加味五虎追風散對魚藤酮誘導的帕金森病大鼠多巴胺能神經元α-syn及TH表達的影響

陳 煒，梁健芬，蔣凌飛，吳 林，張興博

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是臨床常見的神經系統退行性疾病，是中老年人致殘的主要原因之一，全球患病率為100/10萬～200/10萬[1]，隨著我國人口老齡化的發展，PD成為中老年人致殘的主要原因之一。本病目前尚無特效藥物，被公認為治療PD“金藥物”的左旋多巴也只能在一定程度上緩解癥狀，不能阻止黑質多巴胺能神經元逐步走向死亡的結局，難以從根本上改變疾病加重的態勢，并且長期使用療效遞減，臨床出現癥狀波動和異動癥等運動并發癥也十分常見。因此，本課題組用魚藤酮誘導帕金森病模型大鼠，觀察加味五虎追風散對黑質致密部多巴胺(dopamine，DA)能神經元α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)及酪氨酸羥化酶(TH)蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 90只SPF級Wistar大鼠，體重(200±50)g，雌雄各半，由廣西醫科大學動物實驗中心提供。將所有大鼠隨機分為空白對照組(空白組)、PD模型對照組(模型組)、中藥加味五虎追風散低劑量組(中藥低劑量組)、中藥加味五虎追風散中劑量組(中藥中劑量組)、中藥加味五虎追風散高劑量組(中藥高劑量組)，每組16只。

1.2 實驗藥物 加味五虎追風散(蟬蛻6 g，天南星6 g，天麻12 g，全蝎3 g，僵蠶10 g，大地棕根15 g)，由廣西中醫藥大學第一附屬醫院中藥房購于江蘇江陰天江藥業有限公司，為新型濃縮顆粒劑。

1.3 實驗試劑 魚藤酮(美國Sigma公司)，葵花乳油(美國Sigma公司)，α-syn 抗體(北京博奧森生物有限公司)，TH抗體(北京碧云天生物有限公司)。

1.4 動物造模 采用頸、背部交替皮下注射魚藤酮法制備模型。將魚藤酮溶于葵花油乳油中，濃度為2 mg/mL，劑量為每日2 mg/kg，頸背部皮下注射，每天注射1次，連續注射28 d。經行為學測試大鼠出現震顫、僵直、運動遲緩、步態不穩即為造模成功[2-3]。密切觀察造模中及造模后大鼠情況，造模大鼠死亡0只，空白組死亡2只。

1.5 行為學檢測 按陳忻等[4]的帕金森病動物模型行為學評分標準進行行為學檢測，將大鼠行為變化分為6個等級計分：1分，大鼠出現拒捕行為減弱、豎毛、毛色變黃變臟、弓背、主動活動減少；2分，有1分的表現，且主動活動減少明顯、動作遲緩，并有震顫或步態不穩；4分，有2分的表現，且步態不穩，或不能直線行走或步行時間向一側旋轉；6分，向單向斜臥，單側前肢和/或后肢癱瘓，行走困難、進食困難；8分，單側，前肢和/或后肢完全癱瘓，四肢拘攣，體重大幅度減輕，不能進食；10分，瀕臨死亡或死亡。本實驗將2～6分大鼠入選PD模型，最后經行為學篩選剔除造模大鼠1只，故符合PD模型要求大鼠共有80只，空白組為14只，模型組15只，中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組各16只，將剩下的大鼠進行后續實驗。

1.6 灌胃給藥 待造模后靜養1周開始對大鼠進行灌胃給藥，每天2次，間隔12 h，連續灌胃28 d，藥量的確定按人與大鼠體表面積系數計算，中劑量與臨床中人的用藥等效劑量相對應，中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組分別給予加味五虎追風散4.15 g/(kg·d)、8.3 g/(kg·d)、16.9 g/(kg·d)灌胃，模型組及空白組用相等體積的蒸餾水灌胃，連續28 d。

1.7 取材 實驗結束后，大鼠用水合氯酸腹腔注射麻醉后，立即取腦，迅速分離出中腦黑質及紋狀體。其中一半放入備好的多聚甲醛的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，固定1周以上，再移入到含蔗糖的溶液中，待腦組織下沉后用冰凍切片機切取厚的冠狀切片，行免疫熒光染色。另外一半迅速分離之后放入-80 ℃冰箱，低溫保存[5]。

1.8 Western-Blot檢測大鼠腦組織 取材后將黑質組織按照1∶10(質量∶體積)比例加入裂解液，冰上超聲處理10 s后，沸水浴中5 min 變性，15 000 r/min離心15 min，吸取上清，每管20 μL分裝，-70 ℃保存。核蛋白的提取應用凱基核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒，操作步驟均參照說明書。取10 μL樣品，泳道上樣于12% SDS-PAGE 進行凝膠電泳，4 ℃ 300 mA 電轉90 min。5% BSA-TBST 封閉1 h后，加入相應蛋白抗體，4 ℃過夜。TBST 緩沖液漂洗10 min×3次后，加入二抗，室溫孵育1 h后加入ECL(Pierce)發光底物顯色。化學發光凝膠成像系統顯影分析。用目的蛋白灰度值與胞漿蛋白內參β-actin 灰度值之比進行半定量分析。比較各組黑質紋狀體區α-syn聚集情況及TH蛋白含量。

2 結 果

2.1 行為學結果 造模的大鼠在皮下注射魚藤酮葵花油乳液后第3天就出現了捕捉動作減少的現象，并逐漸出現活動減少、動作遲緩等帕金森病癥候群特征。注射第1周后大鼠的理毛能力下降，毛色開始發黃、變臟，出現有豎毛現象。有部分大鼠出現口鼻出血，有的大鼠由于活動減少，肢體不靈活而進食減少，模型組有1只大鼠出現偏癱，不能進食，評分為10分，所以剔除實驗。有文獻提示，注射第1周時動物死亡率最高，但本實驗所有造模大鼠均未出現死亡。空白組最終均存活14只，中藥中劑量組、中藥高劑量組各存活16只。

2.2 大鼠中腦黑質區α-syn、TH蛋白含量變化 造模后，模型組腦黑質區α-syn含量增加，與空白組比較差異有統計學意義(P<0.05)；中藥低劑量組、中劑量組、高劑量組腦黑質區α-syn含量較模型組降低，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，其中中藥高劑量組腦黑質區α-syn含量均低于中藥中劑量組、中藥低劑量組(P<0.05)。與空白組比較，模型組TH蛋白含量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，中藥低劑量組、中劑量組、高劑量組TH蛋白表達升高，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，其中中藥高劑量組TH蛋白表達均高于中藥中劑量組、中藥低劑量組(P<0.05)。詳見表1、圖1。

表1 各組大鼠中腦黑質區α-syn、TH蛋白含量比較(±s)

與空白組比較，1)P<0.01，2)P<0.05；與模型組比較，3)P<0.05，4)P<0.01；與中藥低劑量組、中藥中劑量組比較，5)P<0.05

A：空白組；B：模型組；C：中藥低劑量組；D：中藥中劑量組；E：中藥高劑量組

3 討 論

PD是以肢體震顫、肌強直、隨意運動障礙為主要臨床特征，中醫屬“顫證”“痙證”范疇。《素問·至真要大論》曰：“諸暴強直，皆屬于風，諸風掉眩，皆屬于肝。”指出了肝風內動的基本病機。若腎陰精虧，無力上承以養腦，骨髓不充，行則振掉，精氣不足則化血乏源，血不足則無以濡養筋脈，易生風致顫然。《赤水玄珠全集·顫振門》中認為顫證的病機是“腎陰不充，下虛上實，實為痰火，虛則腎虧”。因此本病病位主要在腦，著于筋脈，關乎五臟，證屬本虛標實，腎虛為本病發病之根本，又涉及肝、脾等臟腑；標實為“內風”“瘀血”“痰濁”而致心神失主，經脈肢體失控。可見痰瘀交阻生風是PD的重要病機，且在PD 的發病過程中痰、瘀、風貫穿了疾病的全過程[6]。因此，認為原方五虎追風散祛瘀化痰熄風作用明顯，雖重治其標，但對其發病之本不能兼顧，基于對PD的中醫病機認識，主張古方新用，在五虎追風散的基礎上去有毒性的朱砂而加入壯藥大地棕根成為加味五虎追風散。方中蟬蛻既能祛外風，又能熄內風，而解痙止顫；天南星苦溫辛烈，善能開泄以祛風解痙，為專治經絡風痰的要藥；全蝎、天麻、僵蠶活血化瘀、平熄內風而止顫；壯藥大地棕根補腎祛風行血，全方配伍精煉全面，標本兼治，共奏補腎活血、化痰通絡熄風之效。因帕金森病為本虛標實之患，腎虛為本病發病之根本；標實為“瘀血”“痰濁”而致經氣不利，內風動越，肢體筋脈失控。故治療當標本兼顧，以補腎活血、化痰通絡熄風為法[7]。前期課題組研究發現五虎追風散在治療帕金森病方面有獨特的療效，能改善PD 病人的日常生活能力及運動功能，減少出現異動癥的時間，提高病人的生活質量[8-9]。本研究進一步探討加味五虎追風散對PD模型大鼠黑質多巴胺能神經元α-syn及TH蛋白表達的影響。

現代醫學認為，PD病理變化主要表現為黑質致密部多巴胺能神經元變性缺失和路易小體形成，而其中心事件則是異常的α-syn折疊和聚集。α-syn蛋白的錯誤折疊、聚集和降解異常是多巴胺能神經元死亡的一個重要因素，在α-syn突變、過度表達及氧化應激等多種因素作用下，其異常聚集形成路易小體，并進一步損害多巴胺神經元，與 PD 的發病密切相關[10-13]。因此，針對α-syn異常聚集的干預顯得尤為重要，預先給予抗氧化劑或含巰基的化合物可不同程度地改善PD動物行為和病理生化指標的改變[14]。而近年來研究發現PD與基因遺傳修飾異常相關，miRNA 是一類內源小分子非編碼RNA，主要在轉錄后水平參與基因調控，在PD疾病的發生、發展過程中起著重要作用[15]。研究還發現，TH負責催化氨基酸L-酪氨酸轉變為二羥基苯丙氨酸，而二羥基苯丙氨酸是多巴胺的前體，因此TH在多巴胺生物合成中發揮重要作用，TH含量變化與PD的發生、發展有著重要聯系[16]。本實驗發現，造模后的大鼠α-syn含量明顯增加，與空白組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，其行為學改變達到一定評分，說明PD模型可靠。與模型組相比較，中藥低劑量組、中劑量組、高劑量組α-syn含量明顯降低(P<0.05或P<0.01)，說明加味五虎追風散對α-syn異常聚集起到抑制作用，且要達到一定用藥劑量。在TH含量研究中，與空白組比較，模型組TH含量明顯降低，而中藥低劑量組、中劑量組、高劑量組TH含量較模型組增加，且中藥高劑量組TH含量增加最明顯，與中藥低劑量組、中劑量組比較差異有統計學意義(P<0.05)，說明加味五虎追風散能明顯增加PD模型大鼠腦黑質區TH含量，抑制多巴胺的損失，對PD模型大鼠起到了治療效果。

綜上所述，本實驗從PD發病的關鍵因素α-syn異常聚集和TH含量變化入手，發現加味五虎追風散對大鼠黑質紋狀體區α-syn異常聚集具有抑制作用，而且能提高TH含量水平，從而對多巴胺能神經元有一定的保護作用，為進一步探討加味五虎追風散在PD中的靶向治療機制提供了實驗依據。