基于15N 示蹤法的雙根大豆系統氮素吸收和分配特性研究

馬春梅，王 晶，夏 玄，王 暢，呂曉晨，李 莎,2，程 娟，龔振平*

（1 東北農業大學農學院，哈爾濱 150030；2 東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030）

大豆是重要的糧油兼用作物，其根瘤中的根瘤菌能夠高效地固定空氣中的氮氣，且高產大豆往往有較高的根瘤固氮量[1]。而單純依靠大豆的根瘤固氮無法達到大豆高產的目標，許多學者研究表明，適量的施氮能夠提高大豆產量[2-6]，然而施氮卻會抑制根瘤的生長及根瘤固氮[7-17]。Gan 等[18]研究發現，在水培條件下，給大豆分別施加不同濃度的NO3-和NH4+，施用高濃度肥料氮能明顯抑制大豆根瘤數量、干重及根瘤固氮。作物利用的氮素主要有NO3-和NH4+，而NO3-和NH4+對根瘤的抑制作用也不盡相同，多數學者認為豆科作物根瘤生長對NO3-比NH4+更為敏感[7-10]。而Dazzo 等[11]分別用不同濃度的NH4+和NO3-處理三葉草，發現16 mmol/L 的NO3-與1 mmol/L 的NH4+對結瘤的抑制相同，表明結瘤過程對NH4+的敏感性大于對NO3-的敏感性。Fujikake等[19]研究發現，在水培條件下施加NO3-后，大豆根瘤直徑的增長完全停止，而未加NO3-時，根瘤的生長迅速回到原來的正常速率。由此證明NO3-引起的抑制根瘤的生長是可逆的。但也有少數學者認為，施加少量氮會促進結瘤并提高根瘤固氮酶活性[18,20]。Xia 等[21]利用大豆雙根系統，在砂培條件下，一側施加高濃度氮，另一側不施氮，研究發現施加高濃度氮側的根瘤量減少，而不施氮側根瘤量均增加，表明高濃度氮對根瘤的形成及生長的抑制作用有局部接觸效應。另外，在水培條件下，利用大豆分根系統，一側施NO3-，另一側不施氮，研究發現供氮側的根瘤生長會受到抑制，當供給高濃度的NO3-時，不施氮側的根瘤數量不變但重量減小，這可以解釋為根瘤生長受到非局部性的抑制[22-23]。Daimon 等[16]則認為，長期施加NO3-，對花生結瘤和根瘤活性的抑制作用是系統性的。施氮導致根瘤的系統性抑制的機制有可能與氮的分配及轉運有關。因此研究氮的分配及轉運可能為解析根瘤的系統性抑制提供理論參考。Tanaka 等[12]利用大豆分根系統，一側施15NO3-，一側不施氮，發現15N 標記出現在不施氮側的根及根瘤中，說明一側的根吸收的NO3-會轉移到另一側的根中。Oghoghorie等[24]在水培條件下，將豌豆的根分為上下兩個部分并且隔開，在根的上部施加15N2，發現除了地上部能檢測到15N 標記，在根的下部及根瘤中也檢測到了15N 標記；同樣在根的上部施加15NO3-，發現地上部、根的下部及根瘤中均檢測到了15N 標記，表明由根吸收的氮或由根瘤固氮運輸到地上部的氮素會有一部分返回到根及根瘤中。

有許多學者認為，作物體內除了會發生碳的循環[25]，也會發生氮的循環，即氮的分配與再分配，而對于氮的轉運量的研究較少。本試驗利用嫁接方法制備出大豆的雙根系統，在砂培條件下施用15N 標記NO3-和NH4+，對R1 期 (始花期) 和R5 期 (始粒期) 的大豆植株干重、氮含量、15N 豐度進行測定與分析，對大豆不同時期各組織的氮素來源 (肥料氮和共生固氮) 進行量化，并構建了計算大豆地上部向根及根瘤轉移氮量的方法。系統研究了大豆對不同氮形態的吸收、分配及再分配特點，為解析肥料氮和根瘤固氮的互作機制及大豆根瘤形成的系統性調控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2016 年在東北農業大學校園內進行，在砂培條件下，利用嫁接方法制備出雙根大豆植株，并施用15N 標記的NO3-和NH4+為氮源進行研究。15NO3-或15NH4+的15N 豐度均為3.63%。

1.1.1 雙根材料制備 選用直徑0.3 m、高0.3 m 的塑料桶，插入與桶內部形狀契合的定制PC 塑料板，在塑料桶中間位置用膠固定密封，形成兩個相等且獨立的空間，塑料板高度低于桶沿2 cm，在桶底分別鉆1 cm 直徑的排水孔，于桶底每個圓孔上方放入一塊紗網，防止江砂堵塞圓孔，再將洗凈的江砂裝入桶中，總裝砂量為20 kg，用于培養雙根大豆材料。

大豆雙根植株制備方法:參考Xia 等[21]的大豆雙根植株制備方法。將大豆 (品種為‘墾豐16’) 種子播于細砂中，播深2 cm，置于培養箱中30℃培養3 天，當大豆子葉著生處至根尖長約7～10 cm 時，用蒸餾水沖出幼苗根系，取大豆幼苗用滅菌刀片在兩株幼苗胚軸中間偏上的位置，向上或向下劃0.5～1.0 cm 長切口 (不切斷)，一個大豆幼苗由子葉向根部方向豁開 (圖1A)，另一個大豆幼苗由根部向子葉方向豁開 (圖1B)，然后將兩株幼苗的切口相互插入 (圖1C) 后用嫁接夾夾好，再將兩幼苗的根分別栽植于桶內隔板兩側的細砂內，嫁接部位恰好處于隔板正上方，將嫁接苗放于防雨棚中，一周后去掉嫁接夾，剪掉圖1A 中接口以上部分，只留下接合部位及其下部，使幼苗成為包含兩個根和一個地上部的幼苗。圖1D 是取樣時的雙根大豆植株。

1.1.2 試驗處理 試驗設置NO3-和NH4+兩種氮源，供氮濃度均為50 mg/L。試驗設置兩組試驗:試驗Ⅰ中一側施加15N 標記的氮，標記為A 側；另一側不施加氮，標記為B 側。試驗Ⅱ中一側施加15N 標記的氮，標記為A 側；另一側施加相對應的14N 的氮(A、B 兩側施相同形態氮)，標記為B 側。每個處理5 次重復，試驗處理見表1。

不含氮營養液的組成為:KH2PO4136 mg/L、MgSO4240 mg/L、CaCl2220 mg/L、MnCl2·4H2O 4.9 mg/L、H3BO32.86 mg/L、ZnSO4·7H2O 0.22 mg/L、CuSO4·5H2O 0.08 mg/L、Na2MoO4·H2O 0.03 mg/L、FeSO4·7H2O 5.57 mg/L、Na2EDTA 7.45 mg/L。營養液參考Hoagland 等[26]及董守坤等[27]的配制方法，略有改進。含NO3-的營養液是在上述不含氮營養液的基礎上添加KNO3360.7 mg/L，含NH4+的營養液是在上述不含氮營養液的基礎上添加 (NH4)2SO4235.7 mg/L。

自幼苗對生真葉完全展開前每日澆1 次蒸餾水，每次每側澆250 mL。對生真葉完全展開后每日澆1 次配制的營養液，每次每側250 mL 對應營養液，直至R1 期 (始花期)；R1 期后每日澆2 次配置的營養液，早晚各1 次，每次每側250 mL 對應營養液，至R5 期 (始粒期) 試驗結束。當大豆對生真葉完全展開時全部根均接種根瘤菌，其方法是將上年冷凍保存的田間大豆根瘤，清洗研碎后加到營養液中，每升營養液中約含5 g 根瘤，連續接種5 天。

圖 1 雙根大豆植株Fig. 1 Soybean plant with dual root systems

表 1 試驗處理Table 1 Experiment treatments

1.2 取樣方法

于始花期和始粒期取樣兩次，將植株分為A 根、B 根、A 側根瘤、B 側根瘤、莖、葉片、葉柄、莢等部位，105℃殺青30 min 之后，65℃烘干，樣品用于測定15N 豐度、干重和氮含量等指標。

1.3 測定分析

植株氮含量測定:以K2SO4和CuSO4為催化劑，濃硫酸消煮后，采用B324 全自動凱氏定氮儀測定。

15N 豐度測定:先用凱氏定氮法測定植株氮含量，然后將凱氏定氮滴定后的樣品溶液濃縮，在冷凍真空條件下與次溴酸鋰反應產生氮氣，用同位素比率質譜儀 (Thermo-Fisher Delta V Advantage IRMS)采用雙路 (DI) 測量方式測定15N 豐度。

1.4 相關計算

試驗采用砂培，沒有土壤因素，因此植株的兩個氮素來源是源于施加15N 標記的肥料氮比例，和源于施加14N 肥料氮或根瘤固氮的比例 (后者在試驗Ⅰ中為源于根瘤固氮的比例，在試驗Ⅱ中為源于施加的14N 肥料氮+根瘤固氮的比例)。

源于15N 標記的肥料氮的比例，即:

由公式 (1) 和 (2) 可推導出源于15N 標記的肥料氮的比例:

1.5 數據分析

采用SPSS22.0 軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 大豆對肥料氮與根瘤固氮的吸收及分配

2.1.1 大豆各組織中15N 豐度變化 表2 是試驗Ⅰ和試驗Ⅱ雙根大豆植株中各營養器官的15N 豐度。試驗Ⅰ，大豆植株中氮來源為A 根吸收的15NO3-或15NH4+、A 側根瘤固氮、B 側根瘤固氮。試驗Ⅱ，大豆植株中氮來源為A 根吸收的15NO3-或15NH4+、B 根吸收的14NO3-或14NH4+、A 側根瘤固氮、B 側根瘤固氮。

表 2 大豆各組織中15N 豐度 (%)Table 2 15N abundance of the soybean tissues

由表2 可知，NO3-和NH4+兩種氮源的試驗Ⅰ在R1 期A 根的15N 豐度為2.21%和2.30%，在R5 期為1.9 7% 和2.2 0%；在R 1 期B 根的15N 豐度為0.97%和0.91%，在R5 期為0.85%和0.84%，15N 豐度均高于自然豐度 (0.365%)，且小于肥料的15N 豐度(3.63%)，表明B 根中的氮除了來自根瘤固氮外，一定有A 根吸收的15N 標記的肥料氮轉移到B 根中。在R1 期的A 側根瘤的15N 豐度為0.78%和0.80%，在R5 期為0.70%和0.70%；在R1 期的B 側根瘤的15N 豐度為0.60% 和0.59%，在R5 期為0.53% 和0.53%，15N 豐度均高于自然豐度 (0.365%)，說明根瘤的氮除了來自根瘤固定的氮外，一定有A 根吸收的15N 標記的肥料氮運輸到A 側及B 側根瘤中。

在試驗Ⅱ中，A 根及根瘤、B 根及根瘤、地上部 (莖、葉片、葉柄、莢) 中的15N 豐度與試驗Ⅰ變化規律基本一致，說明兩側根都施氮的條件下，兩側根吸收的肥料氮和兩側根瘤固氮仍然是可以相互轉移的。在NO3-和NH4+兩種氮源的試驗Ⅱ中，R1 期A 根的15N 豐度為2.10%和2.25%，在R5 期為1.87%和2.18%；R1 期B 根的15N 豐度為0.76%和0.70%，R5 期為0.73%和0.67%。R1 期A 側根瘤的15N 豐度為0.74%和0.79%，R5 期為0.67%和0.70%，R1 期B 側根瘤的15N 豐度為0.53% 和0.54%，R5 期為0.51% 和0.51%。R1 和R5 期的莖、葉、葉柄的15N 豐度沒有顯著性差異，說明根系吸收的肥料氮和根瘤固氮對莖、葉、葉柄三個部位的營養作用相同；地上各部分15N 豐度均高于自然豐度 (0.365%)，且小于施加的肥料氮的15N 豐度 (3.63%)，說明A 和B 兩側根吸收的肥料氮和A 和B 兩側根瘤固氮都會按一定的比例運輸到地上部。試驗Ⅰ、Ⅱ的R5 期植株各器官的15N 豐度均低于R1 期，說明在R5 期根瘤固氮對植株的貢獻大于R1 期。

2.1.2 大豆植株吸收肥料氮和根瘤固氮比例 由表2中的15N 豐度數據，計算出各器官的氮來源于15N 和來源于根瘤固氮或來源于14N 與根瘤固氮的比例 (表3和表4)。

表 3 試驗Ⅰ中大豆各組織中氮來源于15N 和根瘤固氮的比例 (%)Table 3 Proportions of nitrogen from 15N fertilizer and nodule fixation of soybean tissues in experiment Ⅰ

表 4 試驗Ⅱ中大豆各組織中氮來源于15N 及14N+根瘤固氮的比例 (%)Table 4 Proportions of nitrogen from 15N and 14N+nodule fixation of soybean tissues in experiment Ⅱ

由表3 可知，試驗Ⅰ中植株有三個氮源，分別為A 根吸收的15N 標記肥料氮和A 側根瘤固定的氮及B 側根瘤固定的氮，但由于A 和B 兩側根瘤固定的氮無法區分，所以表中列出了兩個來源，分別為A 根吸收的15N 標記的肥料氮和A、B 兩側根瘤固定的氮。由表3 可知，NO3-和NH4+兩種氮源的試驗Ⅰ在R1 期A 根的氮來源于A 根吸收肥料氮占56.57%和59.26%，來自于A 根和B 根的根瘤固氮占43.43%和40.74%，R5 期分別為49.13%、56.29% 和50.87%、43.71%；在R1 期，B 根的氮來源于A 根吸收肥料氮占18.53% 和16.83%，來自于A 根和B 根的根瘤固氮占81.47%和83.17%，R5 期分別為14.79%、14.54%和85.21%和85.46%，說明施氮的A 根氮大部分來自A 根吸收的肥料氮，少部分來自根瘤固氮；不施氮的B 根氮大部分來自根瘤固氮，少部分來自A 根吸收的肥料氮。在R1 期，A 側根瘤的氮來源于A 根吸收肥料氮占12.81%和13.33%，來自于A 根和B 根的根瘤固氮為87.19%和86.67%，R5 期分別為10.20%、10.13%和89.80%、89.87%；在R1 期，B 側根瘤的氮來源于A 根吸收肥料氮占7.20%和6.89%，來自于A 根和B 根的根瘤固氮為92.80%和93.11%，R5 期分別為5.17%、5.16%和94.83%、94.84%，說明根瘤中的氮絕大多數來自根瘤固氮，少部分來自根系吸收的肥料氮。在R1 期，莖的氮來源于A 根吸收肥料氮占27.85%和31.11%，來自于A 根和B 根的根瘤固氮為72.15%和68.89%，葉片是30.69%、29.72%和69.31%、70.28%，葉柄是29.34%、30.30%和70.66%、69.70%。在R5 期，莖是22.17%、25.07%和77.83%、74.93%，葉片是25.70%、23.63% 和74.30%、76.37%，葉柄是27.44%、25.59% 和72.56%、74.41%，莢是20.46%、23.73%和79.54%、76.27%。可以看出莖、葉片、葉柄三個部分的氮來源比例幾乎相同，說明根部吸收的肥料氮和根瘤固氮會按一定的比例運輸到地上部分，且對莖、葉片、葉柄三個部分幾乎沒有差異。

試驗Ⅱ中有4 個氮來源，分別為A 根吸收的15N 標記的肥料氮、A 側根瘤固氮、B 根吸收的14N 肥料氮、B 側根瘤固氮，由于A 和B 兩側根瘤固定的氮和B 根吸收的14N 肥料氮無法區分，所以表中列出了2 個來源，分別為A 根吸收的15N 標記的肥料氮和B 根吸收的14N 肥料氮及A、B 兩側根瘤固定的氮(表4)。

由于試驗Ⅱ中A 和B 兩側根施加的肥料氮只有15N 豐度不同，其他均相同，可以認為兩側根及根瘤所處的營養環境相同，即A 根源于A 側根吸收的15N 標記的肥料氮等于B 根源于B 側根吸收14N 的肥料氮，B 根源于A 側根吸收的15N 標記的肥料氮 (15N)等于A 根源于B 側根吸收的14N 肥料氮，A 和B 兩根源于雙側根瘤固定的氮無法區分，因此可以區分出A 和B 兩根的三個氮來源。即A 根氮來源于三個部分 (表4):1) A 根吸收的15N 標記的肥料氮比例；2) A 根源于B 根吸收的14N 肥料氮比例等于B 根源于A 根吸收的15N 標記分肥料氮比例；3) A 根源于A 和B 兩側根瘤固氮的比例等于1 減去上面兩個比例。B 根氮來源于三個部分 (表4):1) 源于A 根吸收的15N 標記的肥料氮比例；2)B 根源于B 根吸收的14N 肥料氮比例等于A 根源于A 根吸收的15N 標記分肥料氮比例；3)B 根源于A 和B 兩側根瘤固氮的比例等于1減去上面兩個比例。同理可知根瘤的三個氮來源。

地上部的氮來源于A 側根吸收15N 標記的肥料氮等于來源于B 側根吸收的14N 肥料氮，源于雙側根瘤固定的氮無法區分，也可以區分出地上部的三個氮來源。如以莖為例，1) 莖源于A 根吸收的15N 標記的肥料氮的比例 (表4)；2) 莖源于B 根吸收的14N 肥料氮的比例等于莖源于A 根吸收的15N 標記的肥料氮的比例 (表4)；3) 莖源于A 和B 兩側根瘤固氮的比例為1 減去上面兩個比例。由此可計算出A 根、B 根、A 側根瘤、B 側根瘤、莖、葉片、葉柄、莢的三個氮素來源比例 (表5)。

由表5 可知，NO3-和NH4+兩種氮源的試驗Ⅱ在R1 期A 根的氮來源于A 根吸收肥料氮為53.15%和57.70%，來源于B 根吸收的肥料氮為12.21% 和1 0.4 0%，來源于A 和B 兩側根瘤固定的氮為34.64%和31.90%，R5 期分別為45.88%和55.64%、11.31%和9.41%、42.81%和34.95%。進一步證明A 根中的氮除了來自A 根吸收的肥料氮，還有來自B 根的肥料氮及根瘤固氮。在R1 期，A 側根瘤的氮來源于A 根吸收肥料氮為11.64%和13.12%，來源于B 根吸收的肥料氮為5.00% 和5.30%，來源于A 根和B 根的根瘤固氮為83.36%和81.58%，R5 期分別為9.2 2% 和1 0.2 2%、4.4 3% 和4.4 5%、86.35%和85.33%。進一步證明了根瘤中的氮主要來自根瘤固氮，有一少部分來自本根系吸收的肥料氮。在NO3-和NH4+兩種氮源條件下，在R1 期，莖的氮來源于A 和B 兩根吸收肥料氮的比例為45.80%和61.26%，來自于A 和B 兩側根瘤固氮的比例為54.20% 和38.74%，葉片是43.36%、58.30% 和56.64%、41.70%，葉柄是48.86%、53.18% 和5 1.1 4%、4 6.8 2%。在R 5 期，莖是4 3.9 0%、46.58% 和56.10%、53.42%，葉片是42.00%、44.72% 和58.00%、55.28%，葉柄是46.96%、47.54% 和53.04%、52.46%，莢是36.44%、43.84%和63.56%、56.16%。

表 5 試驗Ⅱ中大豆各組織中氮來源于15N、14N、根瘤固氮的比例 (%)Table 5 Proportions of nitrogen from 15N, 14N and nodule fixation of soybean tissues in experiment Ⅱ

2.2 大豆始花期～始粒期地上部向根及根瘤的氮轉移量

由表3、表4 可知，雙根系統中兩個根系吸收的氮可通過地上部相互轉移，但這種轉運不是簡單的過程，而是反映地上與根系和根瘤的相關性。試驗中大豆植株各部15N 豐度不同 (表2)，將B 根和地上部看做一個系統，對B 根而言，地上部是其15N 供給源，R1～R5 期，B 根增加的15N 量可以用R5 期積累的15N 量減去R1 期積累的15N 量求得，其應等于R1～R5 期由地上部轉移下來的15N 量，加上R1～R5期B 根自身吸收自然豐度的15N 量 (試驗Ⅰ為根瘤固氮，試驗Ⅱ為根瘤固氮和B 根吸收的14N 肥料氮) 之和。設定從地上部轉運到B 根的氮量為NT，地上部向下轉移氮的15N 豐度用R1 期和R5 期地上部15N 豐度的平均值來計算，則NT× (f地上部R1+f地上部R5)/2 代表R1 期到R5 期從地上部轉移到B 根的15N 量；NR5-NR1為R1 期到R5 期B 根的氮積累量，NR5-NR1-NT為R1 期到R5 期來自B 根吸收的氮積累量 (包括根瘤供給的)，其乘上15N 自然豐度f自，即 (NR5-NR1-NT) ×f自代表R1 期到R5 期B 根吸收的及根瘤供給的15N 量；NR5× fR5為R5 期B 根全部15N 量，NR1×fR1為R1 期B 根全部15N 量。地上部轉移到B 側根瘤的氮量也可用此方法計算出來。對于試驗Ⅱ，則NT×(f地上部R1+f地上部R5)/2+(NR5-NR1-NT) × f自= NR5× fR5-NR1×fR1，即，

式中，fR1、fR5為B 根或B 側根瘤在R1 期、R5 期的15N 豐度 (表1)，f地上部R1、f地上部R5為地上部R1 期、R5 期的莖、葉片、葉柄、莢的15N 豐度 (表1) 的平均值，f自為自然豐度 (0.365%)，NR1、NR5為B 根或B 側根瘤R1 期、R5 期氮積累量。試驗中參數取值見表6。

由 (4) 式結合表6 可以計算出地上部轉移到B 根及B 根瘤的氮量，在試驗Ⅱ中，由于雙側均施加相同濃度相同形態的氮，僅標記不同，認為地上部向A 和B 兩側的根及根瘤轉移的氮量相同，試驗Ⅱ在R1～R5 期地上部向根及根瘤的氮轉移量和比例見表7。

NO3-和NH4+兩種氮源處理下，在R1～R5 期A 根或B 根增加的氮積累量為15.7 mg/株和19.7 mg/株，R1～R5 期從地上部轉移到A 根或B 根的氮積累量為6.4 mg/株和5.6 mg/株，占A 根或B 根增加的氮積累量的40.8%和28.4%。R1～R5 期A 側根瘤或B 側根瘤增加的氮積累量為20.3 mg/株和18.8 mg/株，R1～R5 期從地上部轉移到A 側根瘤或B 側根瘤的氮積累量為3.5 mg/株和2.7 mg/株，占A 根瘤或B 根瘤增加的氮積累量的17.2%和14.4%。

表 6 B 根、B 根瘤及地上部始花期 (R1) 和始粒期 (R5) 的15N 豐度及氮積累量Table 6 15N abundance and N accumulation of root B, nodule B and shoot at initial flowering (R1)and initial seeding (R5) stage

表 7 始花期 (R1) ～始粒期 (R5) 地上部向根及根瘤的氮轉移量和比例Table 7 Amount and proportion of N periodically transferred from shoot to root and nodule from initial flowering (R1) to initial seeding (R5) stage

3 討論

3.1 大豆各器官的氮素來源

大山卓爾等[29]的研究發現，給大豆供給15NO3-，一段時間后發現15N 標記出現在根瘤中，說明硝態氮可供大豆根瘤生長，尤其是在根瘤生長初期，其利用率是較高的。Sato 等[30]向培養大豆的營養液中加入13NO3-，發現13N 標記的NO3-首先出現在大豆葉柄中，接著是葉片中，而在根瘤中很少，說明根吸收的NO3-在短時間內沒有轉移到根瘤中。本研究中試驗Ⅰ、Ⅱ是一側施15N 標記的肥料氮，而在沒有施氮或施沒有15N 標記肥料氮的另一側根瘤15N 豐度高于自然豐度，結合Sato 等[30]的試驗結果，說明一定有15N 標記的肥料氮運輸到兩側根瘤中，即根瘤中來自根系吸收的氮素主要是由地上部轉移下來的。試驗Ⅰ和試驗Ⅱ中兩側根瘤的15N 豐度均高于氮的自然豐度 (0.365%)，說明根瘤生長發育過程中所需要的氮不是全部都來自自身固氮，也有一部分來自根系吸收的肥料氮。且A 側根瘤的15N 豐度顯著高于B 側根瘤，說明A 側根吸收的15N 標記的肥料氮供應A 側根瘤的量多于B 側根瘤。

Wery 等[31]對苜蓿進行供硝酸銨與不施氮的試驗，發現兩者在氮積累量上沒有顯著性差異，但是在供氮條件下根瘤固氮率下降了，而吸收的氮素增加了，說明在有化合態氮和N2同時存在的情況下，苜蓿會優先選擇化合態氮。本試驗中，試驗Ⅰ為單側供氮，試驗Ⅱ為雙側供氮，對比試驗Ⅰ和試驗Ⅱ中植株各部位來源于肥料氮和根瘤固氮的比例，發現試驗Ⅱ中植株各部位來源于根瘤固氮的比例均小于試驗Ⅰ，即根瘤固氮率明顯下降，這表明在適當增加肥料氮時，大豆植株優先吸收利用肥料氮。

對于銨態氮和硝態氮兩種氮素對氮的吸收及分配的影響說法不一。一些學者在大豆和玉米的大田試驗中發現，無論是NO3-還是NH4+，使用單一氮源植株的長勢均不如NH4+和NO3-混合[32-33]。Chaillou等[34]在水培條件下，利用大豆分根系統，一側施加NH4+，一側施加NO3-，研究發現施加NO3-側的根干重大于NH4+側的根干重。而Gan 等[18]給大豆分別施加NH4+和NO3-，研究發現施用NH4+比施用NO3-的大豆具有更高生物積累量、根瘤干重、總氮積累量和固氮量。本試驗的試驗Ⅰ、Ⅱ的NO3-或NH4+處理對比，各器官15N 豐度均沒有顯著性差異，可能是由于一些細菌的存在將NH4+轉化為NO3-，但從其表現來看，施NO3-或NH4+并沒有影響大豆植株對氮的吸收及分配，說明在50 mg/L 的氮濃度下，NO3-和NH4+影響大豆對氮吸收和分配的作用幾乎相同。

3.2 大豆地上部與根系、根瘤的氮分配與再分配

Oghoghorie 等[24]給豌豆葉面施加15NO3-，發現在地上部、根和根瘤中均檢測到了15N 標記，說明葉片中的氮會發生向下的運輸，運輸到了根及根瘤中。Ito 等[35]用15NO3-或15NH4+處理向日葵葉片，在施氮葉片的上下節間都測到了15N，而且上節間的15N 豐度小于下節間，表明施加在葉片上的氮可以發生向上運輸的同時也可以發生向下的運輸，即地上部的氮會轉運到根及根瘤中。Reynolds 等[36]在水培條件下，利用大豆分根系統，一側施13NH4+，一側不施氮，發現13N 先出現在地上部，隨后出現在未供氮一側的根中，說明根部吸收的氮會運輸到地上部分，隨后再運輸回根部。本研究的試驗Ⅰ和Ⅱ中地上部、A 和B 兩側根、A 和B 兩側根瘤的15N 豐度均高于氮的自然豐度 (0.365%)，且小于施加的肥料氮的15N 豐度(3.63%)，表明A 和B 兩側根部吸收的肥料氮和A 和B 兩側根瘤固氮都會按一定的比例運輸到地上部；一定有A 根吸收的15N 標記的肥料氮轉移到B 根中；也一定有A 根吸收的15N 標記的肥料氮運輸到兩側根瘤中，由于試驗Ⅱ中雙側根都處于50 mg/L 的相同氮素溶液中，且均有根瘤的存在，可以認為兩側根及根瘤所處的營養狀態相同，因此試驗Ⅱ中A 根吸收的15N 標記的肥料氮會轉移到B 根中，同理可知，B 根吸收的14N 的肥料氮也會轉移到A 根中；A 側根吸收的15N 標記的肥料氮會運輸到兩側根瘤中，同理可知，B 側根吸收的14N 的肥料氮也會運輸到兩側根瘤中。綜上所述，根吸收的肥料氮和根瘤固氮會以一定的比例運輸到地上部，隨后會再次重新分配回根及根瘤中。

為估算地上部向根及根瘤轉運的氮量及占根和根瘤氮的比例，本試驗將大豆雙根系統中地上部和未施15N 標記肥料氮的一側根及根瘤看成一個氮轉移系統，利用15N 豐度的差異，構建了R1～R5 期地上部向根及根瘤轉移氮量的計算方法。在試驗Ⅱ中，利用公式 (1) 計算得出，在NO3-和NH4+兩種氮源下，R1-R5 期A 根或B 根來自地上部轉移的氮為5.6～6.4 mg/株，占R1～R5 期A 根或B 根氮積累量的28.4%～40.8%；R1～R5 期A 側根瘤或B 側根瘤來自地上部的氮為2.7～3.5 mg/株，占R1～R5 期A 側根瘤或B 側根瘤氮積累量的14.4%～17.2%。地上部向根及根瘤中轉運的氮，是以何種形態和通過什么部位運輸的，以及其生理作用如何還有待進一步研究。

4 結論

1) 根瘤生長所需要的氮來源包括自身根瘤固氮和根系吸收的外源氮，且大豆植株優先吸收外源氮。不論供應NO3-還是NH4+，在N 50 mg/L 濃度下，大豆氮的吸收和分配不受氮形態的影響。

2) 大豆根系吸收的肥料氮以及根瘤固氮運輸到地上部后，會再次重新分配回根及根瘤中。將大豆雙根系統中地上部和施14N 肥料氮的一側根及根瘤看成一個氮轉移系統，利用15N 豐度的差異，構建了R1～R5 期地上部向根及根瘤轉移氮量的計算方法。經計算表明，當施氮濃度為50 mg/L 時，R1～R5 期(始花期～始粒期) 根來自地上部轉移的氮占根部氮素積累量的28.4%～40.8%，根瘤來自地上部轉移的氮占其氮素積累量的14.4%～17.2%。