鎮江香醋耐高溫優勢醋酸菌的篩選及其發酵特性的比較研究

華青松，宗朕，余越，張雨艷，周濤，王周明，柳志杰

(湖北工業大學，工業發酵湖北省協同創新中心，武漢 430068)

食醋作為一種調味品，具有豐富的營養和獨特的風味，在人們的飲食中占有重要地位。原料經液化、糖化、酒精發酵、醋酸發酵等一系列的發酵過程，最終產生香氣宜人、營養豐富的食醋[1]，醋酸發酵是食醋釀造中關鍵的環節[2，3]。醋酸菌(acetic acid bacteria, AAB)是一類嚴格好氧的革蘭氏陰性細菌，因其氧化乙醇生成醋酸能力強、高耐醋酸等特性而成為醋酸發酵的主要工業菌種[4]。醋酸菌AS1.41是工業上廣泛應用的醋酸菌，其最適發酵溫度為28～33 ℃[5]。當處于炎熱的夏季時，固態釀造中醋醅溫度升高，超出了常規醋酸菌適宜的生長溫度，嚴重影響發酵質量，增大發酵成本[6]。因而篩選能夠耐高溫且高產酸的菌株對于高溫條件下固態食醋的釀造具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品來源：江蘇鎮丹玉香醋酸醅。

試劑：葡萄糖、酵母提取物、CaCO3、NaOH、無水乙醇、瓊脂、瓊脂糖、MgSO4、酚酞、Taq DNA聚合酶、16S rDNA通用引物、普通凝膠DNA回收試劑盒、1 kb DNA Marker。

儀器：電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫培養箱、立體培養搖床、紫外分光光度計、PCR儀、電泳儀、氣相色譜-質譜連用儀(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)。

1.2 培養基

固體培養基：酵母提取物1%、葡萄糖1%、MgSO40.01%、CaCO32%、瓊脂2%，115 ℃ 0.1 MPa滅菌20 min，待溫度降至50 ℃，加入4%無水乙醇。

液體培養基：酵母提取物1%、葡萄糖1%、MgSO40.01%，115 ℃ 0.1 MPa滅菌20 min，待溫度降低至室溫，加入4%無水乙醇。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌落篩選及純化

取5 g醋醅，30 ℃，200 r/min液體培養活化20 h，取活化后的菌液用生理鹽水梯度稀釋至10-5后，均勻涂布于固體培養基上，37 ℃恒溫培養4～5 d。用接種環挑取長勢良好且產生較大透明水解圈的單菌落用于平板劃線法分離純化。

1.3.2 產酸定性試驗[7]

挑取純化后的菌落，接種于液體培養基，30 ℃培養72 h，取5 mL菌液，離心取上清液，以2.5 mol/L NaOH溶液中和至pH 7.0，加入5% FeCl3溶液5～6滴，形成紅褐色沉淀即為產醋酸細菌。

1.3.3 菌株的16S rDNA鑒定

PCR擴增體系：15 μL ddH2O、20 μL 2×Taq酶、2 μL引物27F、2 μL引物1492R、1 μL菌液作為模板。

擴增條件：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性8 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，72 ℃終延伸5 min，循環30次。

PCR產物進行凝膠電泳，并加入DNA Marker作對比，將大小為1500 bp左右的片段切下用作凝膠DNA回收，最終產物送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序，測序結果用DNAStar拼接后，在NCBI中進行同源序列對比，選定相似度高的序列用MEGA 7.0構建系統發育樹[8]。

1.3.4 菌種生物量(OD600)的測定

將AABA、AABC、AS1.41 這3株產酸菌按初始OD的0.01接種量，在30，37，40 ℃下，200 r/min搖瓶培養，測定不同培養時間的OD600，繪制相應生長曲線。

1.3.5 產酸量的測定[9]

每隔24 h取上述培養菌液5 mL，滴加2～3滴1%的酚酞試劑，用0.5%的NaOH標準溶液滴定，再根據堿液的消耗量來確定產酸量，公式為：

式中：V為滴定NaOH消耗的體積；V0為空白對照組消耗NaOH的體積；CNaOH為NaOH的濃度；60為NaOH的相對分子質量[10]。

1.4 耐高溫醋酸菌的脂肪酸組成分析

取菌液離心后的菌體0.5 g，加入5 mL醋酸，渦旋混勻后加入20 mL氯仿-甲醇(2∶1，V/V)溶液，緩慢水浴振蕩30 min,3000 r/m離心10 min，取最下層液體，渦旋蒸發至干燥，加入0.1 mg十五酸、3 mL硫酸-甲醇溶液復溶，90 ℃放置2 h，加入1 mL 0.9%氯化鈉溶液和500 μL正己烷，渦旋混勻，10000 r/min離心10 min，取有機層，即為脂肪提取物，再將提取的醋酸菌粗脂肪通過GC-MS分析脂肪酸組成。

1.5 數據處理

所有試驗重復3次，數據用SPSS 20和Origin 2017統計軟件處理。

2 結果與討論

2.1 耐高溫醋酸菌的初步篩選

將活化后的菌液均勻涂布在含CaCO3的固體培養基上，37 ℃恒溫培養3～5 d。根據醋酸菌菌落特征，挑選菌落形態為圓形，中部凸起，表面呈光滑油脂狀，邊緣整齊且透明圈較大的菌落，進行劃線純化培養3次，隨后進行產酸定性試驗，進一步在液體培養基中37 ℃培養復檢，初步篩選出2株耐37 ℃的產酸菌株，分別命名為菌株AABA和菌株AABC。

2.2 產酸菌株的鑒定

16S rRNA是細菌核糖體RNA的亞基之一，其編碼基因為16S rDNA，16S rDNA編碼序列由保守區和可變區交替組成，其中保守區序列體現了細菌種間親緣關系，而可變區則體現了細菌的種間差異，通過對16S rDNA的擴增和測序可以快速、精確地鑒定未知菌種，比傳統細菌鑒定方法更為高效和精確[11]。

本試驗通過菌液PCR，對相應菌株的16S rDNA進行擴增，電泳結果見圖1。

圖1 AABA、AABC兩株菌16S rDNA PCR產物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR products of two strains of AABA and AABC

初步確定約1500 bp的擴增片段為對應菌株16S rDNA，隨后進行凝膠DNA回收和測序。測序結果用DNAStar進行拼接，確定菌株AABA的16S rDNA片段長度為1359 bp，菌株AABC的片段長度為1357 bp，再將序列在NCBI進行同源序列Blast比對。

菌株AABA與NCBI同源序列Blast比對結果見表1。

表1 菌株AABA與NCBI數據庫比對結果Table 1 Comparison results of strain AABA and NCBI database

續 表

由表1可知，選取與菌株AABA相似度最高的6株菌均屬于巴氏醋酸桿菌屬，菌株AABA與NCBI數據庫中已知巴氏醋酸桿菌皆有較高的相似度。測序結果采用相鄰法構建系統發育樹，見圖2。

圖2 菌株AABA的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain AABA

由圖2可知，菌株A和KT283054.1Acetobacterpasteurianusstrain FY-24等巴氏醋桿菌菌株親緣關系較近，相似度達到100%，因此確定菌株AABA屬于巴氏醋酸桿菌屬。菌株AABC與NCBI同源序列Blast比對結果見表2。

表2 菌株AABC與NCBI數據庫比對結果Table 2 Comparison results of strain AABC and NCBI database

由表2可知，菌株AABC與NCBI數據庫比對中，與Acetobacterpasteurianusstrain DHMV3706等菌的相似度接近100%，再構建菌株AABC的系統發育樹，見圖3。

圖3 菌株AABC的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain AABC

由圖3可知，AABC與巴氏醋酸桿菌屬的親緣性較好，相似度可達100%，從而判定菌株AABC屬于巴氏醋酸桿菌屬。

2.3 溫度對產酸菌生長的影響

大部分醋酸菌的最適生長溫度在30～35 ℃，溫度過低菌株生長緩慢，溫度過高則抑制其生長，老化加快，降低產酸速率，甚至導致菌體死亡[12]。為了探究高溫對所篩選菌株的影響，分別在30，37，40 ℃溫度下對其進行液體培養，以工業菌株AS1.41作為參照，測定篩選菌株的生長曲線,結果見圖4。

圖4 不同溫度下菌株的生長曲線Fig.4 Growth curves of strains at different temperatures

由圖4可知，在30 ℃培養條件下，菌株AABC生長達到穩定期時間晚于AS1.41,但OD600值相差不大。而AABA相比于AS1.41和AABC生長較差，最終生物量僅為兩個菌株的一半。在37 ℃下培養時，AS1.41和AABC生長均受到一定抑制，而AABA則表現出較好的生長狀況，兩株篩選菌與AS1.41在生物量方面沒有顯著差別。說明菌株AABA最適生長于溫度高于30 ℃的條件下。40 ℃下菌株AABA、AS1.41基本不生長，而菌株AABC生長狀況雖然同較低溫度相比，生物量呈下降趨勢，但最大OD600與30 ℃時接近。菌株AABA和AS1.41在培養第3天后就開始衰亡，而菌株AABC從第6天開始進入衰亡期，說明在40 ℃時菌株AABC雖然生長較慢，但仍可以達到較高的生物量。

2.4 溫度對產酸菌株產酸量的影響

醋酸菌產酸能力是評價醋酸菌特性的重要指標之一。醋酸菌產酸速率及產酸量會受到溫度的影響，溫度太高會抑制菌株的生長代謝，從而降低產酸量，因此評價耐高溫醋酸菌的產酸能力，對其實際應用具有重要的意義。本試驗分別測定了30，37，40 ℃ 3個溫度下菌株AABA、AABC、AS1.41的產酸量，3株菌株在不同溫度下的最高產酸量見圖5。

圖5 30，37，40 ℃下AABA、AABC和AS1.41的產酸量Fig.5 Acid production of AABA,AABC and AS1.41 at 30，37，40 ℃

由圖5可知，當培養溫度為30 ℃時，菌株AABC與AS1.41產酸量都在30 g/L左右，菌株AABA產酸量稍低；當培養溫度為37 ℃時，菌株AABA和AABC的產酸量有顯著增長，其中菌株AABA的產酸量可達到45.5 g/L，而AS1.41同30 ℃相比，產酸量顯著下降為16.0 g/L。培養溫度為40 ℃時，菌株AABC的產酸量為28.0 g/L，而菌株AABA和AS1.41基本不產酸。因此可以得出，AABA在37 ℃下具有比工業菌株AS1.41更高的產酸量，AABC在40 ℃高溫下生長狀況較好，且有較高的產酸量，說明AABC和AABA在高溫下具有比工業菌株AS1.41更好的表現，為耐高溫優勢產酸菌株。

2.5 脂肪酸組成分析

微生物生長過程中，細胞膜脂肪酸組成呈動態變化，細胞中不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸組成隨細胞生長環境條件，如溫度、pH或各種生長因子存在狀況及生長期等變化發生改變[13-15]。微生物會通過調節細胞膜脂肪酸組成成分改變細胞膜的流動性來應對不利的外在環境。本試驗研究了30，37，40 ℃下菌株AABC以及30，37 ℃下AS1.41的脂肪酸組成，從脂肪酸組成的變化來初步探究醋酸菌耐高溫的機理。利用GC-MS測定脂肪酸組成，得到脂肪酸相對含量結果，見圖6。

圖6 溫度對醋酸菌細胞膜脂肪酸的組成成分影響Fig.6 Effect of temperature on the composition of fatty acids in acetic acid bacteria cell membrane

由圖6可知，溫度從30 ℃上升到40 ℃時，菌株AABC中C14∶0含量呈明顯的下降趨勢，從36.28%下降到9.3%，C16∶0呈顯著上升趨勢，從18.77%上升到47.8%。相比于AS1.41，在37 ℃時，菌株AABC的C14∶0含量較高，C16∶0含量較低。隨溫度上升，兩株菌C18∶1和C18∶2含量上升，因而推測，為適應不利環境，細胞膜中不飽和脂肪酸相對比例提高，增強了細胞流動性，對細胞內外物質交換以及代謝進程產生影響，從而提高細胞對惡劣條件的抵抗能力。

3 結論

鎮江香醋發酵過程中，醋酸菌具有重要的作用，會對食醋的品質和風味產生重要影響。本試驗從鎮江香醋醋醅中篩選、純化、鑒定得到兩株具有一定高溫耐受性和產酸能力的巴氏醋酸桿菌屬菌株——AABA和AABC。通過對其發酵性能進行研究發現，37 ℃下菌株AABA生長狀況好，具有較強的產酸能力，產酸量為45.5 g/L。而菌株AABC在40 ℃高溫下，生長狀況良好，產酸量達到28 g/L。通過對細胞膜脂肪酸相對含量進行分析發現，隨著溫度的升高，細胞膜不飽和脂肪酸相對含量提高，可能是由于不飽和脂肪酸相對含量的提高增強了細胞膜的流動性，從而提高了醋酸菌對高溫條件的適應能力。本研究對耐高溫優勢醋酸菌的篩選及對耐高溫機理的初步探討為高溫條件下高品質固態發酵食醋的釀造提供了參考。