紅曲霉色素及代謝物研究進展

林鳳，李慧敏，王玉梅，毛瑞豐

(廣西大學 輕工與食品工程學院，南寧 530004)

紅曲霉屬于子囊菌，能產生耐熱的子囊孢子，且紅曲霉能在缺氧、高酸和高鹽濃度下生存[1]。紅曲霉可用于釀酒(黃酒、果酒和藥酒)、制作發酵食品(腐乳、醬菜)、食品著色及保健品等。紅曲產品在亞洲地區廣為流傳，常見的為由大米發酵制成的紅曲米，簡稱紅曲，其被當做功能性食品已有數千年歷史[2]。紅曲最初被記載于《飲膳正要》，別名為赤曲、丹曲、紅米、福曲、紅大米、紅槽等。《本草綱目》中對其評價為“此乃人窺造化之巧者也”，“奇藥也”。此外，在《本草衍義補遺》、《醫林纂要》等中藥典籍中也均對紅曲有記載。

為研究紅曲米中真菌多樣性，采用以宏基因高通量測序技術為導向的真菌鑒定和檢測方法對廣西不同地區的紅曲米進行檢測，探究紅曲米中真菌的群落種類、數量，獲取其多樣性信息。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

紅曲米：采集于廣西大瑤山不同地區。

1.2 試劑和儀器

E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒：OMEGA公司；Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒：Life公司；2×Taq Master Mix：Vazyme公司；MagicPure Size Selection DNA Beads：TransGen公司。

臺式離心機 Thermo Fisher公司；漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；混勻型干式恒溫器 深圳拓能達科技有限公司；電泳儀電源、電泳槽 北京市六一儀器廠；凝膠成像系統 美國UVP公司；Qubit?3.0熒光計 Invitrogen公司；PCR儀 BIO-RAD公司；移液器 Eppendorf公司。

1.3 方法

高通量測序委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行。

2 結果

根據研究發現3個樣品中JJH和LZ的真菌種類具有較高的相似性，而LB紅曲米中真菌種類與另外2種有差異，且在3個樣品中，真菌存在的比例也不相同(見圖1)，豐度最大的為紅曲霉。

圖1 廣西不同地區紅曲米樣品真菌聚類樹及真菌豐度柱狀圖Fig.1 Fungal dendrogram and abundance histogram of Monascus samples from different regions of Guangxi

對3個紅曲樣品中檢測出的真菌進行分類，發現其中真菌主要是紅曲屬、酵母屬、曲霉屬、節擔菌屬、枝孢屬等。在39種真菌中，紫紅曲霉、Diutinamesorugosa、克魯伊假絲酵母、產膜畢赤酵母、Sordariomycetessp.在3個樣品中均存在，見表1和表2。

表1 3個樣品中檢出的真菌Table 1 Fungi detected from the three samples

表2 廣西不同地區紅曲米樣品中所含的真菌種類Table 2 Fungi species contained in Monascus samples from different regions of Guangxi

續 表

3 紅曲霉綜述

紅曲霉發酵的過程中，產生色素、莫納可林、γ-氨基丁酸(GABA)等次生代謝物，這些次生代謝物可用于食品著色劑、制作降膽固醇和降壓藥物，可見紅曲具有很高的經濟價值。近幾年，對紅曲霉的研究主要集中在優良菌株的篩選及培養條件的優化。

3.1 紅曲霉色素

食品加工通常會導致食品色澤的變化，因此往往需要色素來改善其不良色澤，但目前對合成色素的研究表明其具有潛在的致癌物和致突變性，且可能導致某些兒童疾病[3]。因此，天然色素的生產就顯得尤為重要。

紅曲霉色素(Monascuspigments，MP)是紅曲霉發酵的次生代謝產物。紅曲霉能合成31種顏色，其中最為主要的是紅色素、橙色素和黃色素，它們是苯并呋喃類混合物。目前紅色素中能明確結構式的為紅斑胺素、紅曲紅胺素；橙色為紅斑紅曲素和紅曲紅素；黃色為紅曲素和安卡紅曲黃素[4]。

3.1.1 色素產量的影響因素

據報道[5]，紅曲霉色素的產量及質量受環境pH值、碳源、氮源、溫度等發酵條件的影響，此外，由于色素多存在于細胞內且色素多具有疏水性，因此色素總產量受細胞反饋抑制影響較大[6]。Chen Gong等[7]研究表明，細胞外色素的產量與菌絲形態及細胞內顆粒狀包裹體累積有關，菌絲體較短，能產生較多的紅曲霉色素[8]。

3.1.2 紅曲霉色素的提取

非離子表面活性劑提取發酵是生產紅曲霉色素的潛在方法[9]。該方法通過分階段分批補料方式，增加紅曲霉色素的產量。第一階段收集發酵的全細胞，第二階段將全細胞作為生物催化劑來提取發酵生產色素。該過程利用的是非離子表面活性劑與極性弱的離子溶質形成混合膠束的特點。雖然該方法深層機制仍需進一步研究，但其可實現細胞密度高和顏料滴度高的優點[10]。

3.1.3 色素合成的基因

Balakrishnan B等[11]的研究發現，紅曲霉色素合成的關鍵基因是mppR1和MpPKS5基因簇。且有研究表明[12]，還原酶基因mppE能控制聚酮化合物途徑中橙色素向黃色素的轉變。即還原酶基因mppE控制黃色素的產生，當其表達過度時，促進黃色素的產生，當使其定向失活時，橙色素和紅色素產量增加。此外，另一項研究[13]發現在mppE基因失活的菌株中，橙色素產量明顯下降，而黃色素產量沒有明顯改變，這表明黃色素的產生可能存在其他途徑。

3.2 紅曲霉代謝物的生物活性

紅曲制品對控制血膽固醇，降血壓，控制肥胖和預防癌癥的作用目前研究頗多。此外，有研究表明[14]，紅曲對骨密度和骨強度有增強作用。

莫納可林是降血脂的經濟、有效的藥物，可由紅曲霉、土曲霉經由固態發酵(SSF)和深層發酵(SMF)等方式產生[15]。3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶是膽固醇合成的關鍵限速酶，莫納可林因其與底物結構類似而對其產生競爭性抑制，因此作為治療高膽固醇血癥的常用藥物，且能夠降低低密度脂蛋白膽固醇含量[16]。

γ-氨基丁酸(GABA)是一種四碳的非蛋白質的氨基酸，它是哺乳動物神經系統主要的抑制性的神經遞質，參與腦循環生理活動。其具有降血壓、鎮靜安神等功能[17]。

3.3 紅曲霉發酵產生的桔霉素

桔霉素[(3R，4S)-4,6-二氫-8-羥基-3,4,5-三甲基-6-氧代-3H-2-苯并吡喃-7-羧酸]，其分子結構見圖2，是一種聚酮化合物霉菌毒素。在紅曲霉發酵產生色素的過程中，會伴隨產生桔霉素[18]。桔霉素熔點為175～178.5 ℃，難溶于冷水，微溶于熱水，可溶于氫氧化鈉、碳酸鈉、乙酸鈉及極性有機溶劑。pH 4.6時為檸檬黃針狀的固體，pH 9.9時為櫻桃紅色[19]。其產量主要受紅曲霉菌絲形態和呼吸速率的影響[20]。

圖2 桔霉素分子結構Fig.2 The molecular structure of citrinin

現有研究表明，桔霉素對人等哺乳動物的腎臟和肝臟有毒害作用，此外，其還具有生殖毒性、免疫毒性、致癌性且能夠導致細胞凋亡[21]。但目前，對其毒性作用機理仍不明確。除其毒害作用外，也有證據表明[22]不同濃度的桔霉素對一些菌，如金黃色葡萄球菌、志賀氏痢疾桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌等有抑制作用。

3.4 桔霉素的風險控制

在工藝生產過程中，通過發酵工藝優化使食品中桔霉素的含量降低到一定范圍內，從而提高食品的安全。李玲等[23]研究表明利用微生物混合發酵法能夠從根本上防治桔霉素的產生。此外，在發酵過程中，添加少量脂肪酸和甲基酮不僅對色素的產量不產生影響而且可阻抑桔霉素的產生。陳慎等[24]則發現，高產桔霉素菌株用大米粉作碳源，能達到色素含量高且能控制桔霉素產量的目的，對于低產桔霉素的菌株，選擇麥芽糖作為碳源且用硫酸銨作為氮源，可達到高色素低桔霉素的目的。此外，還可通過基因工程技術敲除合成桔霉素關鍵基因pksCT[25]來構建不產桔霉素且高產紅曲色素的菌株。

4 討論

我國主要生產和出口經濟價值低的紅曲色素，而日本等國家卻主要開發經濟價值高的紅曲保健食品，因此，我國紅曲制品仍具有極大潛力。通過對紅曲米樣品中微生物多樣性分析得出不同微生物的豐度，來探索不同菌株在紅曲制品中的存在情況，為后續研究紅曲制品發酵機理提供了參考依據。目前，雖然對于紅曲霉色素生產代謝已在分子生物學水平上進行了研究[26]，但利用分子生物學技術對紅曲霉代謝機理的研究仍有空白。此外，探尋紅曲米中桔霉素的快速檢測也是重要的研究方向。而對于紅曲霉產桔霉素的研究多局限于限制或阻止其產生，且主要研究其毒理作用。雖然桔霉素分子結構中具有活性OH基團[27]，但目前有關桔霉素生物活性及作用機制的研究仍處于模糊階段。因此，需要更多的研究來闡明紅曲霉代謝產物的生產和作用機制及其潛在的有益或有害作用。