高大平房倉稻谷糧層霉菌量與優勢霉菌的差異性研究

鄭云飛 葛志文 劉 慧 周建新 邱偉芬

(南京財經大學食品科學與工程學院；江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，南京 210023)

我國是糧食消費大國，稻谷在我國飲食結構中占據重要的地位，為保證糧食安全，國家在糧食戰略上制定了儲備糧政策[1,2]。2016年，我國稻谷總產量超2億t，其中稻谷存儲量超1億t。因自身生理生化變化及與外界環境間的相互作用，稻谷儲藏中可能遇到各種安全問題[3,4]。

稻谷在儲藏過程中最常見的微生物污染類群有放線菌、酵母菌、細菌和霉菌等[5]，其中對稻谷品質危害最大且最容易滋生的是霉菌。所以研究霉菌總數的變化情況對降低儲糧損耗具有重要意義，而且有效控制稻谷儲藏過程中由于霉菌污染而造成的產量損失，及控制高大平房倉稻谷的霉菌數量顯得尤為重要。

傳統的真菌鑒定方法主要是觀察真菌在培養基上的顏色、形狀、生長狀態、生長速率及其在顯微鏡下的形態，進而確定真菌的種屬地位。但是對于在培養基上培養的不產孢子的真菌，就無法利用形態學進行觀察[6]。隨著分子生物學技術的快速發展，在真菌鑒定分類中，核酸序列分析的方法已被廣泛應用。目前常用的分子生物學方法有18SrDNA、ITS(internal transcribed spacer,ITS)序列分析技術。國內對儲糧微生物活動規律和優勢霉菌鑒定的研究已有報道。田國軍等[7]研究了不同儲藏條件下稻谷霉菌總數變化規律研究，研究表明由于上層稻谷受環境影響較大，其霉菌總數波動大于中、下層稻谷霉菌總數的波動，中、下層稻谷經過冬季通風降水降溫后，糧溫一直處于較低水平，因此霉菌總數較為穩定。和肖營等[8]研究了從實驗稻谷中通過分離培養了一株可培養真菌優勢菌，經18SrDNA和ITS序列鑒定其為擴展青霉。都立輝等[9]在4個地區的淮稻5號稻谷中分離出真菌33株，主要包括青霉、曲霉和鐮刀菌等菌屬，其中青霉屬與曲霉屬為優勢菌，分別為16株和15株。國外研究學者也證實污染稻谷的真菌主要是曲霉、青霉、鐮刀菌[10-14]。Ok等[15]對韓國6個區域80份新收稻谷樣品的霉菌調查中，發現鐮刀菌屬是優勢菌，其次是青霉屬、皰霉屬、漆斑菌屬、分子孢子菌屬。本研究分析了湖南與湖北省高大平房倉稻谷上中下三層的霉菌量差異及各層優勢霉菌的分離與鑒定。利用傳統的平板分離法將稻谷中可培養優勢菌進行分離培養，并利用形態學及分子生物學兩種手段相結合的方法對其中的優勢菌進行種屬的鑒定。湖南省、湖北省為我國稻谷的主產區，2省的稻谷年產量在全國排名分別位列第1、第5，兩地氣候均潮濕多雨，倉儲稻谷易發霉。而且不同地區種植的稻谷品種不同，氣候及儲藏條件也不一致，會導致糧堆不同位置的稻谷品質與微生物污染情況各有差別。國內外對于稻谷糧堆不同位置稻谷品質及微生物污染情況的差異研究報道很少。因此， 研究高大平房倉內糧堆不同位置稻谷霉菌數量及微生物污染情況的差異，對我國的稻谷儲藏有重要意義。在本研究中，利用了傳統培養的方法分離培養了湖南與湖北兩省糧倉內不同糧層的優勢霉菌，并對兩省糧倉不同層的霉菌量進行了比較，并利用形態學及分子生物學的方法對優勢霉菌進行鑒定，對糧倉霉菌量防控及霉菌種類鑒定具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從湖南與湖北兩省2015年與2016年糧庫中采集稻谷樣品，稻谷樣品依照三層五點法(糧倉上、中、下三層，每層四個角落和中間設為采樣點)，稻谷樣品在溫度(20±5) ℃ 和相對濕度(50±5)%的糧倉常規儲藏條件下進行儲藏。取樣后，每種樣品每層每點稱量5 g，將每層5個點的稻谷樣品混勻，制得25 g的混合稻谷樣品，分別標記為HNS1(上層、中層、下層)、HNS0(上層、中層、下層)、HBS1(上層、中層、下層)、HBS0(上層、中層、下層)，在均質袋中4 ℃保藏。

1.2 試驗試劑與儀器

SF-CF-2A超凈工作臺；VOSHIN-600R無菌均質機；ES-08B電子天平；BIOLOG ECO平板；LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌器；101-3AS型電熱鼓風干燥箱；GNP-9160型隔水式恒溫培養箱；ZEISS AXIO Scope A1顯微鏡；50%乙醇；乳酸石炭酸棉藍染液。

1.3 試驗方法

1.3.1 稻谷中優勢霉菌的分離培養與保存

對本試驗稻谷按照國標GB 4789.15—2010進行傳統培養后，拍照記錄霉菌菌落生長情況，并從中分離出單菌落，將該菌點接種到高鹽察氏瓊脂培養基上。并于28 ℃恒溫培養箱中培養，培養6 d后將該菌株保存于10%的甘油中，備用。

1.3.2 糧庫糧層霉菌菌落計數

可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數器，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位(CFU)表示。若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在10～150 CFU范圍內，按式(1)計算：

(1)

式中：N為樣品中菌落數；∑C為平板(含適宜范圍菌落數的平板)菌落數之和；n1為第一稀釋度(低稀釋倍數)平板個數；n2為第二稀釋(高稀釋倍數)平板個數；d為稀釋因子(第一稀釋度)。

1.3.3 形態學觀察1.3.3.1 霉菌培養特性的觀察

將保存的霉菌接種于察氏瓊脂培養基上，第六天觀察其優勢霉菌形態并拍攝菌落照片，根據霉菌的生長速度，培養時間，以及其菌落顏色，氣味，形態，質地對其進行初步的判斷。

1.3.3.2 霉菌顯微特征鑒定

挑取菌落邊緣的氣生菌絲，制片。將其置入顯微鏡觀察。觀察其是有性或是無性繁殖，營養菌絲的情況，其在顯微鏡下的形態、顏色和大小。著重觀察其菌絲形態及其分生孢子頭的形態，并拍攝菌絲及孢子照片。根據霉菌的顯微特征對其進行初步鑒定。

1.3.3.3 霉菌的顯微特性分析

使用顯微鏡在400倍鏡下選擇合適的霉菌，換用1 000倍高倍鏡進行觀察。需找到所需的霉菌顯微特征后，進行調焦使其在視野里清晰可見。將顯微鏡調節到拍照模式，在電腦上對視野里的霉菌進行觀察，并適當調整焦距和色彩對比度，使所選的霉菌顯微特征能在電腦屏幕清晰可見，控制電腦對圖像進行捕捉。可用攝像機對不同對比度及焦距的霉菌進行拍攝，根據所需內容與拍攝結果，選取最為合適的照片。

1.3.4 分子生物學方法1.3.4.1 基因組DNA的提取

取25 μL保存于甘油的菌液,加入25 μL的真菌裂解液,85 ℃裂解15 min。提取的基因組DNA在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測(105 V,45 min),然后用溴化乙錠(EB)染色,4 ℃保存備用,或者于-20 ℃中長期保存。

1.3.4.2 ITS基因片段的PCR擴增

ITS區域的擴增選擇真核生物ITS通用擴增引物，正向引物為ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG反向引物為ITS4：TCCTCCGCTTATTGATAT；PCR的擴增條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共30個循環，最后72 ℃延伸10 min。

PCR擴增采用的50 μL反應體系，包括19 μL的ddH2O，25 μL的Mix，2 μL上游引物，2 μL下游引物，2 μL模板，PCR擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，溴化乙錠(EB)染色后，于4 ℃保存備用。

1.3.4.3 PCR擴增所得序列的測定

用瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA進行純度的檢測，確認電泳顯色條帶單一，可以進行擴增。運用PCR技術對其進行擴增，擴增的產物使用膠回收方法進行純化。

1.3.4.4 DNA序列測序

將ITS的單克隆PCR產物交由南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。獲得序列后，在GenBank數據庫中進行BLAST比對,進而確定菌株的種屬類別。

1.4 數據處理

使用Origin 8.5對試驗數據作圖。

2 結果與分析

2.1 糧倉中各層霉菌菌落數比較結果

由圖1及圖2可知，各層霉菌量均在104～105CFU/g數量級，稻谷處于安全儲藏狀態。從層數上看，湖南省儲藏一年的霉菌數上層為1.1×103CFU/g，中層為6.4×103CFU/g，下層為1.4×103CFU/g，每層間距4 m(上層選在離糧庫表面0.5 m的位置、下層選在離糧庫地面0.5 m的位置，中層取糧庫一半的位置)；即湖南省儲藏一年的霉菌數上層<下層<中層，中層霉菌數最多，湖南省新入庫的霉菌數上層為8.6×102CFU/g，中層為1.3×103CFU/g，下層為1.2×103CFU/g，即湖南省新入庫的霉菌數上層<下層<中層，中層霉菌數最多；湖北省儲藏一年的霉菌數上層為1.2×104CFU/g，中層為1.3×104CFU/g，下層為1.4×104CFU/g，即湖北省儲藏一年的霉菌數上層<中層<下層，下層霉菌數最多；湖北省新入庫的霉菌數上層為1.4×104CFU/g，中層為9.6×102CFU/g，下層為8.0×103CFU/g，即湖北省新入庫的霉菌數中層<下層<上層，上層霉菌數最多。

圖1 傳統培養菌落形態

圖2 糧堆不同深度稻谷的霉菌量比較

2.2 糧層中各層優勢菌株的形態學鑒定

從湖南與湖北兩省不同儲藏時間的糧庫中共分離出17種霉菌，如圖3。糧倉上層的優勢霉菌為圖3(4)、圖3(13)、圖3(16)；糧倉中層的優勢霉菌為圖3(4)、圖3(8)、圖3(16)；糧倉下層的優勢霉菌為圖3(4)、圖3(8)、圖3(12)、圖3(16)。經過霉菌培養基特性及1 000倍的光學顯微鏡觀察，從圖3(4)中可以看出，菌落在察氏瓊脂上培養6 d后菌落直徑達到了5～6 cm，菌落正面呈現黃綠色，菌落表面呈絮狀；在1 000倍光學顯微鏡下，分生孢子頭的頂囊呈近球形，分生孢子頭緊密，孢子梗較光滑，小梗雙層，小梗頂端的孢子呈球形。從圖3(8)中可以看出，菌落在察氏瓊脂上培養6 d后菌落直徑為1～2 cm，6 d后菌落表面有部分區域呈現淺黃色，背面從白色逐漸變成淡黃色，菌落表面呈絨狀；在1 000倍光學顯微鏡下，大部分分生孢子頭的頂囊呈近球形，小梗生長較為疏松，孢子近球形。從圖3(12)中可以看出，菌落在察氏瓊脂上培養6 d后菌落直徑為2 cm，菌落表面呈灰藍色至暗藍色，初期稍淡，老后漸深，近于暗藍灰綠色，背面為白色，6 d后背面從白色逐漸變成淡黃色，菌落質地為絲絨狀至絮狀，致密。在1 000倍光學顯微鏡下，分生孢子頭的頂囊呈近球形，分生孢子頭疏散，孢子梗較光滑，小梗單層或雙層，小梗頂端的孢子呈球形。從圖3(13)中可以看出，菌落在察氏瓊脂上培養6 d后菌落直徑為2～3 cm，菌落初期為淺黃色，背面為淺黑色，培養6 d后，菌落表面呈現黃黑色，背面從淺黑色逐漸變成黑色。在1 000倍光學顯微鏡下，分生孢子頭的頂囊呈半球形，分生孢子頭上的小梗較為疏松，且雙層，小梗頂端的孢子呈近球形。從圖3(16)中可以看出，菌落在察氏瓊脂上培養6 d后菌落直徑為3～5 cm，菌落表面初為白色，后變為鮮黃色直至黑色厚絨狀，背面中央略帶黃褐色；在1 000倍光學顯微鏡下，分生孢子頭褐黑色放射狀，分生孢子頭的頂囊呈球形，雙層小梗，分生孢子褐色球形。

注：1～17為霉菌菌落表面；1′～17′為霉菌菌落背面；1″～17″為1 000倍光學顯微鏡下霉菌的特征形態。圖3 優勢霉菌的特征

2.3 分子生物學分析

經測序，將其擴增出來的基因序列在GenBank進行BLAST，發現圖3(4)與Aspergillus flavus的各種菌株相似度最高，與Aspergillus flavus ver-1、Aspergillus flavus isolate AF70、Aspergillus flavus isolate BN008等黃曲霉菌株的匹配一致性均為99%及以上。證明篩選出來的優勢菌株是黃曲霉。圖3(8)與Aspergillus candidus的各種菌株相似度最高，與Aspergillus candidus strain CHNSCLM-0393、Aspergillus candidus isolate TN-1、Aspergillus candidus strain RA16-10等白曲霉菌株的匹配一致性均為99%及以上。證明篩選出來的優勢菌株是白曲霉。圖3(12)與Aspergillus flavus的各種菌株相似度最高，與Aspergillus sp. isolate C7、Aspergillus sydowii strain CBS 128131、Aspergillus sydowii strain CBS 122.27等聚多曲霉菌株的匹配一致性均為99%及以上。證明篩選出來的優勢菌株是聚多曲霉。圖3(13)與Fungal endophyte voucher的各種菌株相似度最高，與Fungal endophyte voucher ARIZ:DM0184、Fungal endophyte voucher ARIZ:DM0130等內生真菌菌株的匹配一致性均為100%。證明篩選出來的優勢菌株是內生真菌菌株。圖3(16)與Aspergillus niger的各種菌株相似度最高，與Aspergillus niger strain BLIG、Aspergillus niger isolate J1、Aspergillus niger ATCC 16888等黑曲霉菌株的匹配一致性為100%。證明篩選出來的優勢菌株是黑曲霉。

綜合菌落、菌絲、孢子形態及ITS基因序列結果可知，糧倉上層的優勢霉菌為黃曲霉菌株、內生真菌菌株、黑曲霉菌株；中層的優勢霉菌為黃曲霉菌株、白曲霉菌株、黑曲霉菌株；下層的優勢霉菌為黃曲霉菌株、白曲霉菌株、聚多曲霉菌株、黑曲霉菌株。

3 討論

本研究的霉菌量在104～105CFU/g，而周建新等[16]研究了稻谷儲藏穩定性與霉菌量有關，霉菌量在104CFU/g以下，稻谷處于正常的儲藏狀態,達到105CFU/g時開始發生霉變，106CFU/g以上時霉變已經相當嚴重。說明糧庫中稻谷處于正常的儲藏狀態。本研究的高大平房倉糧庫中，湖南省糧倉稻谷中層霉菌數最多，湖北省儲藏一年的稻谷下層霉菌數最多，湖北省新入庫的稻谷上層霉菌數最多。王榮雪等[17]研究了稻谷糧堆不同位置的霉菌數量級，中層的霉菌數量最多，其次是上層，下層最少。主要優勢霉菌為曲霉屬的灰綠曲霉、黃曲霉和白曲霉。說明糧倉不同位置的霉菌數和菌相會發生變化。

謝茂慧等[18]研究兩次調查同一地區的大米進行比較顯示，霉菌的菌相有很大的差異。所以本文研究的高大平房倉糧層霉菌數量與優勢霉菌差異會隨著客觀條件的變化而變化著，而不是永遠不變的。和肖營等[19]在粳稻4 t實倉儲藏1年后優勢菌種的分離與鑒定中發現亮白曲霉和溜曲霉為其中的優勢菌。本研究也發現白曲霉菌株，說明兩種菌株均為稻谷中常見菌。

鑒于黃曲霉、白曲霉、聚多曲霉、內生真菌、黑曲霉具有產生真菌毒素的可能性，其在稻谷中的生長及其真菌毒素的產生情況需要引起人們的進一步重視。本研究對高大平房倉不同糧層霉菌的霉菌數量及霉菌的分離鑒定為糧倉不同位置的污染情況及優勢霉菌的檢測提供了基礎，對其真菌毒素的產生情況仍需進一步研究。

4 結論

本研究的高大平房倉糧庫中，湖南省儲藏一年的糧倉稻谷霉菌數上層為1.1×103CFU/g，中層為6.4×103CFU/g，下層為1.4×103CFU/g；即湖南省儲藏一年的霉菌數上層<下層<中層。湖南省新入庫的糧倉稻谷霉菌數上層為8.6×102CFU/g，中層為1.3×103CFU/g，下層為1.2×103CFU/g，即湖南省新入庫的霉菌數上層<下層<中層，說明湖南省儲藏一年稻谷與新入庫稻谷中層霉菌數最多；湖北省儲藏一年的糧倉稻谷霉菌數上層為1.2×104CFU/g，中層為1.3×104CFU/g，下層為1.4×104CFU/g，即湖北省儲藏一年的霉菌數上層<中層<下層，說明湖北省儲藏一年的糧倉稻谷下層霉菌數最多；湖北省新入庫的糧倉稻谷霉菌數上層為1.4×104CFU/g，中層為9.6×102CFU/g，下層為8.0×103CFU/g，即湖北省新入庫的霉菌數中層<下層<上層，上層霉菌數最多。

糧倉上層的優勢霉菌為黃曲霉菌株、內生真菌菌株、黑曲霉菌株；中層的優勢霉菌為黃曲霉菌株、白曲霉菌株、黑曲霉菌株；下層的優勢霉菌為黃曲霉菌株、白曲霉菌株、聚多曲霉菌株、黑曲霉菌株。