡堿對茶赤葉斑病具有明顯的抑制，當(dāng)咖啡堿濃度在1～10 mg/mL,其抑制率為33.0%～100%。為有效控制茶赤葉斑病的危害，選取武夷菌素、多抗霉素、枯草芽孢桿菌、春雷霉素、戊唑醇5種藥劑開展茶赤葉斑病病菌的體外抑制試驗(yàn)，篩選優(yōu)質(zhì)、高效、低殘留的農(nóng)藥，以期為大田防治茶赤葉斑病提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 藥劑 2%武夷菌素AS，山東濰坊萬勝生物農(nóng)藥有限公司，2018年5月10日生產(chǎn)；3%多抗霉素AS，績溪農(nóng)華生物科技有限公司，2018年3月1日生產(chǎn)；6%春雷霉素WP，山東利邦農(nóng)化有限公司，2018年6月23日生產(chǎn)；100億芽孢/g枯草芽孢桿菌WP，德強(qiáng)生物股份有限公司，2018年2月22日生產(chǎn)；430 g/L戊唑醇SC，西安鼎盛生物化工有限公司，2018年1月2日生產(chǎn)。

1.1.2 培養(yǎng)基 1) 茶葉粉PDA培養(yǎng)基：自來水1 000 mL、馬鈴薯(去皮)200 g、葡萄糖20 g、茶葉粉(80目)15 g、瓊脂粉15 g。2) 清水瓊脂培養(yǎng)基：自來水1 000 mL、瓊脂粉15 g。

1.1.3 菌種 供試的病原菌由商洛市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心實(shí)驗(yàn)室提供，于2017年10月23日從山陽縣漫川鎮(zhèn)娘娘廟村賀家?guī)X萬福茶廠千畝有機(jī)茶園采集的典型癥狀新鮮病葉，進(jìn)行室內(nèi)分離、培養(yǎng)、鑒定后于4℃保存，每3個月對菌種活化1次。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的篩選 采用直接測量法測定菌落直徑，篩選最適宜的培養(yǎng)基。把菌種分別接種到PDA、茶葉粉5 g/L+PDA、茶葉粉10 g/L+PDA和茶葉粉15 g/L+PDA 4種培養(yǎng)基上。通過測量不同培養(yǎng)基菌絲直徑選出最適宜的培養(yǎng)基。

1.2.2 藥劑試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)共6個處理，4次重復(fù)，不同處理濃度按照藥劑使用說明推薦用量確定。處理1：430 g/L戊唑醇SC 90 μg/mL；處理2：6%春雷霉素WP 100 μg/mL；處理3：枯草芽孢桿菌WP 500萬芽孢/mL；處理4：2%武夷菌素AS 40 μg/mL；處理5：3%多抗霉素AS 60 μg/mL；處理6(CK)：滅菌水對照。將茶赤葉斑病菌絲或孢子接種于不同處理配置的含藥培養(yǎng)基中，于25℃、濕度90%恒溫恒濕條件下培養(yǎng)，測定5種藥劑對茶赤葉斑病菌絲及分生孢子的抑制效果。

1.2.3 藥劑對茶赤葉斑病菌絲及分生孢子抑制效果的測定 采用菌絲生長速率法[7-8]測定5種供試藥劑對菌絲的抑制作用。采用孢子萌發(fā)法[9-10]測定5種供試藥劑對孢子萌發(fā)的抑制作用。

1.2.4 含藥培養(yǎng)基制備及菌絲接種 為避免培養(yǎng)基快速冷卻，確保每個培養(yǎng)皿中可以加入足夠多的含藥培養(yǎng)基，在實(shí)際操作時，各處理一次性多配制2份含藥培養(yǎng)基。先將5個藥劑處理按照以下濃度配置，430 g/L戊唑醇SC 900 μg/mL、6%春雷霉素WP 1 000μg/mL、枯草芽孢桿菌5 000萬芽孢/mL、2%武夷菌素AS 400 μg/mL、3%多抗霉素AS 600 μg/mL。準(zhǔn)備好已滅菌的燒杯、培養(yǎng)皿、PDA培養(yǎng)基，無菌環(huán)境下用10 mL一次性注射器注入稀釋好的藥液6 mL于100 mL燒杯中，當(dāng)PDA培養(yǎng)基冷卻到500C左右時，再向燒杯中注入培養(yǎng)基54 mL，多次推拉注射器讓藥液充分混合均勻，最后用一次性注射器向9 cm培養(yǎng)皿中注入含藥培養(yǎng)基10 mL，制成含藥平板培養(yǎng)基，此時藥劑濃度為原濃度1/10。空白對照組為6 mL滅菌水和54 mL茶葉粉PDA培養(yǎng)基[11]。

選取在25℃、濕度90%恒溫培養(yǎng)5 d的活化菌種，在菌落周邊生長茂盛、均勻一致處用打孔器制備直徑6 mm菌餅，每皿1塊，植入茶葉粉PDA平板培養(yǎng)基中間位置，接種完畢，將各處理置入25 ℃、濕度90%恒溫恒濕條件下培養(yǎng)，分別于72 h、96 h、120 h、144 h、168 h用十字交叉法測量各皿菌落直徑，計(jì)算菌絲生長擬制率。

菌絲生長抑制率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑) ]×100%

1.2.5 孢子懸浮液制備及接種 取蒸餾水600 mL于1 000 mL燒杯中，用棉塞塞好并用繩子包扎好于121℃高壓蒸氣滅菌30 min，保存?zhèn)溆谩＿x用培養(yǎng)好的茶赤葉斑病原菌(培養(yǎng)20 d，已產(chǎn)生分生孢子)平板培養(yǎng)物1～2皿，在無菌環(huán)境下，用一次性注射器注入10 mL滅菌水。用一次性接種鏟輕刮菌落表面，用力按壓分生孢子器讓其破裂。將2張擦鏡紙放在滅過菌口徑為7 cm的小漏斗上，將孢子懸浮液過濾在滅菌的50 mL錐形瓶內(nèi)，重復(fù)過濾2次。在顯微鏡下觀察孢子懸浮液的孢子量，加滅菌水調(diào)節(jié)孢子濃度，當(dāng)每個視野能觀察到80～100個孢子時，孢子懸浮液制備完成[12]。

分生孢子采用水瓊脂培養(yǎng)法。為避免培養(yǎng)基快速冷卻，各處理制成4份含藥培養(yǎng)基。用一次性注射器吸取稀釋好的藥液4 mL于100 mL已滅菌的燒杯中，加入經(jīng)高壓蒸氣滅菌并冷卻到50 ℃左右的清水瓊脂培養(yǎng)基36 mL，讓藥液充分混合均勻，然后用一次性注射器吸取10 mL含藥培養(yǎng)基2份，分別注入2個滅菌的9 cm培養(yǎng)皿中，制成含藥平板培養(yǎng)基。空白對照組為4 mL滅菌水和36 mL清水瓊脂培養(yǎng)基，按上述方法制作2個對照平板培養(yǎng)基。平板培養(yǎng)基制好后，在每個培養(yǎng)皿背面用記號筆畫3個小圓圈標(biāo)記孢子懸浮液滴入點(diǎn)位置以便觀察。在3個小圈內(nèi)，每點(diǎn)滴1滴孢子懸浮液，即為3次重復(fù)。將各處理置于25 ℃、濕度90%恒溫恒濕條件下培養(yǎng)，在對照組80%～90%孢子萌發(fā)時，將對應(yīng)處理組全部取出立即放入4 ℃冰箱冷藏，終止孢子繼續(xù)萌發(fā)。然后逐一取出鏡檢統(tǒng)計(jì)各處理孢子萌發(fā)情況。每個點(diǎn)(即1個重復(fù))檢查3個視野，并對孢子萌發(fā)狀況進(jìn)行顯微拍照。

孢子萌發(fā)率=(孢子萌發(fā)數(shù)量/觀察孢子數(shù)量)×100%

孢子萌發(fā)抑制率=[(對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率)/ (對照孢子萌發(fā)率) ]×100%

1.2.6 殺菌劑不同濃度處理對菌絲的抑制試驗(yàn) 根據(jù)不同藥劑對茶赤葉斑病菌絲和分生孢子的抑制效果，篩選出抑菌效果較好的武夷菌素、枯草芽孢桿菌2種藥劑進(jìn)行濃度梯度試驗(yàn)，測定篩選藥劑的抑制作用。

1) 不同濃度武夷菌素對菌絲的抑制作用。試驗(yàn)共設(shè)置6個處理，各處理4次重復(fù)。處理A：65 μg/mL；處理B:40 μg/mL；處理C:30 μg/mL；處理D:20 μg/mL；處理E:10 μg/mL；處理F(CK)：滅菌水對照。含藥培養(yǎng)基的配制參照1.2.4進(jìn)行。

1.4 觀察指標(biāo) ①根據(jù)Barthel指數(shù)和Harris髖關(guān)節(jié)評分比較患者干預(yù)前后功能康復(fù)情況［2］。②根據(jù)視覺模擬疼痛評分（VAS評分）比較患者干預(yù)前后疼痛程度［3］。③根據(jù)焦慮自評量表（SAS評分）、抑郁自評量表（SDS評分）比較患者心理狀態(tài)［4］。

2) 不同濃度枯草芽孢桿菌對菌絲抑制作用。試驗(yàn)共設(shè)置6個處理，4次重復(fù)。處理a:500萬芽孢/mL；處理b:400萬芽孢/mL；處理c:300萬芽孢/mL；處理d:200萬芽孢/mL；處理可e:100萬芽孢/mL；處理f(CK)：滅菌水對照。含藥培養(yǎng)基的配制參照1.2.4進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜培養(yǎng)基

在溫度25℃，濕度90%條件下培養(yǎng)168 h，PDA 培養(yǎng)基、茶葉粉5 g/L+PDA培養(yǎng)基、茶葉粉10 g/L+PDA培養(yǎng)基和茶葉粉15 g/L+PDA培養(yǎng)基4個處理的茶赤葉斑病菌的菌落直徑分別為45.4 mm、49.3 mm、43.9 mm和44.8 mm，經(jīng)差異顯著性分析，茶葉粉5 g/L+PDA培養(yǎng)基的菌落直徑極顯著高于其余處理，該處理的菌落生長最快、長勢最好。因此，茶葉粉5 g/L+PDA培養(yǎng)基為最優(yōu)組合，后續(xù)的試驗(yàn)采用該培養(yǎng)基組合。

2.2 5種殺菌劑對茶赤葉斑病菌絲的抑制作用

從表1可知，處理1的抑制作用持久、穩(wěn)定、效果最好，72～168 h抑制率均為100%。處理3對菌絲抑制效果隨著處理時間的延長呈增強(qiáng)趨勢，在168 h的抑制率達(dá)94.43%。處理4在72～168 h抑制作用比較穩(wěn)定，抑制率為66.21%～69.57%。處理2和處理5的抑制作用較差。72～168 h，處理2和處理6(CK)的抑制作用差異均不顯著，與其余處理間的差異極顯著，處理1、3、4、5間的差異極顯著。

2.3 5種殺菌劑對茶赤葉斑病菌分生孢子的抑制作用

從表2看出，接種后22 h，處理6(CK)的孢子萌發(fā)率為55.07%。5個藥劑處理中，處理2對茶赤葉斑病菌分生孢子的抑制效果最好，抑制率為89.01%，萌發(fā)率為6.05%，與其余處理差異極顯著。處理5、處理1、處理3和處理4對茶赤葉斑病菌分生孢子的抑制率分別為47.90%、29.96%、28.57%和5.36%，抑制作用較差。處理2與其余處理分生孢子萌發(fā)率的差異達(dá)極顯著水平，處理1和3、處理4和6間差異不顯著。

表1 5種殺菌劑對茶赤葉斑病菌絲的抑制率

注：同列不同大小字母分別表示0.01、0.05水平差異顯著，下同。

Note: Different capital and lowercase letters in the same column indicate different difference at 0.01 and 0.05 levels respectively. The same below.

表2 5種殺菌劑對茶赤葉斑病菌分生孢子的抑制作用(接種22 h)

2.4 不同濃度武夷菌素和枯草芽孢桿菌對茶赤葉斑病菌絲的抑制作用

2.4.1 武夷菌素 從表3可知，5個濃度武夷菌素隨著時間的推移對茶赤葉斑病菌絲的抑制率呈逐漸下降趨勢，均在用藥72 h的抑制率最高，處理A、B和 C的抑制率都在60%以上。168 h 時，處理A、B、C、D、E的抑制率分別為69.55%、59.32%、48.82%、41.47%和35.70%，處理A的菌落直徑與其余處理差異極顯著。總體而言，高濃度的武夷菌素對菌絲抑制效果較好，但已超出了推薦使用的濃度。

表3 不同濃度武夷菌素和枯草芽孢桿菌對茶赤葉斑病菌絲的抑制率

2.4.2 枯草芽孢桿菌 5個濃度的枯草芽孢桿菌對茶赤葉斑病菌絲的抑制率隨著時間的推移呈增強(qiáng)趨勢，在168 h達(dá)到最高。在168 h，處理a、b、c、d和e對茶赤葉斑病菌絲的抑制率分別為94.49%、93.96%、93.44%、93.44%和92.39%，都具有較好的抑制作用。且5個處理的菌落直徑與對照差異極顯著，處理a和處理b差異不顯著；處理b、c和d間差異不顯著，與處理e差異顯著。

3 結(jié)論與討論

茶赤葉斑病菌的最佳培養(yǎng)基為茶葉粉5 g/L+PDA。430 g/L戊唑醇SC 90 μg/mL對茶赤葉斑病菌絲抑制作用最明顯，對病害控制見效快、效果明顯，在72～168 h抑制率均為100%。500萬芽孢/mL和400萬芽孢/mL枯草芽孢桿菌對菌絲抑制率達(dá)94.49%和93.96%，兩者之間差異不顯著。2%武夷菌素AS 65 μg/mL對菌絲抑制率為69.55%，也具有較好的抑制作用。6%春雷霉素WP 100 μg/mL對孢子抑制效果最好，22 h時抑制率達(dá)89.01%。春雷霉素主要用于茶赤葉斑病的早期預(yù)防，戊唑醇和枯草芽孢桿菌用于發(fā)病茶園的防治。對于茶赤葉斑病重發(fā)茶園，建議使用430 g/L SC戊唑醇90 μg/mL與6%春雷霉素WP 100 μg/mL混配進(jìn)行防治。董照鋒[12]研究表明，春雷霉素與枯草芽孢桿菌混配會降低枯草芽孢桿菌對菌絲的抑制作用，建議在茶赤葉斑病重發(fā)茶園防治時可采用400萬芽孢/mL枯草芽孢桿菌與6%春雷霉素WP 100 μg/mL間隔10～15 d交替使用。

在試驗(yàn)中90 μg/mL戊唑醇430 g/L SC抑制率達(dá)100%，由于試驗(yàn)濃度遠(yuǎn)低于推薦使用濃度，因此未對其開展梯度試驗(yàn)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多抗霉素水劑對茶赤葉斑病的分生孢子有致畸作用，其畸形率達(dá)16.66%，主要表現(xiàn)為芽管明顯偏短，部分芽管嚴(yán)重畸形，局部膨大似水葫蘆狀，關(guān)于其機(jī)理還需要進(jìn)一步試驗(yàn)研究。雖然高濃度的武夷菌素對茶赤葉斑病菌絲抑制作用較好，由于超出了推薦使用濃度，生產(chǎn)中不建議使用。茶赤葉斑病原菌體外抑制試驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的，因此，篩選出的防治藥劑或配方還需大田進(jìn)一步試驗(yàn)。