水稻MYB-MYC基因家族的全基因組鑒定、系統進化和表達模式分析

劉 玥，陳守坤，王成微，李家偉，李海峰

(旱區作物逆境生物學國家重點實驗室,西北農林科技大學 農學院，陜西楊凌 712100)

轉錄因子在植物生長發育和逆境脅迫中起到了關鍵作用。MYB-MYC(R2R3-MYB and MYC transcription factors N-terminal)基因家族是一類植物特有的轉錄因子家族，其保守結構域通常由2個部分組成，在其N端含有1個R2R3-MYB結構域[1]和1個MYC結構域[2]。 迄今為止，在擬南芥和水稻中分別鑒定到5個AtMYB-MYC基因，如：AtMYC1[3]、AtMYC2[4]、AtMYC3、AtMYC4[5]和AtMYC5[6]以及2個OsMYB-MYC基因，如：OsMYC1[7]和OsMYC2[8]。這些基因廣泛參與擬南芥和水稻的生長發育以及響應非生物脅迫[9]。但是MYB-MYC作為一個基因家族，在水稻基因組中仍然沒有鑒定和深入研究。

水稻是世界上重要的糧食作物之一[10]，作為禾本科模式植物，其基因組的組成比較簡單。2002年水稻基因組測序的完成，為水稻基因組學的研究提供了基礎[11]。水稻的基因組較小，易于進行遺傳轉化，并且對其他禾本科植物如:二歲短柄草和小麥有良好的基因組共線性關系，水稻的基因組研究可以為其他禾本科植物的進化關系提供理論依據[12]。鑒于此，本研究利用最新的水稻基因組數據庫，通過生物信息學方法，對水稻MYB-MYC基因家族在全基因組水平上進行鑒定，并進一步分析其染色體分布、保守結構域、基因結構、啟動子順式作用元件、GO功能注釋、蛋白質互作網絡、基因復制及表達模式，以期更好地了解MYB-MYC基因特性、進化關系和基因功能，為研究MYB-MYC的基因功能提供有益信息。

1 材料與方法

1.1 水稻MYB-MYC家族成員的全基因組鑒定

首先在Ensembl Plants 數據庫(http://plants.ensembl.org/index.thml)中下載水稻的全基因組數據。同時在Pfam數據庫(http://pfam.xfam.org/)中下載MYB-MYC_N結構域(PF14215.6)作為搜索模型，利用HMM 3.0軟件篩選水稻中含有該結構域的蛋白質序列。此外將水稻的全基因組蛋白質序列構建本地數據庫，使用TAIR數據庫(https://www.arabidopsis.org/)中擬南芥的MYB-MYC蛋白質序列進行BLASTP搜索。將上述2種方法篩選到的候選蛋白質序列合并，去除重復、測序不完全和沒有完整編碼框的蛋白質序列。利用Pfam和NCBI-CDD數據庫對候選蛋白質進行檢測，去掉不完整結構域的蛋白質序列，最終得到水稻MYB-MYC基因家族序列。利用ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)在線軟件對水稻MYB-MYC蛋白質的分子質量、氨基酸長度和等電點進行分析；利用Cello軟件進行亞細胞定位分析[13]。

1.2 系統發育樹的構建、基因結構及保守結構域序列分析

將水稻與其他植物的MYB-MYC蛋白質整合，進行多重序列比對；使用MEGA7軟件采用鄰接法(NJ)，Bootstrap值設置為1 000，構建系統發育樹[14]。使用MEME工具(http://meme-suit/org/)預測水稻的MYB-MYC蛋白質序列中的保守序列位點。根據OsMYB-MYC基因的CDS序列和DNA基因組序列，利用在線軟件GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.cn/)分析其基因結構并進行可視化。

1.3 啟動子順式作用元件和GO注釋分析

提取OsMYB-MYC基因上游1.5 kb的基因組序列，使用啟動子預測數據庫PlantCare(http://bioinformatice.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)進行順式作用元件預測。將水稻MYB-MYC蛋白質序列提交到Plant Transcriptional Regulatory Map[15]和PLAZA數據庫[16]中進行GO注釋，整合得到的GO號，使用BGIWEGO進行可視化[17]。

1.4 染色體定位、基因復制事件和共線性分析

根據水稻的基因組注釋信息(http://plants.ensembl.org/index.thml)獲得OsMYB-MYC基因的染色體位置信息。利用MCScanX軟件進行基因復制分析[18]，最后使用Circos v 0.67軟件對染色體定位和共線性基因對進行可視化[19]。使用KaKs_calculator軟件[20]計算共線性基因對的Ka/Ks值，用于評估其進化選擇情況。

1.5 蛋白互作網絡分析

使用同源蛋白分析的方法，將OsMYB-MYC基因在擬南芥中進行比對，篩選出OsMYB-MYC在擬南芥中的直系同源基因，并提交到AraNetV2數據庫[21]中，進一步得到蛋白質互作網絡關系，利用Cytoscape軟件[22]進行可視化。

1.6 表達模式分析

使用NCBI-SRA數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)下載水稻轉錄組數據：即水稻的根(SRR1618549)、花藥(SRR1618546)、心皮(SRR1618547)和種子(SRR1618548)。使用TopHat和Cufflinks軟件進行轉錄組分析[23]，計算OsMYB-MYC基因在不同組織中的FPKM值[24]。使用GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/?term=)下載水稻在干旱脅迫和鹽脅迫下的表達量數據，登錄號為GSE60287[25]。使用GEOquery軟件包分析OsMYB-MYC基因在干旱脅迫和鹽脅迫下的表達量。使用R語言Pheatmap軟件包對表達譜進行可視化。

2 結果與分析

2.1 水稻MYB-MYC家族成員的鑒定

利用HMM和BLAST 2種比對方法，從水稻基因組中共鑒定出21個MYB-MYC轉錄因子作為候選基因。之后使用Pfam、NCBI-CDD 2個數據庫對得到的21條水稻MYB-MYC候選蛋白進行保守結構域完整性檢測，其中發現有17條具有完整的MYB-MYC保守結構域，另外4條由于結構域殘缺而被去除。最終得到的17條水稻MYB-MYC候選蛋白序列，占已注釋的水稻基因組的0.046%，并按照其位于染色體上的物理位置進行命名(表1)。根據蛋白質序列長度分析發現，水稻MYB-MYC轉錄因子序列長度為180～904 aa，分子質量為20.26～97.39 ku，其中OsMYB-MYC03含有最長的氨基酸序列，長度為904 aa，OsMYB-MYC08含有最短的氨基酸序列，長度為180 aa。轉錄因子的亞細胞定位對于其功能具有借鑒作用。根據Cello在線軟件的亞細胞定位結果顯示，所有的水稻MYB-MYC轉錄因子都可以預測到亞細胞定位，其中11個定位于細胞核，4個定位于葉綠體，2個定位于細胞質，極少數定位于細胞質膜上。

2.2 系統發育樹的構建、蛋白質保守結構域和基因結構分析

為了分析水稻MYB-MYC轉錄因子家族的進化關系，將22個擬南芥、10個二穗短柄草，49個小麥MYB-MYC轉錄因子進行合并，使用其全長蛋白質序列，利用MEGA 7軟件中的NJ法，采用模型為泊松模型構建系統進化樹。如圖1所示，根據構建的系統進化樹的分支和bootstrap值，筆者將水稻MYB-MYC轉錄因子家族分為Ⅰ、Ⅱ亞家族，每個亞家族可以分為若干個亞組。如：亞家族Ⅰ包括1、2、3亞組；亞家族Ⅱ包括了3、4、5亞組。根據系統進化樹，MYB-MYC轉錄因子在水稻，擬南芥，小麥，二穗短柄草中的同源性很高，表明MYB-MYC轉錄因子物種分化過程中非常保守。同時，所有的MYB-MYC轉錄因子都在單子葉和雙子葉植物中發現，即MYB-MYC轉錄因子在單子葉植物和雙子葉植物中的聚類沒有偏好性。這表明，MYB-MYC轉錄因子發生的進化時間要早于擬南芥、二穗短柄草、水稻和小麥的分化時間。

表1 水稻MYB-MYC基因家族基因的特征Table 1 Characterization of MYB-MYC gene family in rice

圖1 水稻、擬南芥、小麥和二穗短柄草MYB-MYC基因家族的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of MYB-MYC genes in rice,Arabidopsis, wheat and Brachypodium distachyon

通過對水稻MYB-MYC轉錄因子的保守結構域進行分析，共識別到兩類保守結構域，分別為MYB-MYC保守結構域和bHLH保守結構域。每個轉錄因子都含有MYB-MYC保守結構域，部分轉錄因子含有bHLH保守結構域。利用MEME軟件對水稻MYB-MYC蛋白質的保守基序組成和數目進行了分析，結果發現，總共識別到10個保守基序motif，并依次命名為motif 1到motif 10。如圖2-c所示，motif 4和motif 6作為MYB-MYC結構域的保守基序出現在所有的水稻MYB-MYC轉錄因子中，motif 1 只出現在bHLH結構域中，作為HLH結構域的保守基序；motif 8存在于1、2、3亞組中，motif 9只存在于第5亞組中，這些基序可以作為識別不同亞組的標志。這表明，MYB-MYC在進化過程中，存在著內部的分化，進一步可能導致功能的分化。

為了進一步預測基因功能和進化關系，利用OsMYB-MYC基因的CDS和DNA基因組序列進行了OsMYB-MYC基因結構分析。結果表明，OsMYB-MYC基因的外顯子數量由1到10呈現不均勻分布。其中亞家族Ⅲ的外顯子數量多，平均含有10個外顯子。此外OsMYB-MYC13和OsMYB-MYC14只含有1個外顯子。

根據保守基序分析和基因結構分析可知，雖然保守基序數量以及外顯子、內含子長度有一定的差異，但是相同亞家族成員的保守基序和基因結構高度保守。

圖2 水稻MYB-MYC基因家族的系統進化(a)、保守結構域(b)、保守基序(c)和基因結構(d)Fig.2 Phylogenetic relationships (a), conserved domain(b), conserved motifs(c) and gene structure(d) of MYB-MYC genes in rice

2.3 啟動子順式作用元件和GO注釋分析

為了更好地了解水稻MYB-MYC轉錄因子的功能，將所有的水稻MYB-MYC轉錄因子進行基因本體(Gene ontology)注釋。GO注釋主要包括細胞成分(Cellular component)、分子功能(Molecular function)和生物過程(Biological process)3部分。如圖3所示，在細胞成分中， 70.6%的OsMYB-MYC蛋白參與細胞內成分的構成，少于60%的蛋白可參與植物細胞內細胞器的構成。在分子功能方面，超過80%的蛋白能夠與其他蛋白質結合，來發揮其在植物體內的生物學功能；41.2%的OsMYB-MYC蛋白能夠參與雜環化合物的形成；少于20%的OsMYB-MYC蛋白具有催化作用。對水稻OsMYB-MYC蛋白參與的生物過程進行分析，發現有52.9%的蛋白參與細胞進程，47.1%的蛋白參與代謝以及生物調節過程，另有少于20%的OsMYB-MYC蛋白可在水稻信號傳導及逆境脅迫和植物生殖器官的發育中起到調控作用。通過上述結果，推測水稻OsMYB-MYC蛋白可通過與其他蛋白的結合，來調節水稻體內一些生物學過程，從而響應一些非生物脅迫。

圖3 OsMYB-MYC蛋白的基因本體(GO)注釋分析Fig.3 Gene ontology annotation analysis of OsMYB-MYC proteins

順式作用元件是位于基因上游，與功能基因一起發揮作用的一類端的核苷酸序列，它們能與轉錄因子結合進而發揮作用。本研究中，截取水稻MYB-MYC基因上游1.5 kb的序列，對OsMYB-MYC基因的順式作用元件進行分析。結果發現，OsMYB-MYC基因上游存在4大類型的順式作用元件。①調控植物生長發育相關元件，如調控分生組織表達CAT-box。②光調節相關元件，如Box4元件、G-Box元件、GT1-motif元件、I-box元件、TCCC-motif元件和AE-box元件等。③響應植物激素相關元件，如響應植物激素的TGACG-motif元件，響應ABA的ABRE元件，響應水楊酸代謝的TCA-element元件，響應赤霉素的P-box元件等。④響應逆境脅迫相關元件，如響應厭氧反應的ARE元件，響應干旱反應的MBS等。進一步研究發現，17個水稻MYB-MYC基因上游發現了ABRE元件，其中OsMYB-MYC04含有11個ABRE元件，表明該轉錄因子可能參與水稻ABA代謝途徑。此外，光調節信號元件和激素響應元件在水稻MYB-MYC基因上游發現較多，共有102個光調節信號元件和127個響應植物激素元件，上述分析表明水稻MYB-MYC基因家族可能在調控植物生長發育、光調節、植物激素響應及逆境脅迫等生理過程中具有重要的作用。

2.4 染色體定位和基因復制分析

根據水稻基因組gff3注釋文件，將鑒定得到了OsMYB-MYC基因進行染色體定位。結果發現(圖4)，17個基因均可以定位到水稻的不同染色體上，每條染色體上大約有1～3個水稻MYB-MYC基因。

在基因的進化以及分化過程中，基因復制在基因擴張和基因的功能分化中發揮著重要作用。其中，基因復制包括串聯復制和并聯復制。在本試驗中，使用MSCcanX軟件，對水稻全基因組進行共線性分析，以此來分析水稻全基因組產生的基因復制事件。結果發現共產生5對并聯復制事件和3對串聯復制事件。證明MYB-MYC基因在水稻進化過程中，基因復制使MYB-MYC基因家族進行擴張，但是擴張緩慢，在進化過程中十分保守。

在基因的進化過程中，不導致氨基酸改變的核苷酸變異被稱為同義突變，反之則稱為非同義突變。主要包括：同義突變頻率(Ks)、非同義突變頻率(Ka)、非同義突變頻率與同義突變頻率的比值(Ka/Ks)。Ka/Ks對基因的進化選擇有重要的指導作用，當Ka/Ks>1，則認為受到正向選擇作用，當Ka/Ks=1，則認為受到中性選擇，當Ka/Ks<1，則認為受到純化選擇。為了進一步探討這些復制基因對受到何種選擇，對其進行同義突變頻率(Ka)、非同義突變頻率(Ks)值的計算。通過計算，發現水稻MYB-MYC基因的串聯復制基因對Ka/Ks值<1 (0.559)，水稻MYB-MYC基因的并聯復制基因對的Ka/Ks值<1(0.258)，說明OsMYB-MYC基因的復制基因對在水稻進化過程中都受到純化選擇。

為了探索共線性基因對的分歧時間，使用Umarmasood等[26]的方法，對其分歧時間進行計算。如表2所示，水稻MYB-MYC基因的串聯復制基因對和并聯復制基因對的平均分歧時間分別為27.19 Mya和94.89 Mya。上述結果表明并聯復制比串聯復制發生的更早，可能在進化以及基因分化過程中起到重要的作用。

圖4 水稻MYB-MYC轉錄因子的基因定位和水稻基因組內復制基因對Fig.4 Genomic locations of OsMYB-MYC TFs and duplicated gene pairs in rice

2.5 蛋白互作網絡分析

眾所周知，在植物體內，很少有單個的蛋白質能夠直接參與植物的生長發育和逆境脅迫反應。大多數植物生理過程都是通過蛋白質的相互作用來完成。為了更好地理解OsMYB-MYC的分子機制，構建了OsMYB-MYC蛋白與其他水稻蛋白之間的相互作用網絡。如圖5所示，共有13個水稻MYB-MYC蛋白和29個水稻蛋白質形成了58對蛋白互作關系。其中，OsMYB-MYC03、OsMYB-MYC05和OsMYB-MYC01分別與14、14、9個水稻蛋白質產生相互作用，其參與的蛋白互作范圍最大，占據總蛋白互作關系的63.7%，表明上述3個水稻MYB-MYC蛋白在蛋白互作中起到重要作用。

對水稻蛋白互作網絡的基因進行功能注釋后發現，這些互作蛋白屬于不同的基因家族，有著不同的生理功能。比如Os01g0105700、Os03g0591300、Os04g0301500等基因屬于bHLH基因家族，該基因家族能夠調控植物生長發育以及參與逆境脅迫等[27]；Os06g0622300，Os08g451400等屬于AT-rich基因家族，該基因家族能夠調控根系的生長[28]；Os04g0653000可以抑制植物激素茉莉酸的信號轉導并且調控水稻小穗的發育[29]；Os09g0309700屬于TIFY3類蛋白，可以抑制乙烯的生物合成，與水稻抗旱生理有關[30]。以上結果表明，水稻MYB-MYC蛋白通過與其他蛋白質相互作用，進而參與到水稻生長發育、響應植物激素及響應干旱脅迫等代謝途徑。

表2 水稻MYB-MYC基因的基因復制信息及其Ka和Ks信息、基因分歧時間Table 2 The Ka/Ks ratios and divergence time for gene duplicated OsMYB-MYC genes

圖5 水稻MYB-MYC蛋白互作網絡Fig.5 Interaction network of MYB-MYC proteins in rice

2.6 表達模式分析

為探究水稻MYB-MYC基因在水稻生長發育過程中潛在的生物學功能，本研究利用NCBI-SRA數據庫下載水稻的根、花藥、心皮和種子4個組織的RNA-seq數據，對水稻MYB-MYC基因的表達模式進行研究。如圖6-a所示，OsMYB-MYC基因表現出明顯的組織表達特異性；13個OsMYB-MYC基因在心皮中表達量較高，其中OsMYB-MYC09、OsMYB-MYC10、OsMYB-MYC17在心皮中表達量最高。有9個OsMYB-MYC基因在種子中表達量較高，其中OsMYB-MYC05、OsMYB-MYC07、OsMYB-MYC11在種子中表達量最高。OsMYB-MYC02、OsMYB-MYC03、OsMYB-MYC08在花藥中表達量最高。以上結果表明OsMYB-MYC基因可能在花發育過程以及種子形成或者萌發過程中發揮重要的功能。

同時為了研究OsMYB-MYC基因在逆境脅迫下的生物學功能，本試驗利用GEO數據庫分析了水稻栽培種‘Nagina 22’在干旱和鹽脅迫下MYB-MYC基因的表達情況。如圖6-b所示，在干旱脅迫處理中OsMYB-MYC基因表達有明顯的變化，94.1%(16/17)的MYB-MYC基因表達量上調，其中OsMYB-MYC04和OsMYB-MYC11表達量有明顯的上調。在鹽脅迫處理中OsMYB-MYC基因表達也存在明顯的變化， 82.4%(14/17)的MYB-MYC基因表達量上調，其中OsMYB-MYC08、OsMYB-MYC16、OsMYB-MYC17表達量有明顯的上調。以上結果表明，OsMYB-MYC基因在響應干旱脅迫和鹽脅迫下具有重要作用。

圖6 OsMYB-MYC基因在不同組織中以及在干旱和鹽脅迫中的表達Fig.6 Expression profiles of OsMYB-MYC genes in different tissues and under drought and salt stress

3 討 論

水稻是中國主要的糧食作物之一，同時也是進行植物科學研究的模式植物之一，加強水稻的基礎研究對保障國內糧食安全以及植物科學研究至關重要。

本試驗利用最新的水稻基因組數據庫，通過基因組學、轉錄組學等生物信息學手段，對水稻MYB-MYC基因家族進行鑒定，結果表明共有17個水稻MYB-MYC基因被鑒定。OsMYB-MYC基因定位大多都在細胞核中，部分基因也定位于葉綠體或者線粒體等部位，表明大部分的OsMYB-MYC基因都在細胞核中行使功能，部分OsMYB-MYC基因也可能在葉綠體或者線粒體中進行表達，行使生理生化功能。

通過系統進化、保守結構域和基因結構分析發現，水稻與其他植物的MYB-MYC蛋白進化關系很近，基序motif 4和motif 6存在于所有的水稻MYB-MYC蛋白中，且同一亞組內的基因具有相似的保守結構域和基因結構。結合系統進化樹發現，MYB-MYC蛋白在單子葉和雙子葉植物分化之前已經存在。順式作用元件的分析表明OsMYB-MYC基因在光響應、激素響應、逆境響應過程中發揮作用。GO注釋結果表明，OsMYB-MYC基因廣泛參與了細胞組成、分子功能、生物進程3個生理過程。

MYB-MYC轉錄因子結構域含有MYB和MYC結構域，部分轉錄因子含有bHLH結構域，因此MYB-MYC基因功能非常豐富。前人研究表明MYB-MYC基因參與植物生長發育、響應植物激素以及非生物脅迫的響應。例如，擬南芥AtMYC2基因在植物激素JA[31-33]、ABA[4]代謝途徑中起到重要作用；通過抑制分生組織的細胞分裂從而抑制擬南芥根系的伸長，同時促進側根的形成[34]；還參與擬南芥的晝夜節律、光和光敏色素信號轉導[35]；影響種子的發育[36]；水稻OsMYC2基因參與調控水稻的衰老生理，同時參與水稻光信號介導[37]。MYB-MYC基因同時參與植物逆境脅迫。例如，擬南芥AtMYC2基因通過參與JA介導的相關途徑來抵御非生物脅迫以及生物脅迫[38]，同時在干旱脅迫下起到轉錄激活作用[4]；過表達水稻OsMYC2能夠增強JA相關基因的表達，從而抵御細菌的侵染[39]。本試驗通過對水稻的表達模式分析表明，OsMYB-MYC基因在水稻的不同組織以及非生物脅迫下也有明顯的表達差異，這些結果說明OsMYB-MYC廣泛參與水稻的生長發育和逆境響應。