Nisin產生菌株的篩選及產物初步探究與鑒定

李俊輝，王燕，周寶琳，李丕武，趙鑫君，王婷*

(1.齊魯工業大學(山東省科學院)，山東省微生物工程重點實驗室，濟南 250353；2.山東省中醫藥大學，濟南 250353)

細菌素(bacteriocin) 是細菌在代謝過程中由核糖體合成并分泌到環境中的一類具有抑(殺)菌活性的代謝產物, 通常是低分子量的多肽或者蛋白類物質[1,2]。自1925年Gratia發現第一個細菌素以來，已發現上百種細菌可以產生細菌素[3,4]。而乳酸鏈球菌素(Nisin)是由某些乳酸乳球菌產生的具有34個氨基酸殘基的多肽類物質[5，6]，能對某些革蘭氏陽性菌，尤其對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等食源性致病菌起到強烈的抑制作用[7]。作為天然的抑菌劑，可以減少或避免化學防腐劑所帶來的安全隱患, 提高食品品質，是一類極具開發潛力的天然食品防腐添加劑[8]。

Nisin是由乳酸乳球菌產生的，但并非所有的乳酸乳球菌只產生Nisin，還有熱敏感的雙球菌素(diplococcin)、乳球菌素(lactococcin)等多種細菌素[9，10]。如今雖然許多文章對Nisin產生菌的篩選進行了研究，但大多停留在生理生化試驗的基礎上進行初步的斷定，在鑒定產生Nisin菌株的方法上尚不夠嚴謹。因此，能夠快速、準確地篩選到產Nisin的乳酸菌株，為天然抑菌物質與乳酸菌在發酵食品相結合的應用方面開辟更廣闊的前景，為生物食品抑菌劑提供理論基礎[11]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品及指示菌

市售新鮮小白菜葉；Nisin標準品：Sigma公司；H103大孔吸附樹脂：陜西樂博生化科技有限公司；金黃色葡萄球菌：由本實驗室提供。

1.1.2 培養基

改良GM17培養基(發酵培養基)：酪蛋白胨5 g，大豆蛋白胨2.5 g，牛肉粉5 g，酵母浸粉5 g，蔗糖5 g，抗壞血酸0.5 g，β-甘油磷酸鈉，硫酸鎂0.25 g, 蒸餾水1000 mL，自然pH，若配制固體培養基則加入1.5%瓊脂。

篩選培養基：在改良的GM17培養基中添加0.004%溴甲酚紫和1500 IU/mg的Nisin標準品。

指示菌培養基：1% K2HPO4牛肉膏蛋白胨培養基: 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，K2HPO410 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，自然pH。

1.1.3 試劑

三乙胺(分析純)、磷酸：天津市富宇精細化工有限公司；乙腈(色譜純)：上海星可高純溶劑有限公司；pH 3.0的水為用鹽酸溶液將超純水調至 pH (3.0±0.1)而得。

1.2 儀器與設備

ZHJH-C1214C垂直流超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司； BPH-9042恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；HVE-50全自動高壓滅菌鍋 華粵集團有限公司；Rotavapor R-210 型旋轉蒸發儀 瑞士 Buchi 公司；LC-VP島津液相儀 日本島津公司；Inertsil ODS-3 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm ) 日本GL Sciences公司；實驗用水為 Milli-Q 純水儀制備的超純水。

1.3 方法

1.3.1 乳酸鏈球菌素母液的配制

稱取0.01 g Nisin標準品(原始效價為1000 IU/mg)，溶于20 mL 0.02 mol/L鹽酸溶液中，此時效價為5000 IU/mL, 使用前需經孔徑為0.22 μL的微孔濾膜過濾除菌。

1.3.2 樣品處理

取市售新鮮小白菜葉，無菌水去除表面泥垢后，切片，大小在1 cm2為宜。

1.3.3 分離方法

將處理好的白菜葉片置于5 mL液體篩選培養基中，30 ℃靜置培養24 h。將該富集培養液制備成10-4、10-5、10-6稀釋度的菌懸液，分別吸取0.1 mL涂布于固體篩選培養基上，30 ℃培養48 h，挑取明顯使培養基變黃的單菌落，轉接到液體培養基中培養24 h，測定發酵液的酸度，將產酸的菌做革蘭氏染色鏡檢，最終得到革蘭氏陽性、球形、具有Nisin耐受性的乳酸菌菌株，以進行下一步的抑菌活性測定。

1.3.4 抑菌活性的測定1.3.4.1 指示菌懸液的制備

將金黃色葡萄球菌于1% K2HPO4牛肉膏蛋白胨液體培養基中振蕩培養，取生長量為107CFU/mL的金黃色葡萄球菌培養液作為指示菌懸液。

1.3.4.2 菌株發酵液的預處理

使用5 mol/L的HCl將30 ℃培養24 h的乳球菌發酵液調至pH 3，于90 ℃水浴30 min，6000 r/min離心8 min，去除沉淀，收集上清液備用。

1.3.4.3 牛津杯法測定抑菌活性

取0.2 mL指示菌懸液涂平板，待干燥后用無菌鑷子放置牛津杯(內徑6.0 mm,高8.0 mm)中。取經預處理后的發酵上清液50 μL加入牛津杯內，并做陰性和陽性對照，37 ℃培養48 h，觀測抑菌圈大小。

1.3.5 菌株鑒定

將具有抑菌特性的菌株提取基因組，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行16S rDNA鑒定，數據提交美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information， NCBI)，通過基本本地隊列搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool， BLAST)進行同源性比較，用Mega 7.0軟件構建系統發育樹。

1.3.6 抑菌物質特性的初步探究與鑒定1.3.6.1 發酵時間對抑菌性的影響

將篩選的菌株接種到發酵培養基中，30 ℃發酵培養48 h，培養過程中分別在12～48 h期間，每4 h取發酵液，以牛津杯法做抑菌圈試驗(重復3次，取平均值)。

1.3.6.2 熱處理和pH對抑菌物質活性的影響

使用鹽酸溶液將30 ℃培養24 h的乳球菌發酵液分別調至pH 2～pH 9，于90 ℃水浴30 min熱處理，以未熱處理的發酵液做對照，以牛津杯法做抑菌圈試驗，測定抑菌物質的活性(重復3次，取平均值)。

1.3.7 高效液相色譜法(HPLC)分析1.3.7.1 發酵液濃縮純化

將30 ℃下培養24 h的發酵液調至pH 3.0，于90 ℃熱處理30 min并于冰上迅速放涼，離心10 min去除沉淀。然后通過搖瓶吸附的方法[12]，加入1%的H103大孔吸附樹脂，于37 ℃下搖動吸附8 h后裝入層析柱。使用pH 3的75%乙醇溶液進行洗脫，洗脫液用 Nisin 活性 Buffer(pH 3的鹽酸水溶液)稀釋2倍，于旋轉蒸發儀上在低溫(30 ℃)懸蒸30 min，待乙醇除凈后，將溫度調至50 ℃將多余的水分懸蒸出去，最終得到稀釋前溶液體積的1/3，該溶液即為Nisin純化液。

1.3.7.2 流動相配制

緩沖液A：48 mmol/L三乙胺水溶液，用磷酸調至pH 3.0。

緩沖液B：緩沖液A與乙腈的混合液(緩沖液A體積含量為22.5%)。

1.3.7.3 標準品和樣品前處理

精確稱取0.01 g Nisin標準品，用0.02 mol/L鹽酸溶液溶解，使效價為10000 IU/mL，用孔徑0.22 μm的水相微孔濾膜過濾。純化液樣品，同樣用孔徑0.22 μm的水相微孔濾膜過濾。

1.3.7.4 色譜條件

流動相A，B兩相：0～15 min，緩沖液B由30%上升到50%；15～20 min，緩沖液B維持50%。

色譜柱：反向C18柱；柱溫：35 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：235 nm；進樣量：20 μL。

2 結果與分析

2.1 Nisin產生菌的平板初篩

在初篩過程中，通過設定4個篩選條件從樣品中定向篩選Nisin產生菌，以盡可能減少雜菌對試驗的影響。首先，基于Tsai H J等[13]的研究，編碼乳酸鏈球菌素前體的基因(nip+)和其抗性基因(nis+)以及蔗糖發酵基因(suc+)緊密連鎖。因此，以蔗糖作為唯一碳源，用于Nisin產生菌的篩選。其次，將培養基中添加一定效價的Nisin，可以減少部分革蘭氏陽性菌的生長，減少雜菌污染，而對于要篩選的產Nisin的乳酸乳球菌來講，由于其本身可以產生Nisin，因此，可以在具有一定效價的培養基上正常生長。再者，由于Nisin是由乳酸乳球菌產生的，因此，配以溴甲酚紫作指示劑，可以快速找到產酸的單菌落，將其挑出，劃線培養，見圖1。最后，通過革蘭氏染色，鏡檢(見圖1中B)，篩選革蘭氏陽性、細胞形態為球形的菌株。綜上，選擇同時具備上述4個條件特征的菌株進行下一步的抑菌試驗。

圖1 菌落形態A和細胞形態BFig.1 Colony morphology A and cell morphology B

2.2 菌株抑菌活性檢測

將初步篩選到的菌株進行抑菌圈試驗，驗證其發酵產物是否具有抑菌特性，見圖2。4個樣品均通過相同的處理， 1號為發酵培養基做陰性對照，4號是發酵培養基中加入了Nisin標準品的陽性對照。可以看到不含有Nisin的1號沒有產生抑菌圈，而加入Nisin的3號產生了最大的抑菌圈，2號和4號為篩選到的具有較好抑菌效果的兩株菌，其中4號的抑菌圈更大，表現出更好的抑菌效果，將其命名為L-217。

圖2 兩株菌株的抑菌效果圖Fig.2 Antibacterial effect of two strains

2.3 菌種鑒定

將篩選到的具有較好抑菌效果的L-217菌株提基因組，PCR純化后，送到生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序分析，將得到的測序結果在NCBI中進行同源性比較，同源性較高的為乳酸乳球菌屬(Lactococcuslactis)，同源性大于99%。將其與搜索到的同源性大于97%的菌株，用Mega 7.0軟件構建系統發育樹，見圖3。發現L-217菌與乳酸乳球菌屬(Lactococcuslactis)最近，與山羊奶乳球菌屬(Lactococcushircilactis)、富士山乳球菌(Lactococcusfujiensis)和象白蟻乳球菌(Lactococcusnasutitermitis)親緣關系則較遠，結合菌株形態和生理生化特征等綜合分析， 鑒定該菌為乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)。

圖3 菌株L-217的16S rDNA 的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA of strain L-217

2.4 產物的初步探究與鑒定

2.4.1 發酵時間對抑菌效果的影響

圖4 發酵時間對抑菌效果的影響Fig.4 Effect of fermentation time on antibacterial effect

由圖4可知，該菌在培養至12 h時開始產生抑菌物質，隨時間增加，抑菌活性快速提高，在生長至24 h時，表現出最大的抑菌活性。隨后，其抑菌活性呈現緩慢下降趨勢，這可能是培養基中的營養物質不足，該菌開始利用自身產生的抑菌物質。因此，將發酵培養24 h作為該菌抑菌活性測定的最佳發酵時間。

2.4.2 熱處理和酸處理對抑菌物質活性的影響

Nisin具有親水和疏水兩重性，即在N-末端存在大量的疏水殘基，在C-末端存在著親水基團，其表現出陽離子多肽的特性，等電點在堿性范圍；其溶解度和穩定性等與溶液的pH值密切相關[14]。Nisin的溶解度隨pH值的下降而提高，而在堿性條件下幾乎不溶解。熱穩定性與其在不同pH值下的溶解度有關。溶液在pH 2.5或更低值的鹽酸溶液中煮沸，其活性不發生變化，即使在115 ℃加熱一定時間還很穩定。121 ℃加熱30 min，尚未完全失去活性。當pH值超過4時，溫度升高會使它在水溶液中迅速失活。根據這一特點，對篩選到的菌株產生的抑菌物質進行研究，可對抑菌物質是否為Nisin 進行初步的鑒定。

圖5 pH和熱處理對發酵液中抑菌物質的影響Fig.5 Effects of pH and heat treatment on bacteriostatic substances in fermentation broth

由圖5可知，未熱處理過的樣品，隨著pH的升高，抑菌物質的活性呈下降趨勢，在中性環境甚至是堿性環境下，不再具有抑菌活性，這與Nisin的溶解性特點相符合，隨著pH的升高，溶解度降低，其活性也不穩定。此外，在pH 6時的抑菌圈直徑并沒有太大幅度的降低，從這一點可以排除是某些有機酸干擾下造成的假陽性，側面驗證了起到抑菌效果的物質就是細菌素。而在熱處理條件下，可以發現在pH 2、pH 3的條件下，90 ℃熱處理30 min，抑菌物質的活性和未熱處理過的樣品活性基本一致，說明該物質在pH 2～3的條件下，具有極高的耐熱性。這一點可以說明不是由乳酸乳球菌產生的不具有耐熱性的大分子雙球菌素，進一步證實該抑菌物質極有可能就是具有熱穩定性的Nisin。同時熱處理的發酵液也可以排除過氧化氫對抑菌效果造成的假陽性干擾。

2.4.3 發酵液中抑菌物質的初純化

通過大孔樹脂動態吸附純化后，得到純化液中抑菌物質的濃度增大，表現出更好的抑菌活性，見圖6。

圖6 發酵液純化過程中各樣品抑菌效果圖Fig.6 Antimicrobial effect of each sample in the purificationprocess of fermentation broth

A，B，C，D對應的樣品分別是發酵液、吸附殘液、洗脫液、旋蒸濃縮液，將4個樣品做抑菌圈試驗，可以看到發酵液本身存在抑菌物質，表現出抑菌特性；經大孔樹脂吸附后的殘液中不再具有抑菌活性，說明大孔樹脂將抑菌物質全部吸附；而用pH 3.0的75%酒精洗脫后，加入Nisin活性Buffer稀釋得到的洗脫液，產生了抑菌圈，說明抑菌物質被洗脫下來；最后通過旋蒸濃縮，去除溶液中酒精的同時，提高了樣品中抑菌物質的濃度。由圖6可知，旋蒸濃縮后的樣品，抑菌圈又顯著增大，為HPLC檢測做好了準備。

2.4.4 HPLC對產物的分析鑒定

目前國內外關于 Nisin 的檢測方法主要包括瓊脂擴散法、生物熒光法、電泳法、比濁法和免疫吸附法等[15-19]，而HPLC法用于測定Nisin含量不僅簡便快速、精密度高而且重現性和穩定性好，因此，本文釆用的檢測方法是Chan等[20]利用48 mmol/L三乙基胺磷酸鹽在232 nm下對Nisin的檢測方法。

圖7 濃縮純化液與Nisin標準品對比圖譜Fig.7 Contrast map of concentrated purified solution and Nisin standard sample

由圖7可知，Nisin標準品在11.4 min左右出現了吸收峰，出峰時間與所提供方法的出峰時間基本一致。因此，確定了Nisin的出峰時間；通過樣品與Nisin標準品的對比可以看出，在純化的樣品中雖然仍存在著許多雜質，但是它與標準品出現了同樣的吸收峰，證明該樣品中確實存在Nisin，印證了篩選到的就是產Nisin的乳酸乳球菌。

3 結論

本文根據乳酸乳球菌的特點先快速、準確篩選到具有抑菌特性的菌株，根據形態特征和生理生化特性，并通過16S rDNA序列分析技術，將其確定為乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，命名為L-217。再進一步通過熱處理和酸處理試驗對抑菌物質性質進行初步的探究，最后通過HPLC法與Nisin標準品進行比對發現：該菌株產生的抑菌物質與Nisin標準品在同樣的時間具有吸收峰。綜合這兩方面的結果，可以認定該菌株為具有產Nisin特性的乳酸乳球菌。本文從乳酸菌的篩選、Nisin的吸附、濃縮、純化，HPLC檢測進行分析，建立了一套快速、準確篩選Nisin產生菌株的方法，為從自然界中Nisin產生菌株的篩選和鑒定提供了有效依據，為天然食品添加劑Nisin的生產以及以此菌株為基礎的功能食品、醫用食品等領域提供了重要的菌株資源。