稻蝦共作模式下稻田土壤氨氧化微生物豐度和群落結構的特征

王 蓉，朱 杰，金 濤*，劉章勇

（1 長江大學農學院/濕地生態與農業利用教育部工程研究中心，湖北荊州 434025；2 湖北省襄陽市農業科學院，湖北襄陽 441057）

土壤是生物圈內發生氮素循環的主要場所，而土壤微生物是推動氮循環過程的主要成員。其中，由微生物所驅動的過程主要包括了固氮作用、氨化作用、硝化作用和反硝化作用四個過程[1-2]。氨氧化作用作為硝化作用的限速步驟，影響著整個硝化作用的進程[3]。因此，大批學者開展了對氨氧化細菌(ammonia oxidizing bacteria，AOB)與古菌 (ammonia oxidizing archaea，AOA) 的研究工作。稻蝦共作是一種利用稻田淺水環境，通過在稻田四周開挖環形溝、加高加固田埂、輔以防逃設施，既種稻又養蝦的高效生態種養模式。其共生原理是以廢養缺、互利共生、化害為利。稻蝦共作的優點主要有以下幾個方面[4-6]:一是種養結合、共生互利，小龍蝦可食除一些蟲草，其糞便能夠增加土壤有機質，有利于水稻生產；二是循環安全，稻蝦共作減少了化肥、農藥的使用量，有效改善了農田生態環境，提高了稻米和小龍蝦的品質；三是節約土地、提高收益，稻蝦共作可以充分利用低湖冷浸田，提高土地利用率，降低生產成本。當前，我國農業正面臨資源與環境約束和農民增收難度加大的難題，稻蝦生態種養高效模式的興起，被農業部譽為“現代農業的一次革命”，在長江中下游地區得到了大面積的推廣。

由于稻蝦田常年浸泡，長期處于厭氧或干濕交替的狀態，硝化-反硝化作用強烈，顯著影響由微生物驅動的土壤氮循環過程，因此稻蝦共作模式下土壤微生物的數量、群落多樣性及結構對于發展稻蝦共作高效生態友好型農業具有重要意義。長期以來，人們一直認為氨氧化作用的主要參與者是氨氧化細菌，后有研究發現氨氧化古菌也參與了氨氧化作用，并且具有與氨氧化細菌相同的氨單加氧酶參與編碼的基因amoA，這些研究發現為研究參與土壤氮素的硝化過程微生物提供了新的思路。隨著熒光定量PCR、DGGE、高通量測序等分子技術在我國的快速發展，針對氨氧化微生物的研究主要集中在不同類型農田土壤，如酸性紅壤、堿性潮土、旱地土壤以及土壤含水量、不同施肥模式與pH 等因素下氨氧化細菌與古菌的群落豐度、多樣性及群落組成進行了系統的研究[7-8]。其中有研究表明農田環境中AOA 的數量遠高于AOB 的數量[9]；He 等[10]通過對酸性紅壤的研究發現，AOA 和AOB 在稻田土壤的豐度均與土壤硝化潛勢 (PNR) 呈顯著正相關關系，且在紅壤中AOA 的豐度遠高于AOB，此外，土壤pH 對AOA 的結構組成的影響強度高于AOB；有研究發現高氮量化肥的投入可顯著增加AOB 的數量并改變AOB 的群落組成，但對AOA 無顯著影響[11]；楊亞東等[12]研究發現華北平原地區堿性小麥土壤表層AOB 比AOA 對氮肥的響應更靈敏，且施氮可以顯著改變AOB 的數量及結構，但對AOA 無顯著影響；劉若瑄等[13]研究證明相比氨氧化古菌，氨氧化細菌對土壤水分的響應更加顯著。

由于稻蝦田土壤長期處于淹水的狀態，僅在水稻曬田期出現短期土壤落干情況，導致稻蝦田長期浸泡水下形成了特殊的區域小環境，氧化還原過程強烈并顯著影響著由微生物驅動的地球生物化學循環。有研究表明[6]，稻蝦輪作的常年泡水特點加劇了土壤潛育化過程且隨著年限的增長，土壤易氧化態有機碳含量高于常規稻田模式。蔡晨等[14]對江漢平原稻蝦輪作模式下水稻土的土壤理化性質研究結果顯示，長期稻蝦輪作可增加土壤pH、氮磷鉀等養分。前人對稻蝦田間雜草多樣性調查的結果顯示，稻蝦輪作模式下由于龍蝦的活動導致稻田雜草發生率下降且降低了雜草的多樣性及豐富度[15]。佀國涵等[16]研究結果顯示稻蝦輪作模式增加了土壤微生物活性及群落多樣性。綜上所述，稻蝦共作模式對土壤環境影響較大，且有研究證實土壤氨氧化微生物對環境因子的響應較大。迄今為止，關于稻蝦共作模式的研究主要集中在該模式的生態種養技術、經濟效益以及對稻田土壤理化性質的影響等方面[16-17]，卻鮮有關于稻蝦土壤氨氧化微生物方面的研究報道。因此，開展稻蝦共作模式下土壤氨氧化微生物群落演變規律的研究對于稻蝦共作模式的推廣具有重要意義。本研究通過設置常規中稻模式與稻蝦共作種養模式，在研究土壤基本理化性質的基礎上，借助熒光定量PCR 和Illumina Miseq 高通量測序平臺等分子生物學技術研究土壤氨氧化微生物的基因豐度及群落結構，旨在揭示稻蝦共作模式下土壤氨氧化作用的原理，為稻蝦共作模式的生態研究和推廣提供理論和實際指導，為稻蝦共作田間管理提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗位于江漢平原腹地的湖北省荊州市長江大學農學院試驗基地，該地水源充沛，溫光資源充足，屬典型的亞熱帶季風性氣候。試驗地土壤基本理化性質為:pH 7.5、有機質38.8 g/kg、全氮0.75 g/kg、全磷0.54 g/kg、速效鉀17.09 mg/kg。試驗于2014—2016 年連續開展兩年，設置常規中稻 (MR)和稻蝦共作 (CR) 兩種模式，并設置3 次重復，試驗田呈矩形，長12 m、寬5 m。供試水稻品種為“隆兩優華占”，小龍蝦品種為克氏原鰲蝦 (Procambarus clarkii)。所施肥料為尿素 (N 46%)、過磷酸鈣 (P2O512%)和氯化鉀 (K2O 60%)，年均純養分施用量為N 180 kg/hm2、P2O575 kg/hm2、K2O 105 kg/hm2。氮肥按基肥∶蘗肥 為6∶4 施用，磷肥全部基施，鉀肥按基肥∶追肥為5∶5 施用。常規中稻模式稻作期田間前期灌水、中期短暫曬田、后期覆水。稻蝦共作模式稻作期為每年6 月至9 月，9 月底水稻收獲后覆水泡田養蝦。蝦苗按15 × 104～20 × 104只/hm2的密度于水稻收獲后投放，次年4 月中下旬至6 月上旬捕撈成蝦，捕蝦完成后進行下一季水稻種植，如此循環往復。兩種模式下的水稻秸稈全量還田，其他田間管理措施完全相同。

1.2 土壤樣品采集

土壤樣品采集分為兩部分。一部分用土鉆在田間選取5 點采集土樣并混合 (5 點采樣法)，存放備土壤基本理化性質測定使用。將土樣去除根系、石子等雜物在陰涼處風干，磨碎后過8 mm 鐵篩，用于土壤全氮、全碳、堿解氮及pH 的測定。另外一部分土壤用于土壤微生物的測定，土壤微生物樣品于2016 年水稻抽穗期采集。需在采樣時用谷物采樣器采集0—10 cm 表層土，去除土壤根系、石子及其他雜物，即刻用錫箔紙包裹好土樣，放入液氮帶回實驗室，存放于-80℃冰箱待測定。

1.3 指標測定與方法

1.3.1 土壤理化性質測定 土壤基本理化性質測定參考鮑士旦第三版《土壤農化分析》。土壤全氮、全碳使用元素分析儀 (ECS4024，Costech，Italy) 測定；堿解氮測定采用堿解擴散法；土壤硝態氮、銨態氮含量采用2 mol/L KCl 溶液浸提，流動分析儀(AA3，BRAN + LUEBBE，德國) 測定；pH 采用電位法 (水∶土 = 2.5∶1) 測定。

1.3.2 土壤DNA 提取與熒光定量PCR 分析 土壤總DNA 利用DNA 試劑盒 (PowerSoil? DNA Isolation Kit，Mobio，USA) 進行提取。取經-80℃低溫保存的土壤鮮樣0.25 g，用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA，提取的DNA 的濃度與純度用NanoDrop ND-1000UVevis 分光光度計 (ThermoScientific，Rockwood，TN，USA) 檢測。參照電泳檢測結果，將PCR 產物采用QuantiFluorTM-ST 藍色熒光定量系統，在ABI7500 熒光定量PCR 儀 (ABI，CA，USA)上進行定量檢測。選取不同的特異性引物對AOA amoA、AOB amoA 基因進行PCR 擴增，所用的引物序列及擴增所用的體系如表1 所示。

1.3.3 PCR 產物的回收和純化 所用的樣品均參照正式實驗的條件進行，每個樣品采用3 次重復，同一樣本的混合PCR 產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，PCR 產物回收采用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒進行切膠，TrisHCL 洗脫，檢測采用2%瓊脂糖凝膠電泳進行。

1.3.4 Illumina Miseq 高通量測序 PCR 產物回收后測定其濃度，之后根據每個樣本測序量的要求，將兩種模式的樣品混勻，使各模式用于測序的樣品DNA 濃度保持一致，雙末端測序采用Illumina Miseq 測序平臺進行，本試驗的測序工作委托上海美吉生物醫藥科技公司完成。

首先根據PE reads 之間的overlap 關系，將成對的reads 拼接為一條序列，同時對reads 的質量和merge 的效果進行質控過濾，有效序列可依據序列首位兩端的barcode 和引物序列來區分樣品得到，將序列方向進行校正，得到優化數據。

表 1 熒光定量PCR 擴增引物及反應程序[11]Table 1 Real-time PCR amplification of primers and reaction procedures

操作分類單元 (operational taxonomic units，OTU) 是在系統發生學或群體遺傳學研究中，為了便于進行分析人為給某一個分類單元 (品系，屬，種、分組等) 設置的同一標志。要了解一個樣本測序結果中的菌種、菌屬等數目信息，就需要對序列進行歸類操作 (cluster)。通過歸類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，一個小組即一個OTU。可根據不同的相似度水平，對所有序列進行OTU 劃分，通常在97%相似水平下的OTU 進行生物信息統計分析。使用軟件Usearch7.1 平臺，按照97%相似性對非重復序列 (不含單序列) 進行OTU 聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU 的代表序列。基于OTU 分類可進行α 多樣性分析與β 分析。采用RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU 代表序列進行分析，得到對應的每個OTU 的物種分類信息，并分別在domain (域)、kingdom (界)、phylum(門)、class (綱)、order (目)、family (科)、genus(屬)、species (種) 各個分類水平下統計樣本的群落組成。

1.4 數據處理

采用軟件SPSS22.0 對土壤基本理化性質、AOA 和AOB amoA 基因拷貝數以及群落α 多樣性指數 (Shannon、ACE、Chao1、Simpson 以及Sobs)進行單因素方差分析與Personal 相關性分析。使用R 軟件工具制作群落柱形圖、Venn 圖。采用CANOCO 5.0 軟件對土壤理化性質和AOA，AOB amoA 基因群落結構進行冗余分析 (redundancy analysis，RDA)。

2 結果與分析

2.1 不同模式下土壤基本理化性質

常規中稻模式與稻蝦共作模式下的土壤理化性質如表2 所示。方差分析結果表明，稻蝦模式改變了部分土壤理化性質。其中，稻蝦共作模式下的土壤全碳、全氮、硝態氮含量均顯著高于常規中稻模式，堿解氮含量與銨態氮含量均高于常規中稻模式，差異不顯著 (P ＞ 0.05)；稻蝦共作模式下C/N 與pH 低于常規中稻模式，差異不顯著 (P ＞ 0.05)。研究結果表明，相比常規中稻種植模式，稻蝦共作顯著增加了土壤硝態氮、全碳、全氮含量，對堿解氮、C/N 及pH 沒有顯著影響。

2.2 稻蝦共作對稻田土壤AOA 與AOB 群落α 多樣性指數的影響

Ace 指數、Chao 指數、Sobs 指數反映了群落的豐富度，指數值越大表示群落豐富度越高。從表3可知，常規中稻模式Ace 指數、Chao 指數、Sobs 指數依次為49.79、49.53、47.67，稻蝦共作模式依次為33.26、32.42、32.33，單因素方差分析表明，稻蝦共作模式AOA 群落三個指數均顯著低于常規中稻模式 (表3)。Shannon 指數和Simpson 指數反映群落的多樣性，Shannon 指數值越高，表示群落多樣性越高，而Simpson 指數值越高，表示群落多樣性越低。稻蝦共作模式AOA 的Shannon 指數 (1.54)與常規中稻模式 (1.73) 差異不顯著，但是稻蝦共作模式的Simpson 指數 (0.36) 顯著高于常規中稻模式(0.26)。表明較常規中稻模式，稻蝦共作模式顯著降低了稻田土壤AOA 群落豐富度及群落多樣性。

由表3 中AOB 結果可知，常規中稻模式的Ace 指數、Chao 指數、Sobs 指數依次為34.03、33.67、33.00，稻蝦共作模式依次為26.13、26.00、26.00，兩模式AOB 多樣性指數單因素方差分析差異均不顯著。稻蝦共作模式的Shannon 指數和Simpson指數與常規中稻模式差異均不顯著，表明稻蝦共作模式對稻田土壤AOB 微生物群落豐富度及群落多樣性均沒有顯著影響。

表 2 稻蝦共作和常規中稻模式稻田土壤理化性質Table 2 Physicochemical properties in paddy fields under integrated rice-crayfish farming and conventional middle rice systems

表 3 稻蝦共作模式和常規中稻模式土壤氨氧化微生物群落α 多樣性指數Table 3 Alpha diversity indices of soil ammonia oxidizers in integrated rice-crayfish farming system and conventional middle rice system

2.3 稻蝦共作對稻田土壤AOA 和AOB 的amoA基因豐度的影響

AOA 和AOB amoA 基因定量分析結果顯示，稻蝦共作模式AOA 和AOB 的amoA 基因豐度分別為3.13 × 105和7.01 × 105copies/g 干土，常規中稻模式的AOA 和AOB 的amoA 基因豐度分別為1.41 ×105和3.87 × 105copies/g 干土，稻蝦共作模式AOA 和AOB 的amoA 基因豐度均顯著高于常規中稻模式 (P ＜ 0.05) (圖1)，且在兩種模式中，AOB amoA 的基因豐度高于AOA amoA 的基因豐度。

2.4 稻蝦共作對土壤中AOA 和AOB 的amoA 基因物種組成的影響

對AOA amoA 基因物種水平進行Venn 分析 (圖2)，稻蝦共作模式和常規中稻模式共有14 個相同的物種，其中稻蝦共作模式獨有物種3 個，稻蝦共作模式增加了稻田土壤中AOA amoA 基因物種種類，增加了AOA 物種種類。AOB amoA 基因物種水平Venn 分析 (圖2) 結果顯示，稻蝦共作模式和常規中稻模式共有10 個相同的物種，其中稻蝦共作模式獨有物種3 個，常規中稻模式獨有物種4 個，兩種模式共有不同的物種7 個，占兩種模式物種總數的41.18%，占相同物種總數的70%。稻蝦共作模式改變了稻田土壤中AOB amoA 基因的物種組成，減少了AOB amoA 物種數目。

圖 1 稻蝦共作模式和常規中稻模式土壤AOA amoA 和AOB amoA 基因豐度Fig. 1 Abundance of AOA amoA and AOB amoA in integrated rice-crayfish farming system and conventional middle rice systme

圖 2 稻蝦共作模式和常規中稻模式土壤AOA amoA 和AOB amoA 基因微生物物種分類學組成Venn 圖Fig. 2 Venn drawings of AOA amoA and AOB amoA gene species taxonomy of rice-crayfish farming system and conventional middle rice system

2.5 稻蝦共作對AOA 和AOB 物種屬水平相對豐度的影響

樣品獲得的AOA amoA 基因微生物物種分類在3 個域、3 個界、7 個門、8 個綱、8 個目、8 個科、8 個屬和17 個種。將無法分類的序列定義為無法歸類，樣品獲得的AOA amoA 基因OTUs 在分類學域、界、門、綱、目、科、屬、種水平上可歸類比例為94.1%、88.2%、76.5%、76.5%、76.5%、76.5%、76.5%和52.9%。

在屬水平，常規中稻模式具有5 個相對豐度大于0.1%的菌屬 (表4)，按相對豐度從高至低依次是norank_c_environmental_samples_p_Thaumarchaeota(56.79%)、unclassified_k_norank_d_Archaea(29.82%)、norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota(11.01%)、norank_p_environmental_samples_k_norank(1.63%)、Nitrososphaera(0.7%)。稻蝦共作模式具有6 個相對豐度大于0.1%的屬 (表4)，按相對豐度從高至低依次是norank_c_environmental_samples_p_Thaumarchaeota(40.96%)、unclassified_k_norank_d_Archaea(30.38%)、norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota(25.93%)、norank_p_environmental_samples_k_norank(2.19%)、unclassified_k_norank_d_Bacteria(0.24%)、Nitrososphaera(0.29%)。對AOA 屬水平上相對豐度大于0.1% 的群落物種進行顯著性分析(表5)，結果顯示norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota在稻蝦共作模式中的相對豐度顯著高于常規中稻模式 (P ＜ 0.05)。

樣品獲得的AOB amoA 基因微生物物種分類在1 個域、1 個界、2 個門、4 個綱、6 個目、8 個科、11 個屬和17 個種。將無法分類的序列定義為無法歸類，樣品獲得的AOB amoA 基因OTUs 在分類學域、界、門、綱、目、科、屬、種水平上可歸類比例為100%、100%、94.1%、88.2%、82.4%、76.5%、70.6%和41.2%。

在屬水平上，常規中稻模式有8 個相對豐度大于0.1%的菌屬 (圖3)，相對豐度的大小從高到低依次是unclassified_k_norank_d_Bacteria (38.41%)、norank_f_environmental_samples (35.23%)、norank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteria(21.38%)、unclassified_o_Nitrosomonadales (3.47%)、Nitrosospira (0.37%)、environmental_samples_f_Nitrosomonadaceae (0.15%)、norank_c_environmental_samples_p_Proteobacteria、Nitrosomonas (0.13%)。稻蝦共作模式中有10 個相對豐度大于0.1%的優勢菌屬 (圖3)，相對豐度的大小從高到低依次為norank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteria(35.21%)、unclassified_k_norank_d_Bacteria(32.66%)、norank_f_environmental_samples(27.28%)、environmental_samples_f_Nitrosomonadaceae(2.63%)、Nitrosomonas(1.42%)、unclassified_o_Nitrosomonadales(0.31%)、unclassified_f_Nitrosomonadaceae(0.19%)、unclassified_p_Proteobacteria(0.14%)、unclassified_c_Betaproteobacteria(0.12%)。對AOB 屬水平上相對豐度大于 ＞ 0.1%的群落物種進行顯著性分析 (表6)，結果顯示稻蝦共作模式中environmental_samples_f_Nitrosomonadaceae與norank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteria的相對豐度顯著高于常規中稻模式 (P ＜ 0.05)。

表 4 稻蝦共作模式和常規中稻模式下土壤AOA amoA 基因群落屬水平物種組成 (相對豐度 ＞ 0.1%)Table 4 Species composition of AOA amoA gene community at gene levels under integrated rice-crayfish farming system and conventional middle rice system (relative abundance ＞ 0.1%)

表 5 稻蝦共作模式和常規中稻模式下土壤AOA 屬水平群落組成 (F 值)Table 5 Community composition of soil AOA genus under integrated rice-crayfish farming system and conventional middle rice system (F-value)

圖 3 稻蝦共作模式和常規中稻模式下土壤AOB amoA 基因群落屬水平組成 (相對豐度 ＞ 0.1%)Fig. 3 Genus distribution of AOB amoA gene community in fields under rice-crayfish farming system (CR) and conventional middle rice system (MR) (relative abundance ＞ 0.1%)

2.6 AOA 和AOB 群落結構與土壤理化性質的相關性

稻田土壤AOA 微生物菌屬與土壤理化性質冗余分析結果顯示 (圖4a)，對AOA 微生物群落結構影響最大的是硝態氮 (R2= 0.8073)，其次是總碳 (R2=0.8038)，影響順序為硝態氮 ＞ 總碳 ＞ 銨態氮 ＞ 堿解氮 ＞ pH。RDA 分析的前兩個軸共解釋了94.58%的群落變化，第一個軸解釋了62.20%，第二個軸解釋了32.38%。沿第一軸觀察，常規中稻模式與稻蝦共作模式在第一軸的正投影相距很遠，表明稻蝦共作模式對稻田土壤AOA 群落結構影響較大。

對稻田土壤AOB 微生物菌屬和土壤理化性質進行RDA 分析 (圖4b)，結果表明對AOB 微生物群落結構影響最大的是硝態氮 (R2= 0.9057)，其次是總碳(R2= 0.8387)，影響順序為硝態氮 ＞ 總碳 ＞ 銨態氮 ＞堿解氮 ＞ pH。RDA 分析的前兩個軸共解釋了95.04%的群落變化，第一個軸解釋了74.62%，第二個軸解釋了20.42%。沿第一軸觀察，MR2、MR3 與CR1、CR2 在第一軸的正投影相距很遠，MR1 與CR3 位置較近，表明稻蝦共作模式對稻田土壤AOB 的群落結構有一定的改變，但稻蝦共作與常規稻田的AOB 群落結構仍保持著一定的相似性。

表 6 稻蝦共作模式和常規中稻模式下土壤AOB 屬水平群落組成顯著性分析 (F 值)Table 6 Significant analysis of community composition of soil AOB genus under integrated rice-crayfish farming system and conventional middle rice system (F-value)

圖 4 AOA 和AOB 群落結構與土壤理化性質的冗余分析Fig. 4 Redundancy analysis (RDA) between AOA and AOB community structures and soil properties

3 討論

3.1 稻蝦共作對稻田土壤理化性質的影響

有研究表明[14]，長期稻蝦輪作有助于改善耕層土壤結構、增強土壤緩沖能力和提高pH 及氮、磷、鉀等速效養分含量。本研究結果表明，與常規中稻模式相比，稻蝦共作模式下土壤堿解氮、硝態氮、銨態氮、全氮、全碳含量有所增加，其原因可能是稻蝦共作模式下，投供小龍蝦食用的水草、小龍蝦排泄的糞便在微生物與分解酶的驅動下為土壤提供了豐富的碳源與氮源，另外小龍蝦的打洞行為對土壤的物理結構產生影響。

3.2 稻蝦共作對稻田AOA 與AOB 數量的影響

AOA 和AOB 是影響土壤氮素循環的關鍵微生物，控制著土壤氨氧化反應的進行，直接影響著土壤肥力及土壤N2O 的排放情況。前人研究表明，在中性及堿性土壤中，施肥尤其是大量氮肥的投入可明顯增加AOB 的數量[10,18]。楊亞東等[7]研究結果顯示，施氮肥顯著增加了華北平原地區麥田土壤AOB的數量，但對AOA 無明顯影響。解開治等[19]研究表明，有機無機配肥可提高酸性冷浸田土壤AOB 數量。大量的研究說明土壤肥力情況與AOA、AOB 的數量之間有著緊密的關系。賀紀正等[1,20]在土壤氮素轉化的關鍵微生物機制中曾表明土壤pH 是影響氨氧化古菌和細菌組成分布的主要驅動因子之一。本研究土壤屬于偏堿性土壤，更適宜AOB的生長。研究發現，在長期不同施肥模式下的酸性水稻土中，AOA的基因豐度變化相比AOB 更加明顯，而AOA 在酸性土壤中的活性表現的更加突出[21]。同時在森林土壤、茶園等酸性土壤中，AOA 的存在更能說明其在酸性土壤中，其活性與數量要高于AOB[22-24]。根據我國酸性茶園土壤的調查研究發現，AOA 與AOB 的比值隨著p H 值的升高呈下降趨勢，同時表明AOB 相比AOA 更易被pH 值影響[25]。本研究中，不同種植模式中AOB 的數量均顯著高于AOA，稻蝦共作模式中AOB 與AOA 的比值為2.24，常規中稻模式中AOB 與AOA 的比值為2.74，與前人的研究結果一致，進一步證實了偏堿性的土壤更適合AOB的生長[26-28]。NH3的氧化是氨氧化微生物生長的唯一能量來源，在偏堿性的土壤中，銨能夠解離出的NH3濃度較高，更有利于對NH3具有相對較低親和力的AOB 生長[29]。因此，偏堿性的pH 值條件及其他環境因子決定了兩種模式的稻田土壤的氨氧化微生物的AOB 的豐度優勢。結果分析表明稻田AOB的數量顯著高于AOA，說明該地區稻田土壤中AOB 在氨氧化過程中起主導作用，且稻蝦共作模式下，土壤AOA 與AOB 的含量均高于常規中稻模式。李虎等[30]研究表明土壤硝態氮是影響AOA 和AOB豐度的主要環境因素之一；邱珊蓮等[31]通過雞糞堆肥試驗研究得出硝態氮濃度與氨氧化微生物的豐度有著密切的聯系，因此硝態氮含量是影響氨氧化細菌與古菌數量差異的原因。本研究中，稻蝦共作模式下土壤硝態氮含量高于常規中稻模式，因此硝態氮含量可能是導致稻蝦共作模式與中稻種植模式間AOA 與AOB 數量差異的原因。

3.3 稻蝦共作對稻田AOA 及AOB 群落多樣性的影響

景曉明[32]研究發現長期施肥對黃泥田水稻土壤AOA 和AOB 群落多樣性影響不顯著，而方宇等[33]研究表明，長期單施化肥提高了土壤AOA 的多樣性，而有機無機肥配施降低了AOA 的多樣性；本研究結果顯示，稻蝦共作模式下稻田土壤AOA 群落多樣性發生顯著變化，然而AOB 群落多樣性無明顯變化。解開治等[34]研究表明，硝態氮、總氮、溫度、亞硝態氮這4 個環境因子對氨氧化古菌群落結構演替及群落多樣性的影響最為顯著；Auguet 等[35]研究表明，氨氧化過程中硝態氮含量的變化會導致AOA 豐度及多樣性的變化。因此，稻蝦共作模式稻田土壤中硝態氮含量和全氮的含量的增加可能是土壤AOA 群落多樣性及群落結構發生顯著性改變的主要原因。AOB由于較適應這種偏堿性的環境[36]，對NH3具有較低的親和力，受銨態氮的含量影響較大，銨態氮沒有顯著變化，其多樣性指數及群落結構無顯著變化。由于本研究只是針對短期稻蝦共作土壤的研究，土壤微生物群落多樣性在長期進行稻蝦共作的環境條件下的演變趨勢仍有待進一步的研究論證。

3.4 稻蝦共作對稻田AOA 及AOB 群落組成與結構的影響

目前，對于稻蝦共作中的土壤物理化學性質的研究較多，然有關稻蝦共作模式對水稻土壤AOA與AOB 群落結構影響的研究報道尚為不多。本研究結果表明稻蝦共作模式顯著改變了norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota 與environmental_samples_f_Nitrosomonadaceae、norank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteria菌屬分別在AOA 與AOB 屬水平群落結構中的相對豐度，導致AOA 與AOB 的群落結構在屬水平上存在差異，且對AOB群落組成的影響強于AOA 群落結構，這些差異可能是土壤類型或特定的稻田環境本身所決定的。前人研究表明，土壤pH[37]、土壤類型[38]以及NH3濃度[39]均可影響氨氧化微生物的群落結構。已有大量研究證實，堿性土壤背景有助于AOB 群落的生長，酸性土壤條件下則AOA 表現得更為活躍，在本研究中，土壤pH 值處于7.4～7.5 之間，屬于中堿性土壤，這從一方面證實稻蝦共作引起AOB 群落差異且強度高于AOA 的原因。研究顯示[40]，pH 不是決定土壤中AOA 和AOB 生態位分離的唯一主要因素，同時氨濃度被認為是決定酸性與堿性土壤中AOA和AOB 不同生態位的定義的關鍵因素。有研究報道在低pH 的土壤背景下，銨能夠解離的NH3越少卻更加適應AOA 的生長，相反AOB 的生長活性會隨著NH3濃度的升高而增長[39,41]。小龍蝦在養殖過程會有打洞爬行等擾動行為，可加速土壤的轉化并增加土壤中的氧氣，而稻蝦田中小龍蝦產生的糞便、蝦殼等可為土壤提供有效的養分，提高NH3的含量，從而有助于AOB 的生長，然而對AOA 群落結構的影響小于AOB。另外，大量研究表明，氨氧化微生物的群落結構與土壤基本理化性質之間有緊密的聯系[42-43]，經過RDA 分析結果發現，土壤理化性質對AOA 與AOB 的微生物群落結構的影響趨勢相同，其中硝態氮對AOA、AOB 微生物群落結構影響最大，其次是總碳、銨態氮、堿解氮與pH。這說明稻蝦共作對土壤氨氧化微生物的群落結構具有一定的影響。雖然土壤理化性質對氨氧化微生物的群落結構影響存在一定的差異，但對于總體的變化還是一致的，證明土壤理化性質與氨氧化微生物的群落的變化有直接的聯系。

4 結論

1) 稻蝦共作模式對水稻土壤基本理化性質有一定的影響。在常規中稻種植模式與稻蝦共作模式中，稻蝦共作模式顯著提高了土壤硝態氮、總碳及總氮的含量，對土壤碳氮比、堿解氮、pH 無顯著影響。

2) 相比常規中稻種植模式，稻蝦共作模式顯著增加了稻田土壤氨氧化細菌與古菌的數量，AOA 與AOB 的數量分別增加了2.2 倍與1.8 倍，此外，在常規中稻模式與稻蝦共作模式下，氨氧化細菌的數量均顯著高于氨氧化古菌。

3) 較常規中稻種植模式，稻蝦共作模式對稻田土壤氨氧化細菌α 群落多樣性無顯著影響，但顯著降低了土壤氨氧化古菌的α 群落多樣性指數。

4) 稻蝦共作模式顯著改變了稻田土壤氨氧化細菌與古菌的群落組成與結構。經RDA 分析，硝態氮與土壤氨氧化微生物的數量、群落多樣性及結構間存在極顯著正相關關系，是影響群落變化的環境主效因子。