西江肉桂揮發油提取工藝優化及抗氧化研究

馬延紅，李賽男，劉文華

(肇慶學院 生命科學學院，廣東 肇慶 526061)

肉桂為樟科植物肉桂(CinnamomuncassiaPresl)的干燥樹皮，是《中國藥典》收載的一味傳統中藥，也常作為調味品和香料使用[1]。肉桂氣香濃烈，味甜、辣，具有補火助陽、散寒止痛、溫通經脈的功效[2]。肉桂通常生長于熱帶、亞熱帶地區，中國作為世界桂皮的四大產區之一，產量占世界肉桂總產量的80%以上[3]，在世界桂皮進出口貿易中占據重要地位[4]。中國的肉桂主要分布于廣東、廣西地區，此地出產的桂皮質優味濃，揮發油含量高，被稱為“西江肉桂”。與同類桂皮相比，西江肉桂無論是揮發油含量還是揮發油形狀和香氣，均具有極大優勢[5]。揮發油是肉桂的主要有效成分，也是發揮生理活性的重要物質基礎。肉桂油中含有多種小分子醛類、酚類、烯類、醇類等化合物，具有濃烈的香味，并可隨水蒸氣揮發出來。桂皮醛和苯乙醛為肉桂油的主要成分，其中桂皮醛含量高達80%以上[6，7]，且肉桂醛是桂皮發揮調味作用和藥用價值的重要有效成分[8]。

水蒸氣蒸餾法具有操作簡便、成本低、無溶劑殘留等優點，是目前提取肉桂油最普遍的方法[9]。水蒸氣蒸餾法的提取效率受到物料粉碎粒度、料液比、浸泡時間、提取時間等多種因素影響。因此，本試驗以桂皮為原料，采用水蒸氣蒸餾法研究不同提取條件對肉桂油提取率的影響，確定最佳提取工藝，為肉桂油的產業化生產提供一定的參考。同時，利用體外抗氧化試驗測定肉桂精油的總還原能力、羥自由基清除率和DPPH清除率，評定其體外抗氧化能力。廣東肇慶作為中國肉桂的主要產區之一，種植面積基本保持在100萬畝以上，產量占全國總產量的1/3[10]。提高肉桂油的加工效率和產量，探討其深層次研究價值，對于肉桂的合理開發利用具有重要意義。

1 試驗儀器

BSA124S-CW分析天平 賽多利斯科學儀器有限公司；Q-800D高速萬能粉碎機 上海冰都電器有限公司；UV-6300紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；DK-98-II電爐 天津泰斯特儀器有限公司。

肉桂：產自廣東肇慶，購于廣州市清平藥材市場；抗壞血酸標準品：購于廣東光華科技股份有限公司；DPPH：購于上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、無水硫酸鈉、三氯乙酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵、水楊酸：均購于廣州化學試劑廠。

2 試驗方法

2.1 肉桂油的提取

將桂皮適當干燥，粉碎、過篩后置于5 L的蒸餾燒瓶中，加入浸提劑，用水蒸氣蒸餾法(依據試驗設計選擇不同的粉碎粒度、料液比、浸泡時間和蒸餾時間)提取肉桂油。經水油分離、無水硫酸鈉除水后，密封保存于4 ℃冰箱中，備用。

2.2 單因素試驗

選取不同的料液比、粉碎粒度、浸泡時間和蒸餾時間等因素進行單因素試驗。

料液比的確定：準確稱取25 g肉桂粉末，過20目篩，分別加入200,250,300,350 mL蒸餾水作提取溶劑，固定粉碎粒度為20目，浸泡時間為0 h，蒸餾時間為3 h，在以上條件下提取肉桂揮發油。

粉碎粒度的確定：準確稱取25 g肉桂粉末，分別過20,50,60,100目篩，加入300 mL蒸餾水作提取溶劑，固定料液比為1∶12，浸泡時間為0 h，蒸餾時間為3 h，在以上條件下提取肉桂揮發油。

浸泡時間的確定：準確稱取25 g肉桂粉末，過20目篩，加入300 mL蒸餾水作提取溶劑，分別浸泡0,1,2,3 h后提取，固定料液比為1∶12，粉碎粒度為20目，蒸餾時間為3 h，在以上條件下提取肉桂揮發油。

蒸餾時間的確定：準確稱取25 g肉桂粉末，過20目篩，加入300 mL蒸餾水作提取溶劑，固定料液比為1∶12，粉碎粒度為20目，浸泡時間為0 h，分別蒸餾3,4,5,6 h，在以上條件下提取肉桂揮發油。

2.3 正交試驗

利用正交試驗設計優化肉桂揮發油的提取工藝，在以上4個單因素試驗中，選擇溶劑料液比、物料粉碎粒度、浸泡時間和蒸餾時間進行四因素三水平正交試驗。

2.4 抗氧化活性的測定

2.4.1 DPPH法

量取不同量的揮發油于50 mL的容量瓶中，用95%乙醇將樣品配制成 0.4, 0.8, 2.0, 4.0, 8.0 mg/mL不同濃度的樣品溶液，將1 mL上述藥液加入2 mL濃度為0.5 mmol/L的DPPH 溶液，室溫遮光放置30 min，反應完全后，于517 nm波長處測其吸光度，每個試樣做3個平行樣，取平均值。用相對應濃度的抗壞血酸作為陽性對照組，并以抗壞血酸濃度和自由基清除率做標準曲線。樣品結果以每克樣品中所含抗壞血酸當量來表示[11]。

DPPH清除率=[(A0-A1)/A0]×100%。

式中：A0為未加藥時DPPH溶液的吸光度；A1為抗壞血酸溶液或樣品溶液添加DPPH溶液的吸光度。

2.4.2 總還原能力的測定

采用鐵氰化鉀還原法[12]。取0.4,0.8,2.0,4.0,8.0 mg/mL不同濃度的肉桂揮發油溶液各1 mL加入試管中，依次加入2.5 mL的 PBS溶液和2.5 mL 1%的K3Fe(CN)6，混勻，于50 ℃恒溫水浴20 min，加入10% 三氯乙酸溶液2.5 mL，用轉速為3000 r/min的離心機離心10 min，取上清液2.5 mL，再加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，混勻，室溫放置10 min后，于700 nm波長下測其吸光度，每個試樣做3個平行樣，取平均值。以與藥液同樣濃度的抗壞血酸作為陽性對照。

2.4.3 羥自由基清除率[13]

取5支10 mL試管，分別加入0.4，0.8，2.0，4.0，8.0 mg/mL不同濃度的肉桂揮發油溶液，再依次向各試管中加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液、2 mL 6 mmol/L的H2O2溶液，搖勻后，室溫靜置10 min。再向各試管中加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，搖勻，置于50 ℃恒溫水浴30 min，于510 nm波長下測定其吸光度，每個樣品測3個平行樣，取平均值。以與藥液同樣濃度的抗壞血酸作為陽性對照，并以抗壞血酸濃度和自由基清除率做標準曲線。樣品結果以每克樣品中所含抗壞血酸當量來表示。

羥自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

式中：A0為95%乙醇溶液的吸光度；A1為抗壞血酸溶液或樣品溶液的吸光度；A2為用95%乙醇代替水楊酸時樣品溶液的吸光度。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 料液比的確定

不同比例的料液比對肉桂揮發油提取率的影響見圖1。

圖1 不同料液比對肉桂揮發油提取率的影響Fig.1 Effect of different ratios of solid to liquid onthe extraction rate of volatile oil from cinnamon

由圖1可知，料液比從1∶8到1∶14，揮發油提取率呈現先上升后下降的趨勢，且當料液比為1∶12時，揮發油的得率最大。因此，選擇料液比1∶10、1∶12、1∶14 3個水平進行正交試驗。

3.1.2 粉碎粒度的確定

不同粉碎粒度對肉桂揮發油提取率的影響見圖2。

圖2 不同粉碎粒度對肉桂揮發油提取率的影響Fig.2 Effect of different crushing particle size on the extraction rate of volatile oil from cinnamon

由圖2可知，在20，50，60，100目條件下，當粉碎粒度為50目時，揮發油得率最大。因此，選擇20，50，60目3個水平進行正交試驗。

3.1.3 浸泡時間的確定

揮發油提取過程中，浸泡與否及浸泡時間長短會影響揮發油的得率。不同浸泡時間對肉桂揮發油提取率的影響見圖3。

圖3 不同浸泡時間對肉桂揮發油提取率的影響Fig.3 Effect of different soaking time on the extraction rate of volatile oil from cinnamon

由圖3可知，在浸泡時間分別為0，1，2，3 h時，揮發油提取率呈先平穩后上升再下降的趨勢，且在浸泡時間為2 h時，揮發油得率最大。因此，選擇1，2，3 h 3個水平進行正交試驗。

3.1.4 蒸餾時間的確定

不同蒸餾時間對肉桂揮發油提取率的影響見圖4。

圖4 不同蒸餾時間對肉桂揮發油提取率的影響Fig.4 Effect of different distillation time on the extraction rate of volatile oil from cinnamon

由圖4可知，當蒸餾時間為3，4，5，6 h時，肉桂揮發油提取率呈上升趨勢，當蒸餾時間在5 h后，提取率變化不大，當蒸餾時間為6 h時，揮發油得率最大。因此，選擇4，5，6 h 3個水平進行正交試驗。

3.2 正交試驗設計及結果

肉桂揮發油提取工藝因素水平見表1。

表1 肉桂揮發油提取工藝因素水平Table 1 Factors and levels of extraction process of volatile oil from cinnamon

表2 肉桂揮發油提取正交試驗設計與結果分析Table 2 Orthogonal test design and results analysis of volatile oil extracted from cinnamon

以揮發油得率為指標，由表2可知，在肉桂揮發油提取過程中，各因素對揮發油得率的影響大小依次是B>A>D>C，即料液比>蒸餾時間>粉粹粒度>浸泡時間。正交試驗結果表明，肉桂揮發油提取的最佳工藝條件是A3B2C1D3，即蒸餾時間為6 h，料液比為1∶12，浸泡時間為1 h，粉碎粒度為60目時結果最優。結合試驗中的揮發油提取率結果，證實了在該組合條件下，揮發油得率為4.3734%，優于其他試驗組合。

3.3 體外抗氧化活性測定結果

3.3.1 清除DPPH自由基和羥自由基的能力

通過測定肉桂揮發油對DPPH自由基和羥自由基的清除率，評價其體外抗氧化活性。研究結果表明，肉桂揮發油具有較好的體外抗氧化活性(見表3)。肉桂揮發油的抗氧化能力以Vc當量來表示，在0.4,0.8,2.0,4.0,8.0 mg/mL濃度下，肉桂揮發油對DPPH自由基清除率(DPPH法)用Vc當量分別為11.4,20.9,78.9,102.3,143.2 mg/g；對羥自由基清除率用Vc當量分別為715.0,396.9,363.9,443.8,485.7 mg/g。

表3 肉桂揮發油清除自由基能力Table 3 Free radical scavenging capacity of cinnamon volatile oil

3.3.2 總還原力的測定

總還原能力的測定是利用樣品的抗氧化性，將赤血鹽還原后，再與Fe3+作用，生成普魯士藍，以普魯士藍的生成量來表示樣品的還原能力，并以吸光度值來表示，吸光度值越高，說明樣品的還原能力越強[14]。

圖5 肉桂揮發油與抗壞血酸總還原能力的比較Fig.5 Comparison of total reduction capacity ofcinnamon volatile oil and ascorbic acid

由圖5可知，肉桂揮發油的還原能力與濃度呈正相關關系，濃度越高，還原能力越強。以抗壞血酸為陽性對照，以此來評價肉桂揮發油的總還原能力。

4 結論

通過單因素試驗和正交試驗優化水蒸氣蒸餾法提取肉桂揮發油的提取工藝，最佳提取條件為：蒸餾時間為6 h，料液比為1∶12，浸泡時間為1 h，粉碎粒度為60目。在此條件下提取肉桂揮發油，出油率為4.3734%。并采用3種體外抗氧化活性檢測方法(DPPH法、羥自由基清除率、總還原能力測定)評價肉桂揮發油的抗氧化活性，結果表明：肉桂揮發油具有一定的抗氧化性，且其濃度與抗氧化活性基本呈現正相關性。本研究通過優化肉桂揮發油的提取工藝，為肉桂揮發油的加工生產和科學合理利用提供一定的理論基礎。同時，肉桂不管是作為常用中藥還是日常調味品，都在人們的生活中占據重要地位。通過研究肉桂揮發油的體外抗氧化活性對于深入探究其藥用價值具有重要的科學意義。