高粱炭疽病抗性機理研究進展

鄧小鋒， 彭 秋， 李青風， 劉天友

(貴州省農(nóng)業(yè)科學院 旱糧研究所， 貴州 貴陽 550006)

高粱〔Sorghumbicolor(L.)Moench〕是世界第五大作物，廣泛用于飼料、糧食、釀造加工和能源等行業(yè)。高粱炭疽病是世界性病害，近年來，其流行區(qū)域不斷擴展，我國各高粱主產(chǎn)區(qū)，包括貴州省的栽種區(qū)均有發(fā)生，且病情嚴重，給高粱品種選育帶來巨大壓力。目前國內(nèi)外專家學者已對該病害進行了大量研究。以高粱作原料的白酒釀造是貴州省的支柱產(chǎn)業(yè)之一。目前，貴州省高粱種植區(qū)主要位于遵義、仁懷、金沙和安順等市縣，2018年全省高粱種植面積不少于8.67萬hm2，包括4萬余hm2有機高粱[1]，品種幾乎都是當?shù)氐某Ｒ?guī)高粱品種。現(xiàn)今除外省選育的一些雜交糯高粱品種對炭疽病有一定抗性外，貴州省內(nèi)常規(guī)糯高粱品種幾乎對炭疽病都沒有穩(wěn)定抗性。現(xiàn)全省除貴州省農(nóng)業(yè)科學院已開展炭疽病相關研究外，還未見其他單位有相關研究報道。貴州省內(nèi)生產(chǎn)的高粱主要作為釀酒原料，但省內(nèi)選育的高粱優(yōu)良品種數(shù)量少，雜交種更少。開展高粱炭疽病抗性研究和抗性育種對滿足貴州省白酒釀造產(chǎn)業(yè)對綠色、有機高粱原料的不斷需求，推動貴州省山地農(nóng)業(yè)的發(fā)展及高粱生產(chǎn)向“高效、綠色、有機”方式的轉(zhuǎn)變具有重大意義。鑒于此，對20世紀80年代以來國內(nèi)外有關高粱炭疽病抗性機理的研究進行梳理，從高粱炭疽病危害特征、抗性資源鑒定、病原菌侵染機理、抗性機理及抗性育種等方面進行總結(jié)，以期為貴州省相關領域研究和高粱育種提供借鑒，并為高粱產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展提供參考。

1 高粱炭疽病的危害特征

高粱炭疽病是由禾生炭疽菌(ColletotrichumsublineolumP. Henn.，Kabát and Bubák)侵染導致的病害，1902年在西非首次報道，各國高粱栽種區(qū)均有發(fā)生。該病害在高溫潮濕地區(qū)易流行，是高粱最具毀滅性的病害之一[2-3]，病害嚴重發(fā)生時感病品種籽粒和莖稈產(chǎn)量減產(chǎn)達67%，其中，籽粒產(chǎn)量減產(chǎn)36%[4]。近年來，該病害在貴州高粱栽種區(qū)發(fā)生趨勢加重。

高粱生長發(fā)育各階段炭疽菌都能侵染其所有地上組織，其中，以葉部病害最為常見，病癥先從下部葉片開始出現(xiàn)，且孕穗期癥狀開始明顯。即在葉片上出現(xiàn)細小圓形、橢圓形、方形的斑點或細長病變，有紅色、褐色或者黑紫色邊緣；隨著病情發(fā)展，感病品種的病斑上出現(xiàn)黑色小點，即炭疽菌分生孢子盤，周圍的組織逐漸死亡并連成片，最終使葉片枯萎，葉片的光合作用與物質(zhì)合成能力逐漸喪失。分生孢子可通過水流或氣流傳播至附近的葉片上進行危害；此外，帶菌種子也是重要的傳播方式[5]。田間高粱葉片和莖稈殘體中的菌核是主要的初侵染源[6]。

2 高粱炭疽病抗性資源的鑒定

在高粱生產(chǎn)上要實現(xiàn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的目標，對區(qū)域內(nèi)主要病害炭疽病的研究和監(jiān)測是一項必然要求，此外取決于高粱品種本身的生產(chǎn)潛力，特別是抗病穩(wěn)定性。CHALA等[7]研究發(fā)現(xiàn)，炭疽菌的遺傳多樣性豐富，存在不同的生理小種，選育對多個生理小種有穩(wěn)定抗性的高粱品種比較困難，因此鑒定篩選對種植區(qū)生理小種有穩(wěn)定抗性的高粱材料或品系是進一步開展研究和品種選育的基礎。國際半干旱作物研究中心于1982—1991年先后對1.3萬余份資源和品系進行鑒定發(fā)現(xiàn)，有11個材料在印度和非洲多年表現(xiàn)出對高粱炭疽病的穩(wěn)定抗性[8]。美國國家植物種質(zhì)庫保存有4.3萬余份高粱資源，美國農(nóng)業(yè)部熱帶農(nóng)業(yè)研究站、南方平原農(nóng)業(yè)研究中心從2003年起，持續(xù)對多份資源進行系統(tǒng)鑒定發(fā)現(xiàn)，抗性資源絕大部分來源于非洲國家[9-15]。姜鈺等[16]從2013年開始對我國北方高粱育種上廣泛應用的優(yōu)良高粱種質(zhì)資源或品系進行鑒定，從中篩選得到抗炭疽病材料51份。PROM等[17]采用18個高粱品種作為鑒定系統(tǒng)進行不同生理小種的鑒定。

炭疽菌菌株間遺傳多樣性豐富，不同地理位置區(qū)域內(nèi)的炭疽菌存在多個專化型或生理小種，且同一地理位置區(qū)域內(nèi)的菌株間異質(zhì)性也很高[17]。目前，雖然已經(jīng)測定炭疽菌的基因組序列[18]，但還未見有關菌株間高異質(zhì)性原因的研究報道。

貴州省農(nóng)業(yè)科學院旱糧研究所在鑒定高粱炭疽病抗性資源方面做了一些工作，先后收集了多份貴州地方高粱資源，并選送資源到吉林鑒定中心進行鑒定；同時，與貴州省農(nóng)業(yè)科學院品種資源研究所合作，陸續(xù)對收集的地方資源進行抗性鑒定，并得到一些高粱抗病材料[19]。但貴州省內(nèi)缺乏一套可行的高粱鑒定標準系統(tǒng)，相關研究與育種還遠不能滿足貴州省內(nèi)高粱產(chǎn)業(yè)的發(fā)展需求。目前，未見有關貴州高粱種植區(qū)高粱炭疽病調(diào)查、炭疽菌遺傳多樣性及生理小種方面的研究報道，也未見有關貴州省高粱品種炭疽病抗性系統(tǒng)鑒定的報道。

3 高粱抗炭疽菌侵染的機理

3.1 抗性反應

炭疽孢子在高粱葉片上一般9～12 h后開始侵染。先萌發(fā)形成附著胞，然后穿入葉片表皮細胞的細胞壁和膜形成侵染囊泡。若宿主有抗性，2～3 h后受侵染細胞和鄰近細胞開始積累高濃度3-脫氧花色素；若無有效抗性，侵染囊泡接著發(fā)展出主菌絲和次生菌絲侵入鄰近的表皮和葉肉細胞，最后形成分生孢子盤。

NICHOLSON等[20]于1987年在細胞囊泡的內(nèi)含物中首次發(fā)現(xiàn)3-脫氧花色素，其是一類植物抗毒素。內(nèi)含物破裂后3-脫氧花色素被釋放到細胞中抑制炭疽菌的生長[21]，或者殺死真菌和植物細胞本身，阻止其向臨近細胞侵染[22-23]。目前已鑒定出高粱中含有至少5種3-脫氧花色素：芹菜定、木樨黃定、5-氧芹菜定糖咖啡酸酯、5-甲氧基木樨黃定和7-甲氧基芹菜定[24]。抗病材料和感病材料積累的3-脫氧花色素種類或者濃度不同。NICHOLSON等[20]發(fā)現(xiàn)，某些抗病材料的細胞可積累芹菜定和木樨黃定2種3-脫氧花色素，而感病材料細胞只能積累芹菜定。WHARTON等[24]研究發(fā)現(xiàn)，一些感病材料的表皮細胞雖然也分泌囊泡內(nèi)含物，但顏色淺、3-脫氧花色素濃度低，對病菌的生長沒有明顯抑制作用；在某些感病品種中未檢測到木樨黃定和5-甲氧基木樨黃定。LO等[25]研究證明，木樨黃定和5-甲氧基木樨黃定2種植物抗毒素對真菌的毒性大于芹菜定、5-氧芹菜定糖咖啡酸酯和7-甲氧基芹菜定。從時效看，一些感病材料應答時間晚，受侵染后66 h才合成3-脫氧花色素；而抗病宿主在侵染囊泡剛形成時細胞內(nèi)就開始產(chǎn)生含高濃度3-脫氧花色素的內(nèi)含物[22-23]。

BASAVARAJU等[26]發(fā)現(xiàn)，高粱對炭疽菌的抗性反應，細胞除合成3-脫氧花色素外，還可合成H2O2及富羥脯氨酸糖蛋白(Hydroxyproline-rich glycoproteins，HRGP蛋白)。炭疽孢子侵染囊泡剛穿透宿主細胞壁，抗性材料宿主細胞就合成H2O2和3-脫氧花色素阻止病菌增殖，而感病材料在接種后第5天才合成H2O2，導致葉片組織壞死。HRGP蛋白作為植物細胞壁的重要組成部分，病菌侵染時會被誘導合成，加強細胞壁的結(jié)構(gòu)，是一種快速防御機制[27]。BASAVARAJU等[26]還發(fā)現(xiàn)，高粱受炭疽孢子侵染位置的細胞壁可形成乳突、胼胝質(zhì)沉積和蛋白質(zhì)交聯(lián)；只在抗性材料中觀察到HRGP蛋白。抗性和半抗性材料中形成乳突、胼胝質(zhì)沉積和蛋白質(zhì)交聯(lián)的現(xiàn)象明顯多于感病材料。

黃酮類物質(zhì)在宿主防御體系中起著重要作用。如高粱植株受炭疽菌侵染20 h后，可檢測到黃酮Apigenin(芹菜素)和Luteolin(木犀草素)的積累，其能顯著抑制炭疽孢子的萌發(fā)[28]。

已有研究表明，植物防御炭疽菌侵染包括合成3-脫氧花色素、H2O2、HRGP蛋白及黃酮類物質(zhì)，細胞壁形成乳突、胼胝質(zhì)沉積和蛋白質(zhì)交聯(lián)等多種方式。抗病和感病材料的差異表現(xiàn)在能否快速合成上述物質(zhì)或形成類似結(jié)構(gòu)。感病材料對抗炭疽菌侵染存在2種情況，一是細胞合成的防御物質(zhì)種類少或者濃度低，無法有效地殺死或阻止炭疽菌；二是完全無法合成防御物質(zhì)，推測其原因可能是相關功能基因的無效突變，或入侵炭疽菌能夠抑制宿主細胞的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，使宿主細胞無法及時調(diào)控下游防御系統(tǒng)功能基因的表達。

3.2 應答脅迫分子機理

代謝組學分析顯示，高粱受炭疽菌侵染后，合成最多的次生代謝產(chǎn)物是類黃酮化合物、苯丙烷類代謝途徑化合物及色氨酸代謝途徑化合物[29]。類黃酮化合物包括花青素、3-脫氧花色素和黃酮類3種。3類物質(zhì)的合成從共同的前體Naringenin(柚皮素)開始。該類化合物的合成途徑是苯丙烷類代謝途徑的一個分支，通過研究確定了多個反應步驟的酶，許多酶的編碼基因已經(jīng)克隆。總結(jié)前人研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，類黃酮化合物合成有4條途徑(圖1)[30]：花青素合成途徑(A)、3-脫氧花色素芹菜定合成途徑(B)、木犀黃定的合成途徑(C)及黃酮類物質(zhì)芹菜素和木犀草素的合成路線(D)。

由圖1看出，查爾酮在查爾酮異構(gòu)酶的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)殍制に睾螅诤罄m(xù)不同酶的調(diào)控下，分別合成花青素、3-脫氧花色素和黃酮，以滿足自身生長和抵御外界生物脅迫的需求。正常光照條件下，植物合成花青素，而3-脫氧花色素的合成不需要光照[31-32]。當光照和病菌侵染同時存在時，植株先合成3-脫氧花色素，而抑制花青素的合成。研究顯示，參與該合成途徑的酶基因PAL(Phenylalanine ammonia lyase，苯丙氨酸氨裂解酶)和CHS(Chalcone synthase，查爾酮合成酶)的表達上調(diào)，而負責合成花青素的酶基因F3H(flavanone 3-hydroxylase，黃烷酮3-羥化酶)、DFR(dihydroflavonol 4-reductase，二氫黃酮醇4-還原酶)和ANS(anthocyanidin synthase，花青素合成酶)的表達被抑制，從而應對病菌的侵染[31]。雖然F3’H(flavonoid 3’-hydroxylase，類黃酮3’-羥化酶)同時參與花青素和3-脫氧花色素的合成，但該基因家族不同成員執(zhí)行不同角色。已克隆的2個F3’H基因，1個參與光特異性的花青素的積累，1個參與特異性病害反應的3-脫氧花色素的合成[33]。對炭疽菌不同抗性品種2個基因表達模式不同。遭受侵染時，抗性品種CHS和PR-10(pathogenesis-related protein，病程相關蛋白)基因的上調(diào)表達更早[34]，而感病品種2個基因的表達于侵染后24 h開始，但其他非致病菌侵染時，2個基因的表達于侵染6 h后開始[35]。據(jù)此推測，炭疽菌對感病品種調(diào)控該途徑的信號傳導系統(tǒng)有抑制作用。

圖1 類黃酮化合物的合成途徑

從生化和分子層面的研究結(jié)果看出，類黃酮物質(zhì)及其合成途徑、上游信號途徑和合成步驟相關酶基因的表達調(diào)控途徑是高粱防御炭疽菌侵染的核心組分之一。MIZUNO等[36]報道，高粱葉片在切割脅迫后邊緣至少可以呈現(xiàn)3種顏色：紫色、棕褐色和淺棕色，其均與類黃酮物質(zhì)合成途徑的缺陷有關。若高粱材料只合成3-脫氧花色素，不能合成黃酮，則呈紫色，其對應基因FNSII的無效突變；能正常合成2種黃酮，不能合成3-脫氧花色素，則呈棕褐色，其對應基因FNR的無效突變；若只能合成1種黃酮芹菜素，不能合成木犀草素則呈淺棕色，對應基因F3’H和FNR的無效突變。該研究雖然沒有鑒定試驗高粱材料對炭疽菌的抗性，但首次分析了3-脫氧花色素與黃酮合成途徑參與基因的無效突變情況，在分子層面解釋了某些感病材料形成的原因。可見，試驗中的高粱材料合成的類黃酮物質(zhì)與正常的材料相比有所缺失，因此，其抗性會弱于正常材料。

H2O2及HRGP蛋白合成途徑的研究較3-脫氧花色素的少，其功能基因、信號轉(zhuǎn)導和調(diào)控途徑信息等目前尚不清楚。對參與防御炭疽菌入侵的轉(zhuǎn)錄因子基因的研究內(nèi)容也較少，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子基因Y1參與調(diào)控3-脫氧花色素的合成，Y1蛋白調(diào)控CHS、CHI(chalcone isomerase，查爾酮異構(gòu)酶)和DFR基因的表達[38]。

3.3 抗性相關基因的基因組定位

為研究高粱抗炭疽病原理，定位抗性相關基因，進而提高抗性育種效率，許多研究者對抗性進行遺傳分析、抗性基因連鎖分析和基因組定位。MEHTA等[38]的研究顯示，抗性性狀既有顯性也有隱性，許多材料，如G73、Redlan、SC748-5、Bk7、SC155-14E和SC414-12E的抗性均由主效QTL控制[39-43]。與這些材料的抗性基因連鎖的分子標記也被開發(fā)用于品種選育，如對G73設計的SCAR(sequence characterized amplified region，序列特異性擴增區(qū))標記[39]，SC748-5關聯(lián)的AFLP(amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態(tài)性)和SSR(simple sequence repeat，簡單重復序列)標記[41]。利用分子標記的初步定位顯示高粱基因組中存在一些抗性基因富集的區(qū)段，其與炭疽病的有效抗性有關[42-44]，但該區(qū)段中哪些基因參與抗病過程目前還不清楚。

CUEVAS等[45]對包含335個核心高粱材料的群體進行關聯(lián)分析，定位了基因組中5個炭疽病抗性相關基因，是除參與3-脫氧花色素、黃酮及病程相關蛋白合成途徑的基因外，首次發(fā)現(xiàn)與炭疽病抗性有關的基因。這些基因分別位于1號和5號染色體上，為R家族基因和免疫反應相關基因，分別編碼F-box結(jié)構(gòu)域蛋白、蛋白酪氨酸激酶、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶和過氧化物酶等。

4 對高粱炭疽病抗性研究與育種的思考

4.1 抗性研究

高粱對炭疽菌侵染反應的相關研究主要集中在宿主細胞形態(tài)研究、類黃酮化合物的合成及合成途徑的功能基因鑒定、定位，其他方面，如信號轉(zhuǎn)導與防御反應的基因表達調(diào)控層面的研究較少。信號轉(zhuǎn)導層面，只確定1個蛋白酪氨酸激酶(Sobic. 005G182400)[45]；轉(zhuǎn)錄因子方面，只確定基因Y1參與調(diào)控3-脫氧花色素的合成。對信號轉(zhuǎn)導和表達調(diào)控的研究，可從高粱對炭疽反應的轉(zhuǎn)錄水平分析入手，以揭示炭疽菌侵染早期抗病材料分子水平的反應。炭疽孢子萌發(fā)后侵入細胞的2～3 h是關鍵時段，在該時段內(nèi)抗性材料通過信號轉(zhuǎn)導和調(diào)控基因表達進行有效防御反應；感病材料或是因為基因缺陷，或是轉(zhuǎn)導與表達調(diào)控途徑被入侵病菌抑制而無法合成足夠的物質(zhì)或形成相應的結(jié)構(gòu)開展有效防御。對該時段轉(zhuǎn)錄水平的分析可以找到更多的參與信號轉(zhuǎn)導的基因與調(diào)控下游功能基因表達的轉(zhuǎn)錄因子基因。除3-脫氧花色素外，H2O2及HRGP蛋白合成的信號轉(zhuǎn)導與表達調(diào)控途徑也值得研究，并將進一步在分子水平揭示高粱的抗性機理。

黃酮類物質(zhì)3-脫氧花色素和黃酮均對炭疽菌有毒性作用。高粱中至少有5種3-脫氧花色素，是否存在對炭疽菌有毒性的其他3-脫氧花色素及黃酮類物質(zhì)還有待進一步研究。已鑒定或者克隆的參與3-脫氧花色素合成途徑的基因有F3’H和FNR，參與黃酮化合物合成的基因有FNSII和F3’H。從無色芹菜定轉(zhuǎn)變?yōu)榍鄄硕ǎ~黃素轉(zhuǎn)變?yōu)槟鞠S定，催化該轉(zhuǎn)變反應的關鍵酶及其編碼基因尚未確定；此外，是否還有其他酶參與該合成途徑，通過對多個高粱材料的對比研究有望得到更多信息。

針對貴州省主要高粱栽種區(qū)炭疽菌的不同生理小種，需要對更多高粱資源的抗性性狀進行重復鑒定，為進一步研究和育種創(chuàng)造材料。同時，進一步實踐和完善田間及實驗室鑒定方法，不同生育期的鑒定方法及其成效。在生化層面和分子層面完善高粱應對脅迫反應的標志性化合物的檢測技術，如對各種3-脫氧花色素、黃酮、H2O2和HRGP蛋白的檢測技術，使其能適應檢測大群體樣本、快速及準確的需求，進而推動該領域迅速發(fā)展。另外，使用連鎖分析、關聯(lián)分析等方法定位不同材料之間抗性相關的具體基因，闡述抗性在材料間差異的分子機理。已有研究中使用連鎖分析方法確定了一些材料中抗性相關基因的連鎖標記[39，41-44]，但由于使用的群體小，均未能定位到具體的基因。

4.2 抗性育種

雖然防治高粱炭疽病的措施多種多樣，但選育穩(wěn)定的抗病品種仍是最經(jīng)濟的方法。育種時應針對當?shù)氐纳硇》N，盡量選擇遺傳多樣性豐富的抗性材料。對于抗性基因位于基因組不同位點的材料，可結(jié)合分子標記技術進行基因聚合，使選育品系的抗性更穩(wěn)定和持久；同時，結(jié)合其他農(nóng)藝性狀，如產(chǎn)量、丹寧含量、糯質(zhì)、穗形及株形等，用回交等方式將抗性性狀轉(zhuǎn)移到品系中。為加快品種選育過程，還需要先確定材料中抗性相關基因的各種連鎖標記，以確保其在不同病害選擇壓力的環(huán)境中正常使用。此外，可選育多個不同遺傳背景的抗性品種進行混合種植，以降低炭疽菌生理小種的變異速率。