microRNA-21、microRNA-25在肺癌組織中的表達及意義*

韓 樂，陳文娟，雷光焰，趙 征

1.陜西省腫瘤醫院胸外科 (西安 710061)；2.陜西省腫瘤醫院內三科 (西安 710061)

肺癌是全世界癌癥死亡的主要原因，其發病率逐年升高[1]。microRNA是一種非蛋白質編碼RNAs，可準確了解腫瘤發展進程[2]。研究表明，microRNA可能參與調控肺癌的發展，并在其發病機制中發揮關鍵作用[3]。microRNA是一種內源性的長度大約為22個核苷酸的非編碼RNA，主要通過切割目標mRNAs或抑制其翻譯來沉默基因表達，多種microRNA可能在多種腫瘤癌變過程中起著重要作用[4]。microRNA-21作為最豐富的的腫瘤基因之一，幾乎在所有腫瘤細胞中表達均高于正常對照組，與肺癌的發展密切相關，可參與腫瘤細胞侵襲、轉移[5-6]。microRNA-25是人染色體7q22.1的miR-106-25基因簇成員之一，參與多種惡性腫瘤發生、發展，microRNA-25在肺癌組織中的表達顯著高于正常值[7-8]。本研究通過探討microRNA-21、microRNA-25在肺癌組織及其癌旁組織中的表達情況，分析microRNA-21、microRNA-25在肺癌組織中的表達與臨床病理特征間的關系以及與肺癌患者生存情況的關系，并分析microRNA-21、microRNA-25的相關性，旨在為肺癌分子靶向治療提供理論依據。

資料與方法

1 一般資料 選取2011年1月至2014年1月我院收治的肺癌患者85例，采集手術切除的癌組織標本(研究組)及其癌旁組織(對照組)，其中男49例，女36例，年齡35～78歲，平均年齡(55.68±7.41)歲；腫瘤直徑1.5～8.0 cm；腫瘤TNM分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期28例，Ⅲ期22例，Ⅳ期19例；病理類型腺癌37例，鱗癌48例；淋巴結轉移14例，無淋巴結轉移71例。所有患者進行建檔，第1年每月進行1次隨訪，后每3個月隨訪1次，3年后每半年隨訪1次，隨訪時間5年?；颊咧椋瑯吮静杉ㄟ^我院生命科學倫理學審查委員會批準。病例納入標準：①病理確診為原發性肺癌；②均為首發病例；③術前均未接受放化療治療。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤患者；②繼發性肺癌患者；③嚴重心、肝、腎功能障礙者；④臨床資料不完整者。

2 研究方法 ①募集所有患者新鮮肺癌組織及其癌旁正常組織(距離癌組織邊緣≥3 cm)各85份，組織剪成薄片，每50 mg樣品加入1 ml Trizol裂解液，采用Trizol試劑盒提取肺癌組織及其癌旁正常組織總RNA，操作嚴格按照說明書進行，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳對RNA完整性做出判斷，使用分光光度計檢測RNA純度以及濃度，選取電泳條帶18 s，28 s條帶非常清晰，邊角銳利，28s條帶的亮度在18s條帶的兩倍或者兩倍以上，泳道內沒有拖尾以及A260mm/A280mm比值在1.8～2.0之間的樣品進行下一步實驗；②將提取的總RNA使用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，濃度在200～2000 ng/μl，嚴格按說明書加入各試劑，得到cDNA保存備用，反應條件：第一步，70°C 10 min，4°C 5 min；第二步，25°C 10 min，50°C 60 min，90°C 5 min，4°C 1 min；③實時熒光定量PCR使用SYBR Green試劑盒完成，反應體系20 μl，選擇Roche熒光定量PCR系統上機檢測，反應條件：95°C 15 min，1個循環，95°C 15 s，55°C 30 s，70°C 30 s，40個循環，microRNA-21實時熒光定量PCR引物序列為：上游5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCTIATCAGACTGA-3'，下游5'-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3'；microRNA-25實時熒光定量PCR引物序列為：上游5'-CATTGCACTTGTCTCGGTCTGA-3'，下游5'-TCAGACCGAGACAAGTGCAATG-3'；內參U6實時熒光定量PCR引物序列為：上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；④所得原始數據采用相對定量2一△△Ct方法進行分析，Ct值>35數據舍去，取三個復孔平均值為microRNA-21、microRNA-25 PCR擴增的最終Ct值，其中△△Ct=(microRNA-21/microRNA-25-內參U6)(研究組)-(microRNA-21/microRNA-25-內參U6)(對照組)。

結 果

1 兩組microRNA-21、microRNA-25表達水平比較 研究組microRNA-21、microRNA-25 mRNA相對表達水平顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2 microRNA-21、microRNA-25在肺癌組織中的表達與臨床病理特征的關系 microRNA-21、microRNA-25表達水平與肺癌患者TNM分期有關(P<0.05)，與Ⅰ、Ⅱ期患者相比，Ⅲ、Ⅳ期患者癌組織中microRNA-21、microRNA-25表達水平顯著上調(P<0.05)，而microRNA-21、microRNA-25表達水平與患者性別、年齡、是否吸煙、腫瘤大小、病理類型、淋巴結轉移無明顯相關性(P>0.05)，見表2。

表1 兩組microRNA-21、microRNA-25表達水平比較

表2 microRNA-21、microRNA-25在肺癌組織中的表達與臨床病理特征的關系

3 microRNA-21、microRNA-25表達與肺癌患者生存情況關系 Kaplan-Meier分析結果顯示，肺癌患者癌組織中microRNA-21高表達組中位生存期27.96個月(95% CI：26.79～29.14)，5年生存率26.47%，microRNA-21低表達組中位生存期37.42個月(95% CI：33.34～41.51)，5年生存率76.47%，microRNA-21高表達組中位生存期顯著短于低表達組，差異有統計學意義(Log-rankχ2=10.53，P<0.05)；microRNA-25高表達組中位生存期32.85個月(95% CI：31.28～34.42)，5年生存率24.59%，microRNA-25低表達組中位生存期45.22個月(95% CI：42.20～48.24)，5年生存率66.67%，microRNA-25高表達組中位生存期顯著短于低表達組，差異有統計學意義(Log-rankχ2=17.31，P<0.05)。見圖1。

圖1 microRNA-21(左)、microRNA-25(右)表達與肺癌患者生存情況關系

4 microRNA-21、microRNA-25在肺癌組織中表達的相關性分析 Spearman相關性分析結果顯示，肺癌組織中microRNA-21表達與microRNA-25表達呈顯著正相關(r=0.645，P<0.05)。

討 論

肺癌已成為最常見的惡性腫瘤之一，且大多數肺癌早期無明顯癥狀，患者難以被早期診斷，很多患者確診時已經處于中晚期，因此對肺癌患者進行早期診斷治療，有助于早期發現并給予肺癌患者及時有效治療，進而提高患者生存預后，延長患者生命[9]。microRNA作為基因表達重要的調節因子，在多種細胞過程以及包括腫瘤在內的疾病發展過程中具有重要的作用[10]。microRNA-21是最早檢測到的microRNA之一，參與多種腫瘤發生、發展過程，其在肺癌發病以及治療過程中的作用越來越受到學者們的關注[11]。報道表明，microRNA-21在多種腫瘤組織中呈顯著上調，如microRNA-21在胃癌組織中上調表達，且microRNA-21高表達與胃癌患者不良預后呈顯著相關[12-13]。同樣，microRNA-21在結直腸癌、肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤中高水平表達，并促進腫瘤細胞生長、轉移[14]。唐曦等[15]發現，microRNA-21在肺腺癌患者血清中顯著升高，血清中microRNA-21肺腺癌診斷中具有潛在的應用價值。張軒斌等[16]報道也表明，microRNA-21在非小細胞肺癌患者外周血以及癌組織中的表達水平顯著高于同期肺部良性病變患者以及癌旁組織。本研究結果顯示，microRNA-21在肺癌組織中的相對表達水平顯著高于癌旁組織，其表達與肺癌患者TNM分期有關，Ⅲ、Ⅳ期患者癌組織中microRNA-21表達水平顯著高于Ⅰ、Ⅱ期患者，而與患者性別、年齡、是否吸煙、腫瘤大小、病理類型、淋巴結轉移無相關性，表明microRNA-21在肺癌癌組織中上調表達，可能作為肺癌進展的一種腫瘤標志物，與既往文獻報道具有一致性。Kaplan-Meier生存分析顯示，microRNA-21高表達組生存率顯著低于低表達組，表明microRNA-21表達水平與肺癌患者生存密切相關，其高表達提示患者預后不佳，可能作為肺癌預后判斷的指標之一。

microRNA-25屬于miR-106-25基因簇成員，在腫瘤中起著原癌基因作用[17]。研究表明，microRNA-25在肺癌、胃癌以及乳腺癌等多種腫瘤組織中高水平表達，其可通過參與調控p53信號通路誘導腫瘤發生、發展[18]。Chen等[19]指出，microRNA-25在非小細胞肺癌組織中顯著上調，并與RGS3蛋白呈顯著負相關，其可能通過抑制RGS3表達參與肺癌發展。本研究結果顯示，microRNA-25在肺癌組織中的相對表達水平顯著高于癌旁組織，其表達與肺癌患者TNM分期有關，Ⅲ、Ⅳ期患者癌組織中microRNA-25表達水平顯著高于Ⅰ、Ⅱ期患者，而與患者性別、年齡、是否吸煙、腫瘤大小、病理類型、淋巴結轉移無相關性，表明microRNA-25在肺癌癌組織中顯著上調表達，其可能在肺癌進展過程中發揮作用，與既往報道相符。Kaplan-Meier生存分析顯示，microRNA-25高表達組生存率顯著低于低表達組，表明microRNA-25表達檢測有助于肺癌預后判斷。

本文研究結果還顯示，肺癌組織中microRNA-21表達與microRNA-25表達呈顯著正相關，表明兩者聯系緊密，在肺癌發生、發展過程中均起重要作用。Guo等[20]報道表明，通過降低COX-19表達來抑制microRNA-21促進的細胞凋亡，進而抑制非小細胞肺癌細胞增殖。此外，張軒斌等[16]報道指出，microRNA-21可通過靶向調節PTEN蛋白表達，促進肺癌細胞增殖、侵襲過程，其可能作為肺癌診斷和治療的潛在分子指標。研究顯示，microRNA-25通過靶向作用FBXW7，促進非小細胞肺癌增殖、運動[21]。但有關microRNA-21、microRNA-25共同調控肺癌腫瘤細胞增殖機制的報道較少，二者究竟如何共同參與肺癌發生、發展過程的分子機制尚不明確，還需后續進一步研究。總之，檢測肺癌癌組織中microRNA-21、microRNA-25表達水平，可能有助于判斷肺癌進展以及評估患者預后，為臨床治療提供參考。

綜上所述，microRNA-21、microRNA-25在肺癌組織中呈高水平表達，其表達水平與患者臨床分期有關，且肺癌組織中microRNA-21表達與microRNA-25表達呈顯著正相關，上述指標有可能能夠預測肺癌發生、發展以及預后，對肺癌診治有一定的臨床意義。