飼糧添加丁酸梭菌對斷奶仔豬腸道健康的影響

王海亮，錢 坤*

（1.天津市農業農村委員會，天津 300061；2.天津市農業生態環境監測與農產品質量檢測中心，天津 300402）

丁酸梭菌是厭氧菌，革蘭氏染色后呈陽性，顯微鏡下觀察為直桿狀、也見有彎曲狀，單雙均有、鏈不長，偶爾發現絲狀菌體，中間隆起，呈煎蛋樣。細菌直徑約（0.5～1.7）×（2.4～7.6）μm，因周生鞭毛，能夠運動，內生孢子。可以利用單糖或多糖等碳水化合物代謝產酸，導致牛奶發酸、固化、產氣，但不消化[1]。

試驗研究表明，丁酸梭菌在實驗室平板上培養后，邊緣整齊，但不規則，略有酸臭味，并且其明顯特征之一是可以產淀粉酶，但無法水解纖維素和不能消化血清蛋白，碳水化合物被其水解后的終產物是丁酸、乳酸及醋酸等有機酸，同時有少許的丙酸、甲酸、硝酸鹽產生，對其進行還原試驗，檢測結果都是陰性。有研究報道，丁酸梭菌耐受力較強，耐受外部的高溫，耐受外部的低pH濃度：在80 ℃熱源下加熱30 min后能夠全部存活，90 ℃熱源下加熱10 min 后仍能全部存活，保持活性，加熱20 min 后，存活率為95%；即使100 ℃加熱5 min，存活率為30%，pH 為1.0～5.0 依然可以存活，適宜存活的pH 范圍為4.0～9.8[2]。丁酸梭菌是益生菌之一，已作為抗生素替代品添加在實際生產中推廣使用[3]。

丁酸梭菌在動物腸道內的主要特性分別是：加快機體腸道中益生菌（乳酸桿菌，嗜酸乳桿菌等）的定植和繁衍，阻礙腸道中的條件性致病菌、腐敗菌等有害菌的繁衍，維持消化道內微生態平衡，降低腸道中毒素的產生；可以在畜禽腸道中代謝得到多種促生長因子，如維生素、淀粉酶等物質，發揮保護畜禽健康的功效；丁酸是該菌的代謝營養物，可促進腸道上皮細胞相關緊密連接蛋白的表達及組織的再生與修復；該菌對多類飼用抗生素而言擁有特別強的耐受性，且不受機體分泌的有機酸等物質的影響，配伍禁忌少，使用方便。丁酸梭菌已成為一種新型抗生素替代品添加劑用于養殖業的實際生產中，可以減少抗生素的使用量，降低動物產品中的藥物殘留及產生的耐藥性，維持動物消化道中菌群平衡，提高動物健康狀況，促進動物機體的生長和生產性能的充分發揮[4-6]。

本研究對丁酸梭菌制劑的試驗室生物活性進行分析，并通過測定相關的血清指標、腸道微生物、腸道結構和緊密連接蛋白表達來研究丁酸梭菌對斷奶仔豬腸道結構發育和健康狀況的影響。

1 材料與方法

1.1 丁酸梭菌

丁酸梭菌制劑來源于仰韶生化工程（河南）有限公司，丁酸梭菌含量為2.0×109cfu·g-1，進行倍比稀釋添加到基礎日糧中。

1.2 試驗設計

試驗采用單因子設計，選取（28±2）日齡、健康狀況良好、平均體重為（7.26±0.42）kg的（杜×長×大）斷奶仔豬16 頭，按完全隨機區組設計分成2個處理，每個處理4個重復，每個重復2頭仔豬，飼養于專用代謝籠中，試驗期為28 d。兩個處理組分別飼喂：陰性對照組：飼糧不添加丁酸梭菌；試驗組：基礎飼糧添加丁酸梭菌制劑，濃度為1×105cfu·g-1。

1.3 試驗日糧

試驗使用玉米-豆粕型基礎日糧，配制方法參照NRC（1998）豬飼養標準（見表1）。

表1 基礎飼糧組成及其營養水平

1.4 飼養管理

試驗在河北省定州市海豐養殖有限公司完成。試驗期間豬只封閉飼養，自由采食干粉料，飲水不限，豬舍環境溫度穩定在25～28 ℃。預試期為3 d，試驗期為28 d。試驗期內每日觀察仔豬的健康狀況，記錄死淘仔豬數以及腹瀉、用藥情況，其他飼養管理和免疫按照常規程序進行。試驗完成時，2 個處理的4 個重復各分別隨機選擇1 頭正常的斷奶仔豬實施屠宰試驗，采取所需樣品。剖殺前12 h 禁食，屠宰前用真空促凝管進行采血，然后立即使用頸靜脈放血的辦法將其處死，消毒、剖開腹腔，立即結扎噴門瓣、幽門瓣、直腸遠端，無菌取十二指腸、空腸、回腸、盲腸等內容物，放于液氮速凍后，轉放到-80 ℃冰箱中凍存以待分析。取十二指腸、空腸、回腸、盲腸等中段各兩份約5 cm 腸管，用PBS 沖洗，1 份置于液氮速凍，然后轉放到-80 ℃冰箱中凍存以待分析，1 份存放至10%中性福爾馬林固定液中，搖勻，待做組織切片。

2 檢測指標和方法

2.1 腸道微生物

在無菌條件下稱取所采各腸道樣品內容物1 g，用9 mL無菌生理鹽水溶解，并將其充分混勻，并進行10倍逐級梯度稀釋，直至10-7，選擇10-5、10-6及10-73個稀釋度，吸取稀釋液0.1 mL，接種到培養基上進行乳酸桿菌和厭氧菌培養。選取稀釋度為10-2～10-5的不同梯度，吸取稀釋液0.2 mL至相應的平板培養基上完成大腸桿菌與好氧菌的計數。大腸桿菌計數采用麥康凱瓊脂培養基：蛋白胨20.0 g·L-1，乳糖10.0 g·L-1，膽鹽5.0 g·L-1，氯化鈉5.0 g·L-1，中性紅0.075 g·L-1，瓊脂12.0 g·L-1，pH（7.4±0.2）。總好氧菌用腦心浸液瓊脂培養基：牛腦浸液12.5 g·L-1，牛心浸液5.0 g·L-1，蛋白胨10.0 g·L-1，氯化鈉5.0 g·L-1，葡萄糖2.0 g·L-1，磷酸氫二鈉2.5 g·L-1，瓊脂10.0 g·L-1，pH（7.4±0.2）。乳酸桿菌計數采用Rogosa 瓊脂：胰蛋白胨10.0 g·L-1，酵母膏5.0 g·L-1，葡萄糖20.0 g·L-1，吐溫80 1.0 mL·L-1，磷酸二氫鉀6.0 g·L-1，檸檬酸銨2.0 g·L-1，乙酸鈉17.0 g·L-1，硫酸鎂0.575 g·L-1，硫酸錳0.12 g·L-1，硫酸 亞 鐵 0.034 g · L-1， 瓊 脂 20.0 g·L-1，pH（5.4±0.2）。總厭氧菌計數采用Wilkinschalgren 厭氧瓊脂：胰蛋白胨10.0 g · L-1，明膠胨10.0 g·L-1，酵母膏5.0 g·L-1，葡萄糖1.0 g·L-1，氯化鈉5.0 g·L-1，精氨酸1.0 g·L-1，丙酮酸鈉1.0 g·L-1，VK30.000 5 g·L-1，氯化血紅素0.005 g·L-1，瓊脂18.0 g·L-1，pH（7.1±0.2）。研究的厭氧菌與乳酸桿菌的瓊脂培養基制成Hungates滾管，使用平板培養好氧菌及大腸桿菌。將全部培養基放于恒溫培養箱中，37 ℃培養24～48 h后計數。所有稀釋度均做2 個滾管或平板，用30～300 個菌落的滾管或平板的稀釋度來計數。

2.2 腸道結構

將在10%中性福爾馬林液中固定24 h 后的標本取出，按順序進行洗滌、脫水、透明、透蠟、包埋后，將其修剪成1 cm×1 cm×1 cm 樣品塊，用萊卡切片機制成石蠟切片，HE 染色、封片后低倍鏡（5×）下觀測，選擇代表性視野，用Leica Qwin圖象分析系統對切片圖像進行分析，各個樣品均觀察3張以上非連續切片，每張切片觀察15～20 根完整、長并且直的腸絨毛及相對應的隱窩，測量后計算出絨毛高度及隱窩深度的平均值用于試驗測定數據。

2.3 血清D-乳酸和二胺氧化酶（DAO）

ELISA法測定各組仔豬血清中D-乳酸和DAO，ELISA法檢測按照說明書操作。D-乳酸ELISA試劑盒為上海酶聯生物科技有限公司產品。

2.4 RT-PCR檢測腸上皮細胞緊密連接mRNA表達

設計ZO-1、Occludin、Claudin-1 和Gapdh 共4對引物（均由上海生工合成），利用T165-48多樣品組織研磨機（上海凈信實業發展有限公司，中國）對定量空腸樣品破碎，tacoTMRNA 萃取試劑盒提取RNA，利用All-in-OneTMFirst-cDNA Synthesis 試劑盒和PCR 儀（Eppendorf 384 梯度PCR 儀），將空腸RNA 反轉錄成cDNA。利用SYBR⑩Premix Ex Taq TM 熒光定量試劑盒和熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems）檢測ZO-1、Occludin和Claudin-1[7-10]。

用tacoTMRNA 試劑盒提取斷奶仔豬空腸和回腸腸段上皮細胞中總RNA，利用All-in-OneTMFirstcDNA Synthesis 試劑盒，按照其說明書步驟分別將空腸和回腸RNA 逆轉錄為cDNA。利用SYBR⑩Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒，按照其說明步驟，以1ulcDNA 為模板進行PCR 擴增，實時定量PCR樣品反應體系采用SYBR Green I，其最終反應體系為15 μL，每個基因4 個平行。反應條件為

Hold stage：95 ℃10 min；Cycling stage：95 ℃10 s，61 ℃20 s；72 ℃10 s，40 cycles；Melt curve：72 ℃10 s，95 ℃10 s。每個樣品均設置相應未經逆轉錄的模板作為陰性對照，同時每個樣品均設置相應的內參作為對照，得到各自的熒光閾值循環數（Ct 值），采用相對定量法2-ΔΔCt進行計算。定量PCR引物見表2。

2.5 統計分析

試驗數據采用SAS 9.1.3 的one-way ANOVA、LSD進行方差分析和t檢驗。

表2 定量PCR引物

3 試驗結果

3.1 飼糧添加丁酸梭菌對仔豬腸道微生物的影響

當飼糧中丁酸菌添加量為0時，仔豬腸道十二指腸中單好氧菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的值分別為4.85、5.78、3.89 cfu·g-1；空腸中單好氧菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的值分別為5.01、6.38、3.52 cfu·g-1；回腸中單好氧菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的值分別為4.86、6.62、3.92 cfu·g-1；盲腸中單好氧菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的值分別為5.34、7.15、4.15 cfu·g-1。當飼糧中丁酸菌添加量為1×105cfu·g-1時，仔豬腸道十二指腸中，單好氧菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的值分別為4.72、6.02、3.92 cfu·g-1；空腸中，單好氧菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的值分別為5.13、6.74、3.40 cfu·g-1；回腸中，單好氧菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的值分別為4.69、6.95、3.67 cfu·g-1；盲腸中，單好氧菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的值分別為5.19、7.32、3.96 cfu·g-1。

飼糧添加丁酸梭菌1×105cfu·g-1組與對照組相比，試驗組的十二指腸、回腸和盲腸的總好氧菌分別降低了2.68%、3.50%和2.81%，但差異均不顯著（P＞0.05），而試驗組的空腸總好氧菌提高了2.40%，差異不顯著（P＞0.05）；試驗組的十二指腸、空腸、回腸和盲腸的乳酸桿菌分別提高了4.15%、5.64%、4.98%和2.38%，其中十二指腸和盲腸的乳酸桿菌數量與對照組相比，差異不顯著（P＞0.05），空腸和回腸的乳酸桿菌數量與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；與對照組相比，十二指腸大腸桿菌的數量提高0.77%（P＞0.05），空腸、回腸和盲腸的大腸桿菌數量分別降低3.41%（P＞0.05）、6.38%（P＞0.05）和4.58%（P＞0.05）。

3.2 飼糧添加丁酸梭菌對仔豬腸道結構的影響

當飼糧中丁酸菌添加量為0時，仔豬腸道十二指腸中絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度∕隱窩深度的值分別為420μm、303μm和1.39；空腸中絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度∕隱窩深度的值分別為325 μm、189 μm、1.72；回腸中絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度∕隱窩深度的值分別為280 μm、168μm、1.67。當飼糧中丁酸菌添加量為1×105cfu·g-1時，仔豬腸道十二指腸中絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度∕隱窩深度的值分別為432μm、288μm和1.50；空腸中絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度∕隱窩深度的值分別為368μm、172μm 和2.14；回腸中絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度∕隱窩深度的值分別為305μm、145μm和2.10。

與對照組相比，試驗組的十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度分別提高了2.86%、13.23%和8.93%，而十二指腸和回腸的絨毛高度差異不顯著（P＞0.05），空腸的絨毛高度差異顯著（P＜0.05）；試驗組的十二指腸、空腸和回腸的隱窩深度分別降低了4.95%、8.99%和13.69%，但差異不顯著（P＞0.05）；試驗組十二指腸的絨毛高度∕隱窩深度提高了7.91%，但差異不顯著（P＞0.05），空腸的絨毛高度∕隱窩深度較對照組提高了24.42%，差異顯著（P＜0.05），回腸的絨毛高度∕隱窩深度較對照組提高了25.75%，差異顯著（P＜0.05）。

3.3 飼糧添加丁酸梭菌對仔豬血清D-乳酸和DAO的影響

當飼糧中丁酸菌添加量為0 cfu · g-1時，仔豬血清D-乳酸和DAO 的值分別為235 mmol · L-1和3.48 U·mL-1；當飼糧中丁酸菌添加量為1×105cfu·g-1時，仔豬血清D-乳酸和DAO 的值分別為221 mmol · L-1和3.05 U · mL-1。飼糧添加1×105cfu·g-1的丁酸梭菌，與對照組相比，D-乳酸降低5.96%，但差異不顯著（P＞0.05），而二胺氧化酶DAO顯著降低12.36%，差異顯著（P＜0.05）。

3.4 飼糧添加丁酸梭菌對仔豬腸道緊密連接蛋白表達的影響

當飼糧中丁酸菌添加量為0 時，仔豬空腸中ZO-1、Occludin、Claudin-1 的值都為1.00 cfu ·g-1；當飼糧中丁酸菌添加量為1×105cfu·g-1時，仔豬空腸中ZO-1、Occludin、Claudin-1 的值分別為1.05、1.35、1.12 cfu·g-1。

與對照組相比，試驗組空腸ZO-1 mRNA 水平的表達提高5%（P＞0.05），Occludin mRNA 水平的表達顯著提高35%（P＜0.05），Claudin-1 mRNA 水平的表達提高了12%，但差異不顯著（P＞0.05）。

4 討 論

與對照組相比，飼糧添加丁酸梭菌濃度分別為5×104、1×105和5×105cfu·g-1的試驗組在28～42 日齡階段和42～56日齡階段對仔豬生長性能影響較顯著；與對照組相比，試驗組在各日齡階段對仔豬的腹瀉影響極顯著；與對照組相比，試驗組有阻礙有害菌繁殖的趨勢，并且加快有益菌繁殖，增加有益菌數量；與對照組相比，試驗組空腸的絨毛高度、空腸的絨毛高度∕隱窩深度和回腸的絨毛高度∕隱窩深度差異顯著；與對照組相比，試驗組對仔豬血清D-乳酸的濃度影響不顯著，而對DAO 的活性顯著提高；與對照組相比，試驗組可提高仔豬空腸黏膜緊密連接蛋白mRNA水平的表達。

與對照組相比，試驗組的十二指腸、回腸和盲腸的總好氧菌數量均有降低趨勢，空腸和回腸的乳酸桿菌數量均顯著提高（P＜0.05），空腸、回腸和盲腸大腸桿菌數量均有降低趨勢。本次試驗結果基本上符合前人的研究，當然還有一定的誤差，在這次試驗中我們沒有涉及到腸道內pH 的測定，因此讓本次試驗的結果產生誤差。但是在仔豬飼糧中添加丁酸梭菌確實降低了仔豬腸道內的大腸桿菌數量，增加了乳酸桿菌即益生菌的數量。

本研究中，飼糧添加丁酸梭菌1×105cfu · g-1后，與對照組相比，D-乳酸降低5.96%，但差異不顯著（P＞0.05），而二胺氧化酶DAO 顯著降低12.36%（P＜0.05），血清中D-乳酸和DAO 的活性檢測結果趨勢一致。因此飼糧添加丁酸梭菌后，促進了腸上皮細胞的增生，保護腸黏膜。本試驗中，與對照組相比，試驗組空腸ZO-1和Claudin-1的表達均有提高趨勢，且Occludin 的表達顯著提高（P＜0.05）。因而，具有增強腸道黏膜屏障的功能。

空腸、回腸和盲腸中大腸桿菌的數量均有下降趨勢，分別降低3.41%、6.38%和4.58%。與對照組相比，十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度分別提高了2.86%、13.23%和8.93%，但十二指腸和回腸的絨毛高度與對照組相比，差異不顯著（P＞0.05）。與對照組相比，十二指腸、空腸和回腸的隱窩深度均差異不顯著，分別降低4.95%、8.99%和13.69%。空腸和回腸的絨毛高度∕隱窩深度顯著提高；與對照組相比，血清中DAO含量顯著降低，D-乳酸含量降低5.96%。與對照組相比，空腸緊密連接ZO-1和Claudin-1的表達分別提高5%和12%，Occludin的表達顯著提高。

5 結 論

本研究結果表明，丁酸梭菌對條件性致病菌大腸桿菌等病原菌擁有較強的抑制效果，在防治仔豬腹瀉方面療效顯著，并且不會導致耐藥菌株的出現。丁酸梭菌制劑作為飼料添加劑不僅活性高、穩定性好，并且能夠產生多種益生物質（丁酸、淀粉酶、維生素等），在動物腸道內頡頏或殺滅動物病原菌，促進腸道中優勢菌群的生長與繁殖，進而維持和調節腸道微生態平衡，同時提高動物的免疫機能及機體的抗病力，促進動物對飼料營養成分的消化吸收和利用，改善動物生長、生產性能和健康狀況，因而它可代替抗生素在畜牧業中廣泛應用。