1株牛源蠟樣芽孢桿菌的分離鑒定及毒力基因檢測

宋麗麗,張玲艷,賈偉娟,白志恒,劉 媛,陳云嬌，王學理

(內蒙古民族大學 動物科學技術學院，內蒙古通遼 028042)

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)屬芽孢桿菌科，蠟樣芽孢桿菌屬，該菌與蘇云金芽孢桿菌及炭疽桿菌等細菌的生物學特性相近，為一種較為常見的食源性條件致病菌。部分蠟樣芽孢桿菌可作為促植物生長劑及動物飼料內的微生物添加劑。該菌廣泛存在于自然界內，在土壤、污水及一些食物表面均可被分離到。此菌為革蘭氏陽性菌，可產生芽孢，兼性厭氧生存。其芽孢熱穩定性較強，是該菌引起食源性食物中毒的一個較為重要的因子[1]。該菌可引起人和動物產生嘔吐、腹瀉等臨床癥狀。近年來，中國養殖業蓬勃發展，通遼地區更是有著中國肉牛之都的稱號。本研究從通遼市某肉牛養殖場病死牛體內分離到1株細菌，對該菌進行分離鑒定，以期對通遼地區蠟樣芽孢桿菌的流行病學調查及該病的綜合防控奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

氯化鈉、營養瓊脂、葡萄糖等購自北京化工廠；酵母浸粉與蛋白胨由奧博星公司提供；細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、DL2000 DNA marker、PCR mastermix等均購自TaKaRa公司；全自動凝膠成像分析系統ZF-258；藥敏紙片購自賽莫爾公司；生化分析使用BD PhoenixTM100全自動微生物分析系統。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養 用接種環無菌采集病死牛的心、肝、脾、肺、腎等病變臟器組織，于LB固體培養基上劃線培養。12 h后可見脾臟組織接種的培養基上長出多個單菌落。挑取菌落革蘭氏染色后鏡檢，并對單菌落進行分離、純化、增菌培養，保存，備用[2]。

1.2.2 分離菌的生化鑒定 使用BD PhoenixTM100全自動微生物分析系統對分離菌進行生化特性檢測。吸取25 μL 0.6個麥氏單位的菌液置于AST肉湯培養基內混勻，將混合液加到革蘭氏陽性菌鑒定檢測板內。將檢測板放入機器內，24 h后查看檢測結果。

1.2.3 分離菌藥敏檢測 采用紙片擴散法檢測分離菌對30種藥物的敏感性[3]。吸取經過夜培養的菌液50 μL于普通瓊脂培養基上，使用涂布器將菌液均勻涂布于培養基表面。將藥敏片貼于涂布菌液的培養基上，之后將此培養基置于37 ℃培養箱內過夜培養，次日查看試驗結果[4]。

1.2.4 分離菌16S rDNA鑒定 使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌的基因組DNA。參照文獻[5]合成細菌16S rDNA基因擴增引物，引物序列為上游引物F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物R:5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，目的片段大小為1 500 bp。PCR反應體系為(20 μL)：2×Det PCR MasterMix 10 μL，模板DNA 1.0 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O補至20 μL。PCR反應條件： 95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火 1 min，72 ℃延伸90 s，30個循環；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。PCR產物采用10 g/L瓊脂糖膠電泳進行檢測，將擴增所獲目的條帶使用DNA凝膠回收試劑盒純化回收并送至上海生工生物工程有限公司測序。將測序結果在NCBI網站上進行BLAST，選取BLAST結果內分離自不同地區的蠟樣芽孢桿菌(美國NR074540、朝鮮CP020383、湖南JX294967、美國AY138272、巴西CP008712、四川KU986648、四川KJ720022、湖北GQ381283、拉巴特JN208091、山西KX905299)及致病性蠟樣芽孢桿菌代表菌株(AF290547)通過DNAstar軟件構建遺傳進化樹，并進行核酸同源性比對。

1.2.5 分離菌動物致病性檢測 選取15只體質量為25～30 g的小鼠隨機分為3組，分別腹腔注射0.5 mL 106CUF/mL分離菌、108CUF/mL分離菌和生理鹽水。注射后每隔1 h觀察并記錄小鼠臨床狀態。

1.2.6 分離菌毒力基因檢測 參照文獻[6-7]，合成蠟樣芽孢桿菌各毒素基因及看家基因的引物(表1)。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min； 94 ℃變性1 min，退火1 min(溫度見表1)，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

表1 蠟樣芽孢桿菌毒力基因引物Table 1 Virulence gene primers of Bacillus cereus

2 結果與分析

2.1 細菌培養特性

病牛臟器組織劃線的平板培養12 h后，僅脾臟組織劃線的平板上有菌落生長，均為灰白色、不透明的小菌落，挑起時呈絲狀。繼續培養24 h后可見菌落邊緣向外擴展，整體呈蠟滴狀。挑取單菌落染色鏡檢，均為兩端鈍圓，多呈單個或鏈狀排列的革蘭氏陽性桿菌(圖1)。

2.2 分離菌生化鑒定

生化結果顯示，該菌株能分解葡萄糖、麥芽糖、果糖等，不能分解尿素、D-塔格糖、β-龍膽二糖等(表2)。全自動微生物分析系統提示該菌為蠟樣芽孢桿菌。

2.3 分離菌藥敏檢測

對藥敏試驗結果進行記錄并分析(表3)。結果顯示，該菌對頭孢氨芐、頭孢唑啉、慶大霉素、諾氟沙星等藥物敏感，對頭孢哌酮、四環素、多粘菌素B等藥物中度敏感，對青霉素、新霉素、克林霉素等藥物耐藥。

2.4 分離菌16S rDNA檢測及其進化樹分析

由細菌16S rDNA PCR電泳結果可見，樣品孔出現與目的基因大小相符的1 500 bp條帶(圖2)。測序結果顯示該片段大小為1 492 bp，為蠟樣芽孢桿菌的16S rDNA片段。將所分離細菌菌株命名為TL株，根據進化樹結果(圖3)可知，TL與山西分離株Kx905299親源關系最近，同源性為99.8%。與其他參考毒株親緣關系相對較遠。

圖1 分離菌株在顯微鏡下的形態(1 000×)Fig.1 Morphology of isolates under microscope (1 000×)

表2 分離菌株生化試驗結果Table 2 Biochemical test results of isolated strains

注：+.陽性；-.陰性。

Note: +.Positive;-.Negative.

表3 分離菌藥物敏感性試驗Table 3 Drug sensitivity test of isolates

注：R.耐藥；I.中度敏感；S.敏感。

Note:R.Drug resistance;I.moderate resistance;S.sensitive.

M.DL2000 DNA marker；16S.16S rDNA

2.5 動物致病性試驗

小鼠注射菌液6 h后，106CUF/mL組小鼠出現食欲廢絕、精神萎靡現象，108CUF/mL組小鼠死亡1只，2只出現呼吸急促，倒地不起，其余小鼠精神萎靡。注射12 h后， 106CUF/mL組小鼠死亡2只，108CUF/mL組小鼠死亡4只，24 h后兩個試驗組的小鼠全部死亡。整個試驗期對照組小鼠無異常。采集死亡小鼠臟器組織進行細菌培養，從心臟組織中分離到該菌。表明該分離菌具有較強的致病性。

2.6 細菌毒力基因PCR鑒定

對所分離蠟樣芽孢桿菌進行毒力基因PCR鑒定，經10 g/L瓊脂凝膠電泳檢測，結果見圖4。樣品孔1、2、4、5、6、8、9和11分別擴增出與hblA、hblC、groEL、nheB、nheC、hblD、nheA、entFM基因片段大小相同且清晰可見的條帶，多次試驗未檢測到bceT、cytK、ces基因。由此可知，此蠟樣芽孢桿菌分離株含有看家基因groEL，溶血性腸毒素毒力基因hblA、hblC、hblD，非溶血性腸毒素毒力基因nheA、nheB、nheC以及腸毒素毒力基因entFM，不含有腸毒素毒力基因bceT、細胞毒素毒力基因cytK及嘔吐毒素毒力基因ces。

圖3 16S rDNA基因系統發育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene

M.DL2000 DNAMarker；16S.16S rDNA；1.hblA；2.hblC；3.ces；4.groEL；5.nheB；6.nheC；7.cytK；8.hblD；9.nheA；10.bceT； 11.entFM

圖4 分離菌16S rDNA及毒力基因擴增結果
Fig.4 Results of 16S rDNA and virulence gene amplification of isolated bacteria

3 討 論

蠟樣芽孢桿菌分為無毒菌株和有毒菌株。無毒菌株作為益生菌，在進入動物腸道后，可影響腸道免疫細胞對細胞因子的分泌，并且可產生桿菌肽等抗菌物質來增強機體的免疫能力[8]。此外，該細菌在降低動物腹瀉率、提高動物采食量、促進反芻動物瘤胃內容物代謝等方面均有良好的效果[9]。另外，無毒菌株作為益生菌在種植業及魚類養殖業等方面應用也十分廣泛。焦文沁等[10]研究表明，蠟樣芽孢桿菌對小麥有明顯防病、促生長、提高抗逆性的作用。張洪玉等[11]研究發現，給蝦拌餌投喂蠟樣芽孢桿菌可顯著促進蝦的生長，并提高其機體免疫力。

有毒蠟樣芽孢桿菌為一種常見的食源性條件致病菌，可引發人或動物的食物中毒，臨床多見患者產生腹瀉或嘔吐癥狀，這是由于該菌可產生嘔吐型腸毒素與腹瀉型腸毒素。嘔吐毒素Cereulide由ces基因控制合成[12]。腹瀉型毒素主要包括溶血型腸毒素HBL(Hemolysin BL)、非溶血型腸毒素Nhe(Nonhemolytic enterotoxin)、細胞毒素CytK(Cytotoxin)、腸毒素T(BceT)、和腸毒素FM(EntFM)。其中HBL通常會由hblA、hblB、hblC、hblD4個基因構成，但有些菌體hblB會有缺失，nhe由nheA、nheB、nheC 3種毒力亞基組成，其余3種毒素為單一基因產物。溶血性腸毒素hbl與細菌的細胞毒性及其與細胞作用過程中孔隙的形成有關[13]。非溶血性腸毒素基因nhe合成的蛋白可引發中毒，細胞毒素K為穿孔毒素，可致細胞發生死亡。嘔吐毒素為一種環形小分子肽，可引發伴有嘔吐癥狀的食物中毒。有研究表明nhe基因、entFM基因、bceT基因為蠟樣芽孢桿菌的主要毒力基因，這些毒力基因所編碼的毒素也被認為是蠟樣芽孢桿菌的主要毒力蛋白[14]。本試驗對分離菌所含毒素基因進行鑒定，結果顯示該菌含有溶血性腸毒素基因hbl、非溶血性腸毒素基因nhe及腸毒素基因entFM。因此可以推測該分離菌株的致病性可能與所檢測到的毒力基因所編碼的毒素有關。

近年來隨著抗生素等藥物的濫用和亂用，該菌的侵襲力也在不斷發生變化。Veysseyre 等[15]對一所醫院5 a內確診為感染蠟樣芽孢桿菌患者的臨床癥狀進行統計，結果顯示29.8%的患者發生單純菌血癥，28.1%的患者發生皮膚感染， 17.5%的患者發生骨及關節感染，11.8%的患者發生死亡，54.4%的患者在內科進行治療。該細菌的靶器官從最初的胃腸道擴展到其他臟器，甚至可使宿主死亡，可見蠟樣芽孢桿菌的侵染能力逐漸變強。蠟樣芽孢桿菌不僅對人類的侵染性發生變化，其對動物的侵襲力也在逐步增強。

崔一龍等[16]從馬皮下膿腫內分離到致病性蠟樣芽孢桿菌，趙振宇等[5]從仔豬的肝臟內分離到新型致病性蠟樣芽孢桿菌，二者均以小鼠為實驗動物進行細菌的動物致病性試驗，結果顯示兩菌株均具有較強的致病性，可使小鼠發生死亡。蠟樣芽孢桿菌對牛的致病性主要表現為奶牛乳房炎，而本次所分離的菌株導致牛發生猝死，蠟樣芽孢桿菌對牛可導致猝死迄今未見公開報道。核苷酸同源性結果表明，TL株與人源致病菌株Af290547、豬源致病菌株Jx294967的同源性分別為99.6%和99.5%。與參考菌株序列堿基對比結果可見，TL菌株16S rDNA的第265位堿基由T轉變為C，而這一不同之處是否與菌株間致病性差異有關還需進行近一步研究。

目前，蠟樣芽孢桿菌感染動物的情況逐漸增多，在通遼地區已出現多起牛感染蠟樣芽孢桿菌致死案例。